豬高致病性藍(lán)耳病免疫效果評估

河北省動物疫病預(yù)防控制中心

2011年3月29日

主要內(nèi)容藍(lán)耳病簡介藍(lán)耳病目前流行情況疫苗應(yīng)用情況疫苗免疫策略及免疫評估ELISA實驗介紹藍(lán)耳病

是由PRRSV引起的，以母豬繁殖障礙、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及仔豬呼吸綜合征為特征的高度接觸性傳染病。高致病性藍(lán)耳病

是由PRRSV變異株引起高度接觸性、出血性、致死性傳染病。特征是仔豬發(fā)病率可達(dá)100%、死亡率可達(dá)50%以上，母豬流產(chǎn)率可達(dá)30%以上。2008年新修訂的《一、二、三類動物疫病病種名錄》將其列為一類動物疫病。藍(lán)耳?。≒RRS）簡介病原

PRRSV動脈炎病毒科動脈炎病毒屬RNA病毒

圖1.PRRSV病毒粒子結(jié)構(gòu)示意圖（結(jié)構(gòu)蛋白）（引自Theroleofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)virusstructuralandnon-structuralproteinsinviruspathogenesis.AnimHealthResRev,2010:p.1-29）主要蛋白的作用結(jié)構(gòu)蛋白

N蛋白是堿性磷酸蛋白；免疫原性最強(qiáng)，抗原域高度保守，感染PRRSV后N蛋白最早出現(xiàn)體液免疫應(yīng)答，約為1周左右。但N蛋白抗體無中和作用。M蛋白是非糖基化蛋白；為跨膜蛋白，抗原域高度保守。也是感染PRRSV后出現(xiàn)免疫應(yīng)答的主要抗原。gp5蛋白為囊膜糖蛋白，是PRRSV變異最大的結(jié)構(gòu)蛋白之一。是病毒主要的免疫原性蛋白，具有病毒中和作用和機(jī)體保護(hù)作用。主要蛋白的作用非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp1α、Nsp1β、Nsp2~Nsp8、Nsp9~Nsp12。高致病性PRRSV（如JXA1株）在Nsp2區(qū)存在特異的30多個氨基酸缺失。因此可作為PRRSV變異的獨(dú)特標(biāo)記。藍(lán)耳病病毒分型

A.美洲型（NA-PRRSV）

1992年美國分離VR2332株

1996年北京分離BJ-4株和Ch-1a株

1997年美國分離JA-142株

2001年美國分離MN184B株

2006年江西分離NVDC-JXA1株B.歐洲型(EU-PEESV)1991年荷蘭分離LV株2006年北京分離BJEU06-12006年立陶宛分離Eigir株2007年白俄羅斯分離Lena株致病機(jī)理PRRSV豬巨噬細(xì)胞中復(fù)制淋巴器官及肺臟腎臟、腦（JXA1）感染24h后，血液中病毒滴度迅速增加，造成病毒血癥。7-14天在血清、淋巴結(jié)和肺臟中病毒滴度達(dá)到最大峰值。病豬主要通過呼吸道和消化道排毒。飛沫、唾液、糞便、血液和乳及精液均能檢測到病毒。其中糞便是高致病性PRRSV的重要排毒途徑之一。藍(lán)耳?。≒RRS）流行現(xiàn)狀全球流行狀況A.原因：引種、動物及其產(chǎn)品國際貿(mào)易、免疫接種。據(jù)OIE疫情統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，PRRSV已蔓延全球大多數(shù)養(yǎng)豬國家。未發(fā)現(xiàn)的地區(qū)有新西蘭及澳大利亞，阿曼和伊朗（不消費(fèi)豬相關(guān)產(chǎn)品）。B.亞型分布情況美洲型分布范圍大于歐洲型，前者主要分布于美洲和亞洲，后者主要集中于歐洲。新型變異株分布范圍小于經(jīng)典亞型。2009年P(guān)RRSV全球分布圖（OIE數(shù)據(jù)）藍(lán)耳?。≒RRS）全球流行現(xiàn)狀高致病性豬藍(lán)耳?。∟A4型）全球分布圖藍(lán)耳?。≒RRS）流行現(xiàn)狀國內(nèi)流行狀況A.起源1995年北京和廣東引種。年末北京及周邊地區(qū)大規(guī)模爆發(fā)PRRS。1996年分離PRRSV。B.流行狀況經(jīng)典PRRSV全國性分布。高致病性PRRSV爆發(fā)流行，除西藏外，其他省份均有分布。歐洲型目前僅發(fā)現(xiàn)于北京和內(nèi)蒙。流行毒株多且毒株變異迅速。國內(nèi)PRRS疫苗使用情況產(chǎn)品名稱毒株名稱生產(chǎn)企業(yè)批準(zhǔn)時間PRRS滅活苗Ch-1a株哈維科2007年P(guān)RRS活苗Ch-1R株哈維科、海利、南農(nóng)高科2008年/2010年P(guān)RRS活苗R98株瑞普2009年高藍(lán)滅活苗NVDC-JXA1株金宇、中牧等19家企業(yè)2007年高藍(lán)活苗JXA1-R株中牧、吉林元亨等9家企業(yè)2009年P(guān)RRS活苗VR-2332株勃林格2009年各國疫苗免疫策略不免疫(瑞典、智利)滅活苗（英國）活苗（美國、中國等）中國的免疫策略：從爭議到趨向統(tǒng)一強(qiáng)制免疫JXA1-R株抗體監(jiān)測免疫熒光實驗（IFA）免疫過氧化物酶單層分析法（IPMA）中和實驗（SN）感染后1~2個月產(chǎn)生。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）免疫膠體金技術(shù)效果有待評估

藍(lán)耳病的抗體監(jiān)測與免疫評估ELISA特點(diǎn)特異性強(qiáng)、敏感性高可進(jìn)行批量樣品的檢測操作簡便、節(jié)省時間結(jié)果客觀準(zhǔn)確安全性高ELISA試劑盒的選用1、以核衣殼蛋白（N蛋白）作為主要包被抗原的PRRSV抗體間接ELISA檢測試劑盒2、以GP蛋白作為包被抗原的PRRSV抗體間接ELISA檢測試劑盒藍(lán)耳病的抗體監(jiān)測與免疫評估檢測GP蛋白抗體？有效！檢測N蛋白抗體？蛋白優(yōu)點(diǎn)不足N毒株間保守性高（80%）活毒接種后抗體在10天出現(xiàn)抗體持續(xù)時間大約在2個月與SN無相關(guān)性抗體不能區(qū)分毒株gP抗體持續(xù)時間在4-5個月與SN(保護(hù)抗體）相關(guān)性高免疫評估最有效的工具毒株間gp蛋白保守性差(50%)活毒接種抗體在13天出現(xiàn)包被不同蛋白試劑盒之間的區(qū)別法國LSI藍(lán)耳病抗體試劑盒特異性研究選擇2組母豬，各18頭，gp抗體、N蛋白抗體與SN的相關(guān)性包被不同蛋白的區(qū)別試劑盒的選擇

N蛋白不能誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒中和抗體，因此以N蛋白作為包被抗原的ELISA試劑盒無法反應(yīng)機(jī)體的免疫狀態(tài)，不適合用于對疫苗免疫效果監(jiān)測。GP蛋白包被的試劑盒與其他檢測中和抗體的方法，如IFA、IPMA有很好的相關(guān)性。適合用于疫苗免疫效果的評估。ELISA基本原理以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。間接法樣品稀釋方式:1/200兩步稀釋：5μL樣品加入到

95μL樣品稀釋液中（在稀釋板中）混勻；取5μL已稀釋好的樣品加入45μL樣品稀釋液中（在包被板中）混勻。3x洗滌1/200稀釋好的血清

50μL孵育60minto37oC孵育60minto37oC3x洗滌孵育10min20-25oCindarkness50μL終止液在450nm50μLTMB底物50μLHRPO抗豬的單克隆抗體

操作步驟:法國LSI藍(lán)耳病抗體試劑盒介紹

試驗有效性和判定:

ODmPC>0.600(ODmPC/ODmNC)>4判定標(biāo)準(zhǔn):IRPC=((ODm450S-ODm450NC)/(ODm450PC-ODm450NC))x100判定IRPC值陰性20陽性>20法國LSI