精品精品可編輯可編輯呋喃唑酮代謝物（AOZ）ELISA檢測試劑盒說明書一、概要用來檢測呋喃唑酮代謝物的最常用方法是和LC-MS/MSAOZ（本試劑盒的檢測時(shí)間為1.5）二、試驗(yàn)原理本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留的AOZTMBAOZ三、適用范圍可定性、定量檢測動(dòng)物組織（雞、豬、牛等的殘留量。四、交叉反應(yīng)率呋喃唑酮代謝物……100%呋喃它酮代謝物… 小于0.1%呋喃妥因代謝物… 小于0.1%硝基糠腙（呋喃西林）代謝物… 小0.1%呋喃唑酮… 16.3%呋喃它酮… 小1%呋喃妥因… 小1%硝基糠腙（呋喃西林）… 小1%五、使用單位需自備的設(shè)備及試劑設(shè)備：450nm/630nm/氮?dú)獯蹈裳b置┅┅均質(zhì)器┅┅振蕩器┅┅渦旋儀┅┅離心機(jī)┅┅天平：感量0.01g┅┅刻度移液管：10ml┅┅洗耳球┅┅容量瓶：100ml、1L┅┅玻璃試管：10ml┅┅聚苯乙烯離心管：2ml、10ml、50ml┅┅微量移液器：單道20ml～200ml、100ml～1000ml多道250ml試劑：┅┅乙酸乙酯（分析純）┅┅正己烷（或正庚烷（分析純）┅┅三水合磷酸氫二鉀（分析純）┅┅濃鹽酸┅┅氫氧化鈉（分析純）┅┅二水合?硝基鐵氰化鈉Na2Fe(CN)N2H2（分析純（供奶、雞蛋樣用）┅┅七水合硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)(分析純)（供奶、雞蛋樣用）┅┅去離子水六、提供的材料與試劑1、96孔酶標(biāo)板×1塊（包被有偶聯(lián)抗原）26（1ml瓶）0ppb,0.05ppb,0.15ppb,0.45ppb,1.35ppb,4.05ppb （1ml/瓶100ppb4、酶標(biāo)二抗?jié)饪s液 1.5ml 紅色帽5、抗體濃縮液 0.8ml 綠色帽6、底物液A液 7ml 白色帽7、底物液B液 7ml 紅色帽8、終止液 7ml 黃色帽9、20×濃縮洗滌液 40ml 透明帽10、2×濃縮復(fù)溶液 50ml 藍(lán)色帽11、2-硝基苯甲醛 15.1mg 黑色帽七、溶液的配制配液1:衍生化試劑2-10m（10m配液2:0.1M22.8g1L3:C液（供奶樣、雞蛋用：0.36M亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）溶液稱取10.7g亞硝基鐵氰化鈉加去離子水溶解定容至D液（供奶樣、雞蛋用：1M硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）溶液稱取28.8g硫酸鋅用去離子水溶解定容至100ml配液4:1M鹽酸溶液量取8.3ml濃鹽酸加入到盛有去離子水的容器中定容至100ml。配液5:1M氫氧化鈉溶液稱取4.0g氫氧化鈉加去離子水溶解定容至100ml。配液6:復(fù)溶工作液21：1體積比進(jìn)行稀釋份2×1份去離子水）4個(gè)月。配液7:洗滌液工作液用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進(jìn)行稀釋（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進(jìn)行稀釋（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。八、樣本前處理步驟樣本處理前須知處理任何樣本時(shí)，都必須注意：實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。驗(yàn)結(jié)果。2-8℃保存半年。2-8℃保存三個(gè)月鹽酸溶液可于室溫保存三個(gè)月氫氧化鈉溶液可于室溫保存三個(gè)月未處理的樣本冷凍保存。2-824小時(shí)。1-2鐘，它直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。（一）肌肉、肝臟組織前處理方法┅┅用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；注：樣本應(yīng)當(dāng)在陰涼避光處冷藏保存（二）牛奶前處理方法┅┅取牛奶樣本，3000g以上，10℃離心10min，吸除上層脂肪；┅┅取5ml去除脂肪牛奶樣本至10ml聚苯乙烯離心管中；250mlC250mlD液（3；以上，4~12oC（39-54℉）10min8o4℉，然后離心；（三）蜂蜜前處理方法┅┅稱取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中；┅┅用4ml去離子水，用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；0.5ml1M鹽酸溶液（）100ml衍生化試劑（1蕩；（*處。（四）接上面的方法1.0±0.05g均質(zhì)后的組織樣本（肉樣1ml的奶樣4ml0.5ml1M鹽酸溶液（4）100ml化試劑（12mi；*┅┅37oC過夜孵育（16；5ml0.1M磷酸氫二鉀溶液（20.4ml1M氫氧化鈉溶液（和5ml30s；┅┅3000g以上，室溫（20-25oC/68-77℉）離心10min；┅┅取2.5ml乙酸乙酯相至10ml干燥的玻璃試管中，于50～60℃氮?dú)饬飨麓蹈桑?ml正己烷（或正庚烷301ml復(fù)溶工作液（6，用渦旋儀渦動(dòng)1min充分混勻；用渦旋儀渦動(dòng)1min充分混勻；┅┅3000g以上，室溫（20-25oC/68-77℉）離心10min；┅┅除去上層有機(jī)相，取下層水相50μl用于分析。（五）雞蛋前處理方法┅┅用均質(zhì)器低速均質(zhì)樣本(蛋黃或全蛋)；2.0±0.05g10ml4ml去離子水、0.5ml1M鹽酸溶液（4、200μlC液（31min混勻；┅┅加入200μlD（35mi3000g20-25oC/68-77℉）離心10min；15ml200μl（50℃2h（1-分鐘；5ml0.1M磷酸氫二鉀溶液（20.4ml1M氫氧化鈉溶液（5）5mloC/68-77℉）┅┅取2.5ml上層有機(jī)相，于50～60℃氮?dú)饬飨麓蹈桑?ml正己烷（或正庚烷302ml復(fù)溶工作液（6，1min（60℃5mi，再重復(fù)離心┅┅除去上層有機(jī)相，取下層水相50μl用于分析。九、檢測步驟1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫20-2℃。2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。操作步驟：1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。42和樣本孔所在的位置。51：10體積比進(jìn)行稀釋10份復(fù)溶工作液。6、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50ml到對應(yīng)的微孔中，然后加入抗體工作液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。7、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液（孔，充分洗滌4－5（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破81：10體積比進(jìn)行稀釋10份復(fù)溶工作液。9、加酶標(biāo)二抗：加入酶標(biāo)二抗100ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min，取出重復(fù)洗板步驟7。10、顯色：加入底物液A10、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋25℃15mi（8。11、測定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)，測定每孔OD十、結(jié)果判定2呋喃唑酮代謝物的含量成負(fù)相關(guān)。1(ppb1的吸光度值為0.31020.820為2.104；0.05ppb為0.522；1.35ppb0.1291的濃度范圍是0.45ppb-1.35ppb再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中呋喃唑酮代謝物殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是0.15ppb-0.45ppb再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中呋喃唑酮代謝物殘留的濃度范圍。2、定量分析平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)）100%，即百分吸光度值B＝ B0

×100%B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)品濃度的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃唑酮代謝物的實(shí)際濃度。（歡迎來電索取樣本稀釋倍數(shù)肌肉、肝臟組織樣品稀釋倍數(shù)：2奶樣樣品稀釋倍數(shù)：2試劑盒靈敏度：0.05ppb樣本最低檢測限：組織、蜂蜜 0.1ppb雞蛋、奶樣… 0.1ppb準(zhǔn)確度：肌肉、肝臟組織 75±15%蜂蜜 90±15%雞蛋 90±20%奶樣… 90±10%精密度：試劑盒的變異系數(shù)均小于10%十二、注意事項(xiàng)1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。3、每加一種試劑前需要將其搖勻。4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。6、儲存條件保存試劑盒于2-8℃，不要冷凍，將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。7、試劑變質(zhì)的跡象發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，