《多聚酶鏈式反應(yīng)擴增DNA片段》教學(xué)設(shè)計課題目標（一）知識與技能1．了解PCR技術(shù)的基本操作2．理解PCR的原理3．討論PCR的應(yīng)用（二）過程與方法在多聚酶鏈式反應(yīng)擴增DNA片段的實驗過程中，應(yīng)避免外源DNA污染，嚴格控制溫度等反應(yīng)條件（三）情感、態(tài)度與價值觀通過對PCR實驗的操作及結(jié)果分析，培養(yǎng)學(xué)生嚴謹?shù)目茖W(xué)態(tài)度和實事求是的科研精神課題重點PCR的原理和PCR的基本操作課題難點PCR的原理教學(xué)方法啟發(fā)式教學(xué)教學(xué)工具多媒體課件教學(xué)設(shè)計1.回顧上節(jié)課凝膠色譜法和電泳的原理。2.掌握凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的操作以及電泳操作過程。知識準備凝膠色譜法和電泳的原理教材助讀血液的組成成分水分血漿無機鹽、葡萄糖等血液白細胞血細胞血小板兩個α-肽鏈紅細胞血紅蛋白兩個β-肽鏈最多四個亞鐵紅素基團（二）實驗操作1.樣品處理：通過洗滌紅細胞、血紅蛋白釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液。試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。2.樣品的粗分離方法：透析原理：透析袋能使小分子自由進出，而大分子保留在袋內(nèi)目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。3.樣品的純化：通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去（1）凝膠色譜柱的制作：①、取長40厘米，內(nèi)徑厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②、底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。③、頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④、組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體。⑤、安裝其他附屬結(jié)構(gòu)（2）凝膠色譜柱的裝填①、凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水克。②、凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③、凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1.凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2.裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。3.洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為）充分洗滌平衡12小時。注意：1.液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2.不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。（3）樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。④洗脫：小心加入pH=的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。4.樣品的純化鑒定聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定課內(nèi)探究質(zhì)疑探究洗滌紅細胞時為什么不能用蒸餾水代替生理鹽水?在血紅蛋白釋放過程中。加入蒸餾水和甲苯的目的是什么?與其他真核細胞相比較，紅細胞有什么特點？這一特點對分離有什么意義/實驗操作中透析的目的是什么？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？歸納總結(jié)血紅蛋白提取分離：首先，洗滌紅細胞，釋放血紅蛋白、離心；然后通過透析將樣品粗分離；再制作凝膠色譜柱進行樣品純化；最后，SDS凝膠電泳鑒定樣品是否為血紅蛋白。知識網(wǎng)絡(luò)圖樣品處理洗滌紅細胞，釋放、離心。樣品的粗分離透析血紅蛋白的提取與分離樣品的純化凝膠色譜柱樣品的鑒定SDS凝膠電泳當堂檢測1．蛋白質(zhì)提取和分離分為哪幾步（）A．樣品處理、凝膠色譜操作、SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳B．樣品處理、凝膠色譜操作、純化C．樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定D．樣品處理、純化、粗分離、純度鑒定2.血紅蛋白因含有什么物質(zhì)而呈紅色（）A.O2B.COC.CO2D.血紅素3.將攪拌好的混合液離心來分離血紅蛋白溶液時，第二層是（）A.甲苯B.血紅蛋白水溶液C.脂溶性物質(zhì)的沉淀層D.其他雜質(zhì)的沉淀4．分離血紅蛋白溶液時，離心后試管中的溶液分四層，血紅蛋白位于（）A．一B．二C．三D．四5.下列操作正確的是（）A.分離紅細胞時采用低速長時間離心B.紅細胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水就可C.分離血紅蛋白溶液是低速短時間離心D.透析時要用20mmol/l的磷酸緩沖液，透析12h6．洗滌紅細胞的目的是（）A．去除血清B．去除雜蛋白C．除去血小板D．除去水7．洗滌紅細胞時，分離所用的方法為（）A．低速長時間離心B．低速短時間離心C．高速長時間離心D．高速短時間離心8．制作凝膠色譜柱時，橡皮塞頂部凹穴內(nèi)插入的移液管的部位及長度是（）A．移液管頭部5cmB．移液管尾部5cmC．移液管頭部3cmD．移液管尾部3cm9．下列有關(guān)凝膠色譜法中樣品的加入和洗脫的敘述中，正確的是（）A．先加入1mL透析后的樣品B．加樣前要使緩沖液緩慢下降，全部流出C．如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動，說明色譜柱制作成功D．洗脫時可以用緩沖液也可以用清水課后訓(xùn)練一、單選題1．裝填凝膠色譜柱時，下端的尼龍管應(yīng)（）A．先打開后關(guān)閉B．關(guān)閉C．先關(guān)閉后打開D．打開2．D亞鐵血紅素基團可攜帶（）A．一分子COB．一分子NOC．一分子O2或CO2D．一分子NO23．人體正常的血紅蛋白中應(yīng)含有Fe2+，若誤食亞硝酸鹽，則導(dǎo)致血紅蛋白中的Fe2+。轉(zhuǎn)化為Fe3+，產(chǎn)生高價鐵血紅蛋白而中毒。服用維生素C可解除亞硝酸鹽中毒。在維生素C參與的反應(yīng)中（）A．亞硝酸鹽是還原劑B．維生素C是氧化劑C．亞硝酸鹽被氧化D．維生素C將Fe3+還原為Fe2+4．加有少量檸檬酸鈉(防止血液凝固)的豬血分裝于標號①、②、③的試管中，隨后依次加入質(zhì)量分數(shù)為0．3％、0．9％和1．5％的氯化鈉溶液稀釋，30min后離心。下列敘述中，正確的是（）A．①和②試管的上清液中有血紅蛋白，沉淀中都有紅細胞B．②和③試管的上清液呈淡黃色，沉淀中均有皺縮的紅細胞C．①和③試管的沉淀中分別有紅細胞的碎片和皺縮的紅細胞D．②和③試管的上清液是血清5．在血紅蛋白的整個提取過程中，不斷用磷酸緩沖液處理的目的是（）A．磷酸緩沖液會加速血紅蛋白的提取過程B．血紅蛋白是一種兩性物質(zhì)，需要酸中和C．防止血紅蛋白被02氧化D．讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持其結(jié)構(gòu)和功能6．在盛有紅褐色的Fe(OH)3，膠體的U形管的兩個管口，各插一個電極，通直流電后，發(fā)現(xiàn)陰極附近的顏色逐漸加深，這說明（）A．Fe(OH)3膠體粒子帶正電荷，向陰極移動B．Fe(OH)3膠體粒子帶負電荷，向陽極移動C．Fe(OH)3膠體粒子帶正電荷，向陽極移動D．Fe(OH)3膠體粒子帶負電荷，向陰極移動7.下列有關(guān)提取和分離血紅蛋白的程度敘述錯誤的是（）A.樣品的處理就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶液B.通過透析可以去除樣品中分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取C.可通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化D.可通過SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度8.凝膠色譜法操作正確的是（）A.將橡皮塞上部用刀切出鍋底狀的凹穴B.將橡皮塞下部切出凹穴C.插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面D.將尼龍網(wǎng)剪成與橡皮塞下部一樣大小的圓片9.樣品的加入和洗脫的操作不正確的是（）A.加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面下面B.加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)C.等樣品完全進入凝膠層后，關(guān)閉下端出口D.用吸管小心的將1ml透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面10.下列說法不正確的是（）A.血紅蛋白在釋放時，加蒸餾水到原血液的體積，再加40％體積的甲苯，充分攪拌B.血紅蛋白溶液離心后分為4層，第1層為白色薄層固體C.血紅蛋白溶液離心后分為4層，第4層為暗紅色沉淀物D.血紅蛋白溶液離心后分為4層，第3層為紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液二、多選題11．下面關(guān)于對血紅蛋白提取和分離的樣品的處理措施中，正確的是（）A．采集血樣后要高速短時問離心