抗生素與細(xì)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)王宏偉南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一節(jié)、抗生素的基礎(chǔ)知識(shí)化學(xué)治療與抗生素化療:對(duì)病原微生物、寄生蟲及癌細(xì)胞所致疾病的藥物治療?；熕幬锊≡⑸铮?xì)菌、螺旋體、衣原體、支原體、立克次體、真菌、病毒等）寄生蟲惡性腫瘤細(xì)胞抗腫瘤藥抗寄生蟲藥抗微生物藥抗菌藥

抗菌藥（antibacterialdrugs）對(duì)細(xì)菌有抑制和殺滅作用的藥物，抗生素和人工合成藥物（磺胺類和喹諾酮類等）化學(xué)合成類：磺胺、新諾明、氟喹諾酮類

抗生素（antibiotics）由各種微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）產(chǎn)生，能殺滅或抑制其它微生物的物質(zhì)?？股胤譃樘烊坏暮腿斯ぐ牒铣傻模罢哂晌⑸锂a(chǎn)生，后者是對(duì)天然抗生素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造獲得的半合成產(chǎn)品。抗生素抗生素的分類β內(nèi)酰胺類大環(huán)內(nèi)酯類氨基糖苷類四環(huán)素類氯霉素類其他青霉素族頭孢菌素碳青霉烯類酶抑制劑細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素：多粘菌素、桿菌肽；真菌產(chǎn)生的抗生素：青霉素、頭孢；放線菌產(chǎn)生的抗生素：鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素、紅霉素、兩性霉素等；抗生素的分類抗菌藥的作用機(jī)制1.抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成2.影響胞膜的通透性3.抑制蛋白合成4.影響葉酸代謝及核酸合成1.抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成N-乙酰胞壁酸胞漿胞漿膜胞漿膜外環(huán)絲氨酸N-乙酰胞壁酸五肽N-乙酰胞壁酸五肽N-乙酰葡萄糖胺雙糖五肽雙糖十肽雙糖十肽交叉聯(lián)接+磷霉素萬(wàn)古霉素β-內(nèi)酰胺類××××2.影響胞漿膜（細(xì)胞膜）的通透性多烯類:真菌胞漿膜中的麥角固醇結(jié)合；多粘菌素:細(xì)菌胞漿膜中的磷脂結(jié)合；3.抑制蛋白質(zhì)合成細(xì)菌核糖體為70s，由30s和50s亞基組成；哺乳動(dòng)物細(xì)胞核糖體為80s,由40s和60s亞基組成1.影響全過(guò)程：氨基糖苷類始動(dòng)復(fù)合物、終止子30SA位2.與30S亞基結(jié)合四環(huán)素類氨酰基tRNA3.與50S亞基結(jié)合氯霉素、林可霉素、大環(huán)內(nèi)酯類4.抑制核酸的復(fù)制（抗葉酸代謝）磺胺類二氫葉酸合成酶二氫葉酸四氫葉酸合成蛋白質(zhì)二氫葉酸還原酶甲氧芐啶PABA喹諾酮類：DNA回旋酶利福平：與RNA多聚酶結(jié)合，阻礙mRNA合成氯霉素、林可霉素：核糖體肽?；D(zhuǎn)移酶4.抑制核酸的復(fù)制抑制細(xì)胞壁合成（青霉素、頭孢菌素）蛋白質(zhì)影響蛋白質(zhì)合成（氨基苷類、四環(huán)素類、氯霉素、紅霉素）影響RNA合成（利福霉素類）影響葉酸合成（磺胺類）影響胞漿膜通透性（多粘菌素、制霉菌素、兩性霉素B）中介體抑制DNA合成（喹諾酮類）耐藥性抗菌作用致病作用機(jī)體抗菌藥病原體機(jī)體、抗菌藥與病原體間的相互作用抗病能力體內(nèi)過(guò)程防治作用與不良反應(yīng)—新型抗菌藥的研發(fā)遠(yuǎn)不及耐藥產(chǎn)生的速度10:2細(xì)菌的耐藥性耐藥性的種類固有耐藥（intrinsicresistance）：固有耐藥性又稱天然耐藥性，是由細(xì)菌染色體基因決定，代代相傳，不會(huì)改變的，如鏈球菌對(duì)氨基苷類抗生素天然耐藥；綠膿桿菌對(duì)氨芐西林；厭氧菌對(duì)氨基糖苷類

獲得性耐藥（acquiredresistance）：獲得性耐藥是由于細(xì)菌與抗生素接觸后，由質(zhì)粒介導(dǎo)，通過(guò)改變自身的代謝途徑，使其不被抗生素殺滅。如金黃色葡萄球菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶而對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制降低外膜通透性革蘭陰性菌膜孔蛋白數(shù)量、孔徑減小產(chǎn)生滅活酶-內(nèi)酰胺酶氨基糖苷類鈍化酶氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶改變靶位的結(jié)構(gòu)

1.改變靶蛋白，降低與抗菌藥的親和力

2.增加靶蛋白的數(shù)量，維持微生物正常形態(tài)與功能

3.新合成功能正常、與抗菌藥親和力低的靶蛋白加強(qiáng)藥物外排作用 四環(huán)素類、氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素、-內(nèi)酰胺類改變代謝途徑耐藥方式病原菌抗菌藥物滅活酶改變靶位結(jié)構(gòu)胞漿膜通透性代謝途徑鏈霉素利福霉素類青霉素G氨基糖苷類四環(huán)素類某些廣譜青霉素類及頭孢類磺胺類-內(nèi)酰胺酶氨基糖苷類鈍化酶氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶第二節(jié)、細(xì)菌的抗生素藥感試驗(yàn)22敏感和耐藥的概念

從本質(zhì)上講：細(xì)菌對(duì)某種抗菌藥物是敏感還是耐藥，常以該抗菌藥物的治療濃度與MIC的關(guān)系而定。常用劑量的抗菌藥物通過(guò)常用途徑所能達(dá)到的血藥濃度Minimalinhibitoryconcentration(MIC)Referencemethod.Addstandardinoculumtodilutionsofantibiotic.Incubateovernight.MICislowestconcentrationthatinhibitsgrowth(canalsobeperformedbyagardilution).Interpretation(SorR)isbasedonachievabledruglevels24

抗菌藥物的治療濃度與MIC的關(guān)系：若MIC小于治療濃度，則為“敏感”（Sensitive,S），推薦使用。若MIC大于治療濃度，則為“耐藥”（Resistant,R）；若MIC介于治療濃度的上下限之間，則為“中度耐藥”（Intermediate,I）或中度敏感敏感和耐藥的概念

25敏感治療濃度的上限

即表中的

R治療濃度的下限

即表中的S耐藥治療濃度CLSI標(biāo)準(zhǔn)MIC26稀釋法

?肉湯稀釋法（試管稀釋法）

?瓊脂稀釋法（平板稀釋法）紙片擴(kuò)散法（紙片法）E-試驗(yàn)聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)需氧和兼性厭氧菌藥敏試驗(yàn)的方法

藥敏試驗(yàn)MIC：在與微生物生長(zhǎng)速率有關(guān)的特定時(shí)間間隔內(nèi)，通常是18－24小時(shí)，能夠抑制被測(cè)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度。對(duì)倍稀釋的優(yōu)點(diǎn)：操作容易敏感株的MIC呈正態(tài)分布區(qū)分異常(R)與敏感(S)的菌群MIC的分布291、稀釋法的特點(diǎn)定量的藥敏試驗(yàn)，測(cè)定MIC、MBC。方法比較繁瑣，手工操作一般不作為常規(guī)試驗(yàn)，常用于調(diào)查罕見耐藥。自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)采用微量稀釋法檢測(cè)MIC。藥敏試驗(yàn)方法1－LB肉湯稀釋法4 8 16 32 64128256ug/ml混

混清抗生素倍比稀釋，種菌105CFU/ml，孵育35℃，16-20h，判讀細(xì)菌藥敏試驗(yàn)-宏量稀釋法104cfu420mg/ml微量液體稀釋法332、紙片擴(kuò)散法（discdiffusiontest)

（Kirby-Bauer法）

原理：將浸有抗菌藥物的紙片貼在涂有測(cè)試菌的瓊脂平板上。抗菌藥物向瓊脂四周擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度。藥物敏感細(xì)菌在紙片周圍一定距離內(nèi)的生長(zhǎng)受到抑制，形成抑菌圈。抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)藥物的敏感程度。二者呈正相關(guān)。34抑菌圈邊緣的藥物濃度與MIC35

抑菌圈的大小與MIC：二者呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC愈小。36紙片法藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑與結(jié)果解釋的標(biāo)準(zhǔn)抗菌藥物與細(xì)菌紙片含量

抑菌圈直徑：mm相應(yīng)MICμg/ml

耐藥中介度敏感耐藥敏感丁胺卡那霉素30μg≤1415-16≥17≥32≤16氨芐青霉素

測(cè)腸桿菌10μg≤1112-13≥14≥32≤8

測(cè)葡萄球菌10μg≤28—≥29

測(cè)嗜血桿菌10μg≤19—≥20≥4≤0.25

測(cè)腸球菌10μg≤16—≥16≤237操作方法：1.制備M-H瓊脂平板，厚度4mm。2.制備0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫鹊木海ㄅ囵B(yǎng)16～24h，4~5個(gè)菌落）。3.菌液均勻涂布于平板。（15分鐘接種完畢）4.無(wú)菌貼標(biāo)準(zhǔn)抗生素紙片于M-H瓊脂表面，5.經(jīng)過(guò)35℃16～24h孵育。6.量取抑菌環(huán)直徑，根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)告細(xì)菌對(duì)該抗生素敏感、耐藥、中介。38操作方法：1.將在約56℃恒溫的無(wú)菌M-H瓊脂傾注直徑為90mm

的平板，其厚度

4mm。392.無(wú)菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5個(gè)菌落。403.將菌置于無(wú)菌生理鹽水中，校正其濁度于0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫鹊木骸?.5×108CFU/ml414.用無(wú)菌棉簽浸入細(xì)菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過(guò)多的菌液。棉簽在三個(gè)方向均勻抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60℃）使菌液均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。425.蓋上平板的蓋子，放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，放置3~10分鐘后貼上標(biāo)準(zhǔn)抗生素紙片。436.用無(wú)菌鑷子或紙片分配器將抗菌紙片粘貼于M-H瓊脂的表面，一旦紙片貼上，不能移動(dòng)；各抗菌紙片中心距離應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm