第2節(jié)第2課時(shí)微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)1.科學(xué)實(shí)例：尋找耐高溫的DNA聚合酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種在體外擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫的DNA聚合酶。1973年，布魯克在美國(guó)黃石國(guó)家公園的一個(gè)熱泉中發(fā)現(xiàn)了耐熱的水生棲熱菌，并從這種菌種提取出耐高溫的DNA聚合酶。篩選原因：水生棲熱菌能在70-80℃高溫條件下生存，而絕大多數(shù)微生物在此條件下不能生存。一、選擇培養(yǎng)基美國(guó)黃石公園那么，如何從眾多的微生物中篩選出單一菌種？根據(jù)微生物對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。2.篩選原則耐寒微生物耐熱微生物石油分解菌有利于目的菌生長(zhǎng)的條件有哪些？營(yíng)養(yǎng)、溫度和pH等一、選擇培養(yǎng)基分離酵母菌、霉菌等真菌分離固氮菌分離自養(yǎng)型微生物允許特定種類(lèi)的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類(lèi)微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。④加高濃度食鹽金黃色葡萄球菌⑤金黃色葡萄球菌能消除石油污染的微生物③不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基②不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基①加入青霉素的培養(yǎng)基一、選擇培養(yǎng)基3.選擇培養(yǎng)基：1.選擇培養(yǎng)基的作用稀釋涂布平板法：必須要對(duì)土樣充分稀釋后，然后將菌液涂布到制備好的選擇培養(yǎng)基上。2.微生物選擇培養(yǎng)獲取純培養(yǎng)物的方法分離并計(jì)數(shù)某種微生物的數(shù)量（例如，能分解尿素的細(xì)菌）。二、微生物的選擇培養(yǎng)①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中②將10g土樣加入盛有90mL無(wú)菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。1mL1ⅹ1090mL無(wú)菌水1ⅹ1071ⅹ1051ⅹ1061ⅹ1031ⅹ1021ⅹ1041mL1mL1mL1mL9mL無(wú)菌水1mL②取1mL上清液加入盛有9mL無(wú)菌水的試管中，依次等比稀釋。3.稀釋涂布平板法的操作過(guò)程二、微生物的選擇培養(yǎng)③取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布。⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻。待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，培養(yǎng)二、微生物的選擇培養(yǎng)①原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過(guò)計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。選擇30-300個(gè)菌落的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)；每個(gè)稀釋度至少取3個(gè)平板取其平均值；統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低；統(tǒng)計(jì)的結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)；恰當(dāng)?shù)南♂尪?、涂布是否均勻是成功統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。②計(jì)數(shù)原則:因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，繁殖后形成的還是一個(gè)菌落1.間接計(jì)數(shù)法—稀釋涂布平板法三、微生物的數(shù)量測(cè)定M代表稀釋倍數(shù)；C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)；V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(mL)每g樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M例題1：某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106

的培養(yǎng)基中測(cè)得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每g樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積為0.1mL)()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B三、微生物的數(shù)量測(cè)定③計(jì)算公式：不能區(qū)分死菌與活菌；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；2.直接計(jì)數(shù)—計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法①原理：利用細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。②缺點(diǎn)：三、微生物的數(shù)量測(cè)定葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g瓊脂15.0g蒸餾水1000ml①原理：絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌。1.培養(yǎng)基的制備②配方：四、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)KH2PO4和Na2HPO4的作用是：①提供無(wú)機(jī)鹽；②調(diào)節(jié)pH。常見(jiàn)的分解尿素的微生物：芽孢桿菌、小球菌、棒狀桿菌等細(xì)菌，某些真菌和放線(xiàn)菌也能分解尿素。細(xì)菌宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長(zhǎng)，絕大部分分布在距地表3-8cm的土壤層。鏟去表層土3cm左右，取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。取土樣時(shí)用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（1）土壤取樣四、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

不同微生物在土壤中含量不同，分離不同的微生物采用不同的稀釋度，以保證獲得菌落數(shù)在30～300之間，適于計(jì)數(shù)的平板。測(cè)細(xì)菌數(shù)：一般用104、105、106稀釋液測(cè)放線(xiàn)菌：一般用103、104、105稀釋液測(cè)真菌數(shù)：一般用102、103、104稀釋液（2）樣品的稀釋選擇一個(gè)比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養(yǎng)，以保證能從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)在初次實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于稀釋的范圍沒(méi)有把握，怎樣做才能保證從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)？四、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思考①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中②將10g土樣加入盛有90mL無(wú)菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。1mL1ⅹ1090mL無(wú)菌水1ⅹ1071ⅹ1051ⅹ1061ⅹ1031ⅹ1021ⅹ1041mL1mL1mL1mL9mL無(wú)菌水1mL②取1mL上清液加入盛有9mL無(wú)菌水的試管中，依次等比稀釋。（3）稀釋涂布平板法接種四、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)③取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布。⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻。待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，培養(yǎng)四、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)①不同種類(lèi)的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌一般在30-37℃的溫度下培養(yǎng)1-2d。③一般來(lái)說(shuō)，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等。②每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。（4）微生物的培養(yǎng)與觀察四、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)①實(shí)驗(yàn)組：3組接種的選擇培養(yǎng)基?用以分離并計(jì)數(shù)能分解尿素的細(xì)菌

第4組接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基?用以判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用②對(duì)照組：第5組不涂布稀釋液的選擇培養(yǎng)基?用以驗(yàn)證培養(yǎng)基中是否含有雜菌第6組牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基?用以驗(yàn)證培養(yǎng)基中是否含有雜菌③實(shí)驗(yàn)結(jié)果：前3組實(shí)驗(yàn)組分離得到單菌落；第4組得到多種菌落；第5,6組正常情況下無(wú)菌落。四、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)3.注意事項(xiàng)①無(wú)菌操作:

②做好標(biāo)記:

③規(guī)劃時(shí)間:

本實(shí)驗(yàn)使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好在使用前做好標(biāo)記。本實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，需要事先規(guī)劃時(shí)間，以便提高實(shí)驗(yàn)效率，在操作時(shí)有條不紊。如在標(biāo)記培養(yǎng)皿時(shí)應(yīng)該注明組別、培養(yǎng)日期和平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度等。1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。2、應(yīng)在火焰旁稱(chēng)取土壤。在火焰附近將稱(chēng)好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3、在稀釋土壤溶液的過(guò)程中，每一步都要在火焰旁操作。四、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)4.操作提示2：在以尿素作為唯一氮源的培養(yǎng)基中分離出的微生物都是能分解尿素的嗎？

1：樣品的稀釋操作是否成功？如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30～300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。不一定。因?yàn)橛行┪⑸锟梢岳闷渌⑸锏拇x產(chǎn)物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。四、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)思考CO(NH2)2+H2O脲酶CO2+2NH3pH升高，酚紅指示劑變紅補(bǔ)充拓展：脲酶陰性脲酶陽(yáng)性土壤中分解尿素的細(xì)菌的鑒定在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果pH升高，指示劑將變紅，說(shuō)明該細(xì)菌能夠分解尿素。課堂小結(jié)微生物的數(shù)量測(cè)定選擇培養(yǎng)基的作用微生物選擇培養(yǎng)獲取純培養(yǎng)物的方法-稀釋