第六章酶學(xué)1〔研究開展)我國(guó)幾千年前就開始制作發(fā)酵飲料及食品。西方國(guó)家在19世紀(jì)初確定了發(fā)酵的總方程式：葡萄糖〔C6H12O6〕乙醇(CH3CH2OH)+2CO21857年微生物學(xué)家巴斯德〔Pasteur〕等人提出酒精發(fā)酵是酵母細(xì)胞活動(dòng)的結(jié)果。1878年提出了“酶〞這個(gè)名稱。1913年Michaslis和Menten提出了酶促動(dòng)力學(xué)原理—米氏學(xué)說。1926年Sumner第一次從刀豆中提出了脲酶結(jié)晶，并證明此酶具有蛋白質(zhì)的性質(zhì)。第六章酶學(xué)2(總〕第一節(jié)酶與一般催化劑的比較第二節(jié)酶的分類和命名第三節(jié)酶的化學(xué)性質(zhì)第四節(jié)酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、酶專一性第五節(jié)酶的作用機(jī)理第六節(jié)酶促反響的速度及其影響因素第七節(jié)酶的別離提純及活力測(cè)定第八節(jié)酶的應(yīng)用第一節(jié)酶與一般催化劑的比較一、與一般催化劑的共性

二、作為生物催化劑的特性

一、與一般催化劑的共性１．用量少而催化效率高。２．不改變化學(xué)反響的平衡點(diǎn)，僅能改變反響速度。３．可降低反響的活化能?；罨苁侵冈谝欢囟认乱荒柕孜锶窟M(jìn)入活化態(tài)所需要的自由能。二、作為生物催化劑的特性1〔總〕1．催化效率高。2．具有高度的專一性。3．酶易失活。4．活力受調(diào)節(jié)控制。5．活力與輔酶、輔基有關(guān)。二、作為生物催化劑的特性2〔1〕催化效率高：比非催化反響高108－1020倍，比其它催化反響高107－1013倍雙氧水裂解(過氧化氫酶〕1二、作為生物催化劑的特性32．具有高度的專一性：一種酶只能作用于某一類或某一種特定的物質(zhì)。3．酶易失活：凡使蛋白質(zhì)變性的因素〔強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫等〕都能使酶被破壞而完全失活４．活力受調(diào)節(jié)控制：如抑制劑調(diào)節(jié)、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)、反響調(diào)節(jié)、酶原激活及激素等的控制5．活力與輔酶、輔基及金屬離子有關(guān)：有些酶是復(fù)合酶，假設(shè)將其中小分子物質(zhì)〔輔酶、輔基及金屬離子〕除去，酶就失去活性。第二節(jié)酶的分類和命名一、酶的分類1.根據(jù)催化反響類型分2.根據(jù)類別分二、酶的命名1.系統(tǒng)命名2.習(xí)慣命名第二節(jié)酶的分類和命名(分類1)1.根據(jù)催化反響類型分1.氧化復(fù)原酶〔脫氫酶與氧化酶〕(1)脫氫酶A-H2+B〔輔酶〕←→A+B-H2(2)氧化酶B-H2+O2←→BO+H2O2.轉(zhuǎn)移酶A-X＋B←→A＋B-X3.水解酶A-B＋H2O←→AOH＋BH第二節(jié)酶的分類和命名(分類2)1.根據(jù)催化反響類型分4.異構(gòu)酶5.裂解酶A←→B+C6.合成酶A+B+ATP←→C＋ADP(ATP起提供能量活化反響分子的作用)第二節(jié)酶的分類和命名(分類2)2.根據(jù)類別分：類、亞類、亞亞類等每一種酶都有由四個(gè)數(shù)字組成的編號(hào)，前加EC〔酶學(xué)委員會(huì)〕。四個(gè)數(shù)字分別表示：該酶屬于在六大類中的歸屬、在亞類中的歸屬、在亞亞類中的歸屬及該酶在一定亞亞類中的位置，如：乳酸脫氫酶EC1．1．1．27四個(gè)數(shù)字分別表示：第一大類〔氧化復(fù)原酶〕、第一亞類〔氧化-CHOH〕、第一亞亞類〔氫受體為NAD＋、乳酸脫氫酶在此亞亞類中的序號(hào))第二節(jié)酶的分類和命名(命名1)1．系統(tǒng)命名：底物的名稱+反響的類型

如：乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶、ATP：乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶第二節(jié)酶的分類和命名(命名2)2．慣用命名：比較簡(jiǎn)短，使用方便，通常依據(jù)酶所作用的底物及其反響類型來命名。如催化乳酸脫氫變?yōu)楸岬拿附腥樗崦摎涿?；水解蛋白的酶叫蛋白水解酶；從來源上還分為胰蛋白酶，胃蛋白酶等。第三節(jié)酶的化學(xué)性質(zhì)〔總〕一、酶大多是蛋白質(zhì)二、酶的輔因子一、酶是蛋白質(zhì)1．對(duì)熱不穩(wěn)定。2．為兩性電解質(zhì)。3．引起蛋白質(zhì)變性的化學(xué)及物理因素，同樣也能使酶失活。4．具有膠體物質(zhì)的一系列特性。5．受蛋白水解酶作用而喪失活性。6．酶的催化活性與蛋白質(zhì)本性密切聯(lián)系。7．許多酶的氨基酸排列順序已陸續(xù)測(cè)出。酶有以下性質(zhì)與蛋白質(zhì)極為相似二、酶的輔因子輔因子：酶中除蛋白質(zhì)外的非蛋白小分子物質(zhì)。全酶=酶蛋白+輔因子輔因子類型：金屬離子、小分子有機(jī)化合物、有時(shí)這兩者協(xié)同作用。作用：作為電子、原子或某些基團(tuán)的載體參與反響，并促進(jìn)整個(gè)催化過程的進(jìn)行。輔酶：用透析法可除去的小分子有機(jī)物，直接參加催化反響。輔基：用透析法不易除去的小分子物質(zhì)，如金屬離子，它間接參加反響。第四節(jié)酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、專一性一、酶結(jié)構(gòu)與功能二、酶作用的專一性

一、酶結(jié)構(gòu)與功能〔一〕活性部位和必需基因〔二〕酶原的激活〔三〕同功酶〔一〕活性部位和必需基團(tuán)1必需基團(tuán)：酶分子的某些基團(tuán)，經(jīng)化學(xué)修飾改變后，那么酶的活性即會(huì)喪失?；钚灾行模菏侵该阜肿又兄苯雍偷孜锝Y(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位。活性部位活性中心〔一〕活性部位和必需基團(tuán)2(1)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)酶活性部位上的基團(tuán)有兩類結(jié)合基團(tuán)：參與和底物結(jié)合的基團(tuán)〔一〕活性部位和必需基團(tuán)2(2)催化基團(tuán)：直接參與催化反響的基團(tuán)。胰凝乳蛋白酶〔chymotrypsin〕

的活性中心〔一〕活性部位和必需基團(tuán)2(3)

隨肽鏈的盤繞折疊，構(gòu)成酶活性部位的基團(tuán)彼此靠近，形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域?！惨弧郴钚圆课缓捅匦杌鶊F(tuán)3〔總〕1．酶的專一性研究2．酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾3．X－射線晶體衍射法確定酶的活心中心的方法〔總〕1．酶的專一性研究

通過研究酶的專一性底物的結(jié)構(gòu)，判斷和確定活性中心的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。2．酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾1使用一些對(duì)酶分子側(cè)鏈功能基團(tuán)可進(jìn)行共價(jià)修飾的試劑作用于酶，以查出哪些基團(tuán)是保持酶活力所必需的。酶分子中可被修飾的基團(tuán)：硫氫基〔巰基〕、羥基、咪唑基、氨基及羧基等?？捎米骰瘜W(xué)修飾的試劑：用的較多的有DFP〔二異丙基氟磷酸〕。2．酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾2二異丙基氟磷酸〔DFP〕的作用3．X—射線晶體衍射法直接對(duì)酶三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)證明，大多數(shù)酶分子的絕大局部非極性側(cè)鏈聚集成三維結(jié)構(gòu)的“骨架〞，而大局部極性側(cè)鏈那么位于酶分子外表，這樣的結(jié)構(gòu)是有利于進(jìn)行酶的催化反響的。

牛胰蛋白酶〔二〕酶原的激活1酶原的激活：由無活性的酶原變成活性酶的過程。舉例：某些酶特別是一些與消化作用有關(guān)的酶。常見的酶原及其激活劑:(南大P274，表7-5)〔二〕酶原的激活2(胰蛋白酶的激活)纈天天天天賴異纈甘組SS絲SS腸激酶〔激活作用〕纈天天天天賴異甘組SS絲纈SS活性中心胰蛋白酶原胰蛋白酶〔三〕同工酶同工酶：具有不同分子形式，卻催化相同的化學(xué)反響的酶。同工酶具有不同的理化性質(zhì)、免疫學(xué)性質(zhì)。這種差異是由于酶蛋白的編碼基因不同，或者由于mRNA或翻譯產(chǎn)物是經(jīng)過不同加工過程產(chǎn)生的。具有不同分子形式的同工酶之所以能催化相同的化學(xué)反響，是因?yàn)樗鼈兊幕钚圆课辉诮Y(jié)構(gòu)上相同或者至少非常相似。二、酶作用的專一性〔總〕含義：酶對(duì)所有作用的底物有嚴(yán)格的選擇性，一種酶僅能作用于一種物質(zhì)或一類分子結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，這種選擇性作用稱為酶的專一性。

1．結(jié)構(gòu)專一性

2．立體異構(gòu)專一性1．結(jié)構(gòu)專一性各種酶對(duì)底物結(jié)構(gòu)的專一性要求不同：有的酶只對(duì)底物分子中其所作用的鍵要求嚴(yán)格；而另一些酶對(duì)底物的要求更高些。α－葡萄糖苷酶:要求底物必須是D－葡萄糖通過α－糖苷鍵所形成的糖苷，不要求R基團(tuán)。2．立體異構(gòu)專一性幾乎所有酶對(duì)立體異構(gòu)體都具有高度的專一性。酶的立體專一性在實(shí)踐很有意義乳酸脫酶：能催化L－乳酸脫氫變?yōu)楸?，?duì)D-乳酸那么無作用D－乳酸L－乳酸

乳酸脫酶－2H第五節(jié)酶的作用機(jī)理〔總〕一、酶的催化作用與分子活化能

二、與酶的高效率有關(guān)的因素

一、酶的催化作用與分子活化能1能閾:在一個(gè)反響體系中，只有那些含能到達(dá)或超過某一定限度的活化分子才能在碰撞中發(fā)生化學(xué)反響,這一限度即為能閾。使反響到達(dá)一定能閾的途徑有兩條：1．對(duì)反響體系加熱或用光照射。2．使用適當(dāng)?shù)拇呋瘎?，降低反響的能閾，使反響沿著一個(gè)活化能閾較低的途徑進(jìn)行。一、酶的催化作用與分子活化能2其活化能正常為千焦耳。用膠態(tài)鉑作為催化劑時(shí)，活化能降至千焦耳。用過氧化酶催化時(shí)，那么可降低至千焦耳反響速度增加一億倍以上。過氧化氫分解成水和氧的反響：一、酶的催化作用與分子活化能3反響過程中能的變化一、酶的催化作用與分子活化能3反響過程中能的變化二、與酶的高效率有關(guān)因素〔總〕〔一〕底物與酶的靠近及定向〔二〕酶使底物分子中的敏感鍵“變形〞〔三〕共價(jià)催化—中間體學(xué)說〔四〕酸堿催化〔五〕酶活性中心是低介電區(qū)域〔一〕底物與酶的靠近及定向〔1靠進(jìn)〕1．靠近效率：催化基團(tuán)－COO－愈靠近底物酯鍵，那么反響速度愈快，在最靠近的情況下，速度可由開始的1增至53000倍。酯酯水解相對(duì)速度12053000〔一〕底物與酶的靠近及定向〔2定向1〕(1)鎖鑰學(xué)說(2)軌道定向〔一〕底物與酶的靠近及定向〔2定向2〕1890年有些學(xué)者提出的，強(qiáng)調(diào)酶對(duì)它所作用的底物有著嚴(yán)格的選擇性，它只能催化一定結(jié)構(gòu)或一些結(jié)構(gòu)近似的化合物發(fā)生反響。(1)鎖鑰學(xué)說〔一〕底物與酶的靠近及定向〔2定向1〕1958年由Kosnland提出的，該學(xué)說認(rèn)為酶外表并沒有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀;反響后，釋放出產(chǎn)物，酶的構(gòu)象再逆轉(zhuǎn)，回到它們的初始狀態(tài)?！?〕軌道定向假說〔誘導(dǎo)楔合學(xué)說〕〔二〕酶使底物分子中的敏感鍵“變形〞酶使底物中的敏感鍵發(fā)生“變形〞，而易于破裂。酶中的某些基團(tuán)或離子可以使底物分子內(nèi)敏感鍵中的某些基團(tuán)的電子云密度增高或降低，產(chǎn)生“電子張力〞，使敏感鍵的一端更加敏感，更易于發(fā)生反響，此學(xué)說的理論依據(jù)來源于羧肽酶的X—衍射分析結(jié)果。〔三〕共價(jià)催化—中間體學(xué)說1這種方式是底物與酶形成一個(gè)反響活性很高的共價(jià)中間物，它很易變成過渡態(tài)而大大降低反響的活化能。證明此學(xué)說的正確與否可用光譜法，甚至用電子顯微鏡觀察中間產(chǎn)物的存在?！踩彻矁r(jià)催化—中間體學(xué)說1S+E=SE→E+P←〔四〕酸堿催化酶活性部位上的某些基團(tuán)〔如氨基、羥基、硫氫基、咪唑基等〕可作為良好的質(zhì)子供體或受體，對(duì)底物進(jìn)行酸堿催化?！参濉趁富钚灾行氖堑徒殡妳^(qū)域酶的活性中心穴內(nèi)相對(duì)地說是非極性的。因此，酶的催化基團(tuán)被低介電環(huán)境所包圍。在某些情況下，還可能排除高極性的水分子。這樣，底物分子的敏感鍵和酶的催化基團(tuán)之間就會(huì)有很大的反響力，這是有助于加速酶反響的。第六節(jié)酶促反響的速度及其影響因素一、酶反響速度的測(cè)量

二、影響酶促反響速度的因素一、酶反響速度的測(cè)量11．測(cè)量單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量2．測(cè)量單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的生成量一、酶反響速度的測(cè)量2產(chǎn)物的濃度酶反響的速度曲線從圖中可見，開始一段時(shí)間，反響速度幾乎維持恒定。但隨時(shí)間的延長(zhǎng)，曲線斜率逐漸減少，反響速度逐漸降低。斜率=濃度/時(shí)間

=vt一、酶反響速度的測(cè)量3〔1〕底物濃度降低、產(chǎn)物濃度上升而逐漸增大了逆反響?！?〕酶本身在反響中失活，產(chǎn)物的抑制等。因此，一般測(cè)定酶促反響初期的速度，因?yàn)榇藭r(shí)以上因素還來不及起作用，此速度稱為“反響初速度〞〔條件：底物濃度足夠大時(shí)〕其原因可能是二、影響酶促反響速度的因素〔總〕〔一〕酶濃度對(duì)酶作用的影響〔二〕pH對(duì)酶作用的影響〔三〕溫度對(duì)酶作用的影響〔四〕底物濃度對(duì)酶作用的影響〔五〕激活劑對(duì)酶作用的影響〔六〕抑制劑對(duì)酶作用的影響〔一〕酶濃度對(duì)酶作用的影響反響的速度v酶的濃度〔[E])v=k[E]在底物足夠過量而其他條件固定的條件下，酶促反響的速度和酶濃度成正比?！捕硃H對(duì)酶作用的影響相對(duì)活力各種酶的pH值的活性曲線2468100最適pH:酶表現(xiàn)出最大活性的pH。生物體內(nèi)大多數(shù)酶的最適pH接近于中性〔〕。胃蛋白酶的最適pH為1.5-2.5,胰蛋白酶的最適pH在9左右。溶液pH偏離最適pH時(shí)，酶的活性降低，偏離越遠(yuǎn)，活性越低。胃蛋白酶胰蛋白酶〔三〕溫度對(duì)酶反響的影響1反應(yīng)的速度v溫度tOC低溫時(shí)酶的活性低，酶促反響速度很慢。溫度升高時(shí)，反響速度也逐步增加但當(dāng)溫度增加到一定程度以后，引起酶的變化，酶促反響減慢以至消失?！踩硿囟葘?duì)酶反響的影響2最適溫度:酶表現(xiàn)最大催化能力時(shí)的溫度大多數(shù)酶的最適溫度接近于體溫370C。但也有個(gè)別的酶具有較大的抗熱性。酶的反響活性在低溫下并不喪失，只是催化活性很微弱，溫度上升活性又可恢復(fù)。反應(yīng)的速度v溫度tOC最適溫度〔四〕底物濃度對(duì)酶作用的影響1一級(jí)反響：當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，反響速度與底物濃度成正比關(guān)系?；旌霞?jí)反響：隨著底物濃度的增加，反響速度不再按正比升高。零級(jí)反響:隨底物濃度的不斷加大，反響速度不再上升，趨向一個(gè)極限，說明酶已被底物所飽和。一級(jí)反響v[S]Vmax1/2VmaxKm零級(jí)反響混合級(jí)反響〔四〕底物濃度對(duì)酶作用的影響2“中間產(chǎn)物〞假說為了解釋上圖所示現(xiàn)象，曾有許多假說，其中“中間產(chǎn)物〞假說是被大家公認(rèn)的比較合理的假說。它認(rèn)為酶與底物先結(jié)合成一個(gè)絡(luò)合物，即中間產(chǎn)物。此中間產(chǎn)物亦被人們看作為穩(wěn)定的過渡態(tài)物質(zhì)，然后此絡(luò)合物再進(jìn)一步分解成為產(chǎn)物和游離態(tài)酶。E+SESP+EK1K2K3K4〔四〕底物濃度對(duì)酶作用的影響31．米氏方程的提出

2．米氏常數(shù)的意義及測(cè)定1．米氏方程的提出1(方程〕1913年Michaelis和Menten提出酶促動(dòng)力學(xué)的根本原理，并歸納為一個(gè)數(shù)學(xué)式加以表達(dá)-米氏方程。米氏方程說明了底物濃度與酶反響速度間的定量關(guān)系，這就使“中間產(chǎn)物假說〞得到了人們的普遍成認(rèn)，現(xiàn)在一般稱為“米氏學(xué)說〞。1．米氏方程的提出2(解釋1〕米氏方程圓滿地表示了[s]和V之間的關(guān)系1當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，Km＞＞[s]，分母中[s]可忽略不計(jì)，即：得：V=〔Vmax/km〕[s]即反響速度與底物濃度成正比，符合一級(jí)反響1．米氏方程的提出2(解釋2〕米氏方程圓滿地表示了[s]和V之間的關(guān)系2當(dāng)?shù)孜餄舛群芨邥r(shí)[S]＞＞Km，Km可忽略不計(jì)，即：得：V=Vmax即反響速度與底物濃度無關(guān)，符合零級(jí)反響2．米氏常數(shù)意義及測(cè)定1(意義1〕當(dāng)反響速度v等于最大的反響速度Vmax的一半時(shí)，即v=Vmax/2，代入方程得：簡(jiǎn)化得：

Km=[s]2．米氏常數(shù)意義及測(cè)定1(意義2〕當(dāng)酶促反響速度到達(dá)最大的反響速度一半時(shí)的底物濃度。它的單位是mol/L，與底物濃度單位一致。不同酶促反響的Km可相差很大，一般在10-3－10-5mol/L之間。米氏常數(shù)在酶學(xué)研究中是一個(gè)極重要的數(shù)據(jù)。米氏常數(shù)的物理意義是：2．米氏常數(shù)意義及測(cè)定2〔Km特點(diǎn)〕〔1〕Km是酶的特征常數(shù)之一?！?〕如果一種酶有幾種底物，那么對(duì)每一種底物，各有一個(gè)特定的km值,因此，測(cè)定酶的Km可以作為鑒別酶的一種手段?！?〕Km愈小〔1/Km愈大〕酶對(duì)底物的親和力愈大，到達(dá)最大反響速度一半時(shí)需要的底物濃度就越小。因此Km值最小的底物一般稱為該酶的最適底物或天然底物。〔4〕可由所要求的v〔應(yīng)到達(dá)Vmax的百分?jǐn)?shù)〕，求出應(yīng)當(dāng)參加的[S]；反過來，也可根據(jù)的[S]，求出該條件下的v。2．米氏常數(shù)意義及測(cè)定3〔實(shí)際意義〕(1)鑒定酶(2)判斷酶的最適底物(3)計(jì)算一定速率下的底物濃度(4)了解酶的底物在體內(nèi)具有的濃度水平(5)判斷反響方向和趨勢(shì)(6)判斷抑制類型2．米氏常數(shù)意義及測(cè)定4〔測(cè)定1[1]〕linewenver-Burk的雙倒數(shù)作圖法1

1Km11=

+

VVmax[S]Vmax假設(shè)以1/V對(duì)1/[S]作圖,即得:即取米氏方程的倒數(shù)2．米氏常數(shù)意義及測(cè)定4〔測(cè)定1[2]〕斜率=Km/Vmax-1/Km1/Vmaxlinewenver-Burk的雙倒數(shù)作圖法2此法因方便而應(yīng)用最廣實(shí)驗(yàn)點(diǎn)過分集中于直線的左端，作圖不易十分準(zhǔn)確2．米氏常數(shù)意義及測(cè)定4〔測(cè)定2〕以v對(duì)v/[S]作圖,得一直線其縱軸截距為Vmax橫軸截距為Vmax/Km斜率為－Km法:

即把米氏方程改寫為：VmaxvVmax/Kmv/[S]斜率為－Km〔五〕激活劑對(duì)酶作用的影響1(概念)激活劑:能增進(jìn)酶的活性，加速酶促反響進(jìn)行的物質(zhì)。激活:使已有活性的酶活性增高。是由小到大的問題。致活:活性從無到有的問題。如Mg2+是各種磷酸激酶的激活劑；CO2+，Mn2+，Zn2+是某些肽酶的激活劑；Cu2+、Fe2+是某些氧化酶的激活劑?！参濉臣せ顒?duì)酶作用的影響2(機(jī)理)〔1〕可能是構(gòu)成酶活性中心的成分之一，由于別離提純而喪失，所以參加某些金屬離子有助于增強(qiáng)酶的活性?！?〕可能是酶與底物結(jié)合的橋梁。作用機(jī)理〔六〕抑制劑對(duì)酶作用的影響1抑制作用:使酶活力下降，但并不引起酶蛋白變性的作用。酶的抑制劑:對(duì)酶抑制作用的物質(zhì)。失活作用:使酶變性的作用。抑制作用一般分為兩類：

1．不可逆抑制作用

2．可逆的抑制作用1．不可逆抑制作用1定義:抑制劑與酶結(jié)合后，不能用透析的方法除去抑制劑而恢復(fù)酶活力。舉例:二異丙基氟磷酸〔DFP)能夠與胰凝乳蛋白酶或乙酰膽堿酯酶活力中心的絲氨酸殘基反響，形成穩(wěn)固的共價(jià)鍵，因而抑制酶的活性.不可逆抑制作用11．不可逆抑制作用2又如碘乙酸、碘乙胺對(duì)巰基酶的不可逆抑制不可逆抑制作用2

碘乙酸(碘乙胺)2．可逆的抑制作用可逆的抑制作用:抑制劑與酶的結(jié)合為一可逆反響,用透析等方法能除去抑制劑使酶恢復(fù)活力它又分為〔1〕競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用〔2〕非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用〔3〕反競(jìng)爭(zhēng)性抑制〔1〕競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用1(定義)定義:當(dāng)抑制劑與酶結(jié)合后，阻礙了底物與酶結(jié)合，因而降低了酶的活力.〔1〕競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用2(舉例)如琥珀酸脫氫酶能催化琥珀酸脫氫生成反丁烯二酸與琥珀酸結(jié)構(gòu)近似的如草酸、丙二酸、草酰乙酸或戌二酸均可作為琥珀脫氫酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑〔1〕競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用3(式子表示)

競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用可用下式表示：

Ki2〔1〕競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用4(速度方程1)

按推導(dǎo)米式方程的方法可導(dǎo)出競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的速度方程

〔1〕競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用4(速度方程2)從上述速度方程可以看出：有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在時(shí)，Km值增大1＋[I]/Ki倍，而且Km值將隨著[I]增高而增大，當(dāng)[S]＞＞＞km時(shí)〔也就是[s]使酶飽和時(shí)，方程即為v=V，最大反響速度不變。競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在時(shí)，改變Km而不改變V的作用。反映競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的特點(diǎn)是底物濃度很高時(shí)，抑制作用可以被解除，競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑影響Km而不影響V.〔1〕競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用4(速度方程3)表達(dá)在圖中，I存在時(shí)與I不在存在時(shí)所得直線都在縱軸上交于一點(diǎn)，即縱軸截距相等。而橫軸截距負(fù)值減少，斜率增大。其作用機(jī)理可能是由于底物與抑制劑結(jié)合在酶分子的同一部位上，也可能是由于底物或抑制劑中的一個(gè)與酶結(jié)合后，引起酶發(fā)生變化，產(chǎn)生不利于另一個(gè)結(jié)合的構(gòu)象.1/v1/[S]－1/km－1/km〔1+[I]/Ki〕Vmax正常[I]加大〔1〕競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用4(速度方程4)Vmax不變Km變大〔2〕非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用1(定義1)定義1:有些抑制劑和底物可同時(shí)結(jié)合在酶的不同部位上，也就是說抑制劑與酶結(jié)合后，不阻礙酶再與底物結(jié)合?！?〕非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用1(定義2)

但所形成的酶－底物-抑制劑三元復(fù)合物[ESI]不能進(jìn)一步分解為產(chǎn)物，因此酶活性降低?！?〕非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用2(式子表示)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用可用下式表示〔2〕非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用3(速度方程1)推出的速度反響方程為雙倒數(shù)法處理〔2〕非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用3(速度方程2)

由方程可以看出：非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在時(shí)，v減少1＋[I]/Ki倍。而且v將隨[I]增大而降低，但Km值不變。當(dāng)[S]無限增大時(shí)，有I存在時(shí)的曲線永遠(yuǎn)低于無抑制劑存在的曲線，彼此不能重合。因此，反映出此種抑制不能增大[S]來克服。這種影響v而不改變Km的作用為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的特點(diǎn)〔2〕非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用3(速度方程3)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用改變v而不影響Km的效應(yīng)表現(xiàn)在：有I存在時(shí)得到的直線和沒有I存在時(shí)所得的直線在橫軸上交于一點(diǎn)，即橫軸截距相等。都是－1/km。但縱軸截距和直線斜率增大，并將隨著[I]增大而增大，這個(gè)特點(diǎn)也常用來做為判斷非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的一個(gè)根據(jù)。1/v1/[S]－1/km正常[I]加大〔2〕非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用3(速度方程4)Vmax變小Km不變〔2〕非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用3(作用機(jī)理4)

抑制作用于酶活性部位中催化基團(tuán)，也可能是與維持酶分子構(gòu)象的必需基團(tuán)作用，而使酶的活性降低。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的機(jī)理可能是〔3〕反競(jìng)爭(zhēng)性抑制1(式子表示)相對(duì)于上述兩種抑制作用，反競(jìng)爭(zhēng)性抑制存在著以下平衡，抑制劑只能與酶－底物中間復(fù)合物結(jié)合〔3〕反競(jìng)爭(zhēng)性抑制2(速度方程)隨著抑制劑的增加，Vmax和Km均變小，形成的三元復(fù)合物不能分解為產(chǎn)物，因此影響反響速度。這類抑制很少見。其動(dòng)力學(xué)曲線的特征是3.三種不同抑制作用的特點(diǎn)工科P104，南大P2814.對(duì)酶的抑制作用研究的意義酶的抑制作用在醫(yī)學(xué)、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及根底理論研究上都具有一定的意義。如人服用磺胺藥物后，磺胺藥物即作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以和細(xì)菌體內(nèi)利用對(duì)－氨基苯甲酸的酶結(jié)合。從而使細(xì)菌體內(nèi)無法合成其生活所需物－葉酸，而導(dǎo)致代謝紊亂，細(xì)菌繁殖受到抑制；在農(nóng)業(yè)上抑制作用常用于設(shè)計(jì)新農(nóng)藥第七節(jié)酶的別離提純及活力測(cè)定一、酶的別離提純二、活力測(cè)定一、酶的別離提純(總)1．目的2．提純3．制備戰(zhàn)略1．目的〔1〕研究酶的理化特性、鑒定酶〔2〕生物試劑及用作藥物〔高純度〕2．提純酶有兩大類，胞外酶及胞內(nèi)酶。胞外酶易別離。如收集動(dòng)物胰液即可別離出其中的各種蛋白酶及脂酶。胞內(nèi)酶存在于細(xì)胞內(nèi)，必須破碎細(xì)胞才能進(jìn)行別離。3．制備戰(zhàn)略(總)〔1〕選材〔2〕破碎細(xì)胞〔3〕抽提〔4〕濃縮〔5〕純化3．制備戰(zhàn)略1〔1〕選材：含量高，易于別離?！?〕破碎細(xì)胞：研磨，勻漿器，搗碎機(jī)?！?〕抽提：抽提時(shí)注意的因素：pH、溫度、鹽及蛋白酶等。一般在低溫下，調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)，用鹽析〔硫酸銨或氯化鈉〕或有機(jī)溶劑〔乙醇、丙酮、異丙醇等〕使酶沉淀。酶是生物活性物質(zhì)，一般在0—50C進(jìn)行提純。乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑分級(jí)別離時(shí)必須在－150C—－200C進(jìn)行，酶制品一般都應(yīng)在－200C以下低溫保存。3．制備戰(zhàn)略2：

〔4〕濃縮：抽提液和發(fā)酵液中酶濃度一般都很低，所以，在純化前要進(jìn)行濃縮，常用的方法有：①蒸發(fā)：高真空的條件下，大面積熱空氣接觸，使水分在瞬時(shí)蒸發(fā)，而到達(dá)目的。由于水分蒸發(fā)時(shí)能帶走熱量，所以，只要真空條件好，受熱并不強(qiáng)。②超過濾。③凝膠過濾。④冰凍濃縮。⑤其他：如聚乙二醇濃縮等。3．制備戰(zhàn)略3：

〔5〕純化：首先了解所需純化酶的理化性質(zhì)〔溶解度、分子大小和解離特性〕，以及酶的穩(wěn)定性等。判斷所選方法與條件的適當(dāng)性，控制操作條件。具體純化方法有：①根據(jù)分子大?。耗z過濾、超濾、超離心等。②根據(jù)解離性質(zhì)：離子交換、電泳、等電聚焦等。③根據(jù)溶解度：鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等。④酶與底物、輔助因子及抑制劑的專一性親和作用，可采用親和層析。二、活力測(cè)定1．酶活力與酶反響速度

2．酶的活力(activity)單位

3．酶的比活力(specificactivity)1．酶活力與酶反響速度1從圖中可知，反響速度只在最初一段時(shí)間內(nèi)保持恒定，隨時(shí)間延長(zhǎng)，酶反響速度逐漸下降。研究酶反響速度，應(yīng)研究酶促反響的初速度。因?yàn)榇藭r(shí)反響速度是成直線上升。產(chǎn)物的濃度酶反響的速度曲線斜率=濃度/時(shí)間

=v酶活力的大小可以用在一定條件下，它所催化某一化學(xué)反響的反響速度來表示。酶反響速度可用單位時(shí)間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示：V=[S]/t[P]t1．酶活力與酶反響速度2造成反響速度下降的原因：〔1〕底物濃度降低〔2〕酶局部失活〔3〕產(chǎn)物對(duì)酶抑制〔4〕產(chǎn)物濃度增加加速了逆反響的進(jìn)行1．酶活力與酶反響速度3測(cè)定產(chǎn)物增加量或底物減少量的常用的方法：化學(xué)滴定法、比色、比旋光、氣體測(cè)壓、測(cè)定紫外線吸收、電化學(xué)法、熒光測(cè)定以及同位素技術(shù)等。在簡(jiǎn)單酶反響中，底物減少與產(chǎn)物增加的速度是相等的。但一般以測(cè)定產(chǎn)物為好。因?yàn)闇y(cè)定