蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)應(yīng)用第四講蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)（一）氨基酸序列分析X-射線衍射技術(shù)

核磁共振質(zhì)譜技術(shù)結(jié)構(gòu)分析的其它方法現(xiàn)代光譜技術(shù)三維電鏡重構(gòu)技術(shù)

UV-Vis、IR、熒光、CD、激光拉曼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象；構(gòu)象變化過程；如：蛋白質(zhì)折疊過程中間態(tài)形成的時(shí)間尺度和機(jī)制.

二級結(jié)構(gòu)形成、卷曲過程，變性和復(fù)性過程及機(jī)制。主要內(nèi)容是結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)第一節(jié)蛋白質(zhì)氨基酸序列分析技術(shù)主要內(nèi)容化學(xué)法基因方法蛋白質(zhì)分子中二硫鍵和酰胺基位置的確定蛋白質(zhì)測定新技術(shù)一級結(jié)構(gòu)測定的意義：寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)與制備

cDNA推導(dǎo)氨基酸序列提供依據(jù)重組DNA產(chǎn)生的蛋白指紋分析蛋白質(zhì)的完整結(jié)構(gòu)鑒定確定翻譯后修飾的位點(diǎn)決定簇的定位二硫鍵的確定一、蛋白質(zhì)測序的研究歷史1947采用部分水解的方法試圖測定蛋白質(zhì)的氨基酸序列Consden等利用色譜技術(shù)成功測定了短桿菌肽S6的氨基酸序列Sanger首次測定了牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)（由51個(gè)氨基酸殘基組成）Spackman、Stein、Moore制造了自動化的氨基酸分析儀，使氨基酸定量分析進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段Edman

推出第一臺全自動測序儀195819551940年前1967N-末端氨基酸的測定方法（主要5類）1、二硝基氟苯法（DNFB法、Sanger法）2、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）

DNS-氨基酸呈熒光3、異硫氰酸苯酯法（PITC法）4、DABITC法（甲氨偶氮苯基異硫氰酸苯酯）， 形成的DABIH—氨基酸呈桔黃色（有顏色）5、氨肽酶法N-末端測定的方法——奠定了序列測定方法發(fā)展基礎(chǔ)牛胰島素（51aa）的一級結(jié)構(gòu)Sanger首次(DNFB法)測定了牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)

——Sanger法（測定蛋白N末端的方法）二、序列測定方法——化學(xué)方法（一）N端測序法應(yīng)用最廣的N端順序測定法大多仍以Edman降解原理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)。利用化學(xué)試劑和控制反應(yīng)條件，從N端開始，將肽鏈逐步降解，進(jìn)行氨基酸序列的測定的方法。

1、Edman降解法——異硫氰酸苯酯（PITC）法特點(diǎn)：可以測定氨基酸的排列順序（包括N端分析）。適用于手工操作，也可設(shè)計(jì)自動化測定儀器（1）原理：四點(diǎn)： ①異硫氰酸苯酯(PITC)偶聯(lián)→②ATZ-氨基酸裂解→

③PTH-氨基酸轉(zhuǎn)化→④PTH-氨基酸的鑒定

偶聯(lián)：自由α-氨基與異硫氰酸苯酯(PITC)試劑偶聯(lián)，與其緊挨的第二個(gè)殘基的鍵合力大大減弱，很容易斷裂。

裂解：在無水條件下酸（F3CCOOH）裂解，形成苯氨基噻唑啉酮衍生物（ATZ-氨基酸）和失去末端氨基酸殘基的多肽，又可與PITC進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，下一輪降解。

轉(zhuǎn)化：ATZ-氨基酸不穩(wěn)定，三氟乙酸水溶液（25%）可轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的PTH-氨基酸。

PTH-氨基酸的鑒定：可以通過薄層層析、氣相色譜、高效液相色譜及質(zhì)譜等各種手段進(jìn)行分析。乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸(PTH－氨基酸)。PITC試劑ATZ-氨基酸單向紙層析氨基酸鑒定——PTH-氨基酸與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（PITC試劑反應(yīng)）對照雙向紙層析薄層層析（TLC）高效液相色譜（HPLC）（highperformanceliquidchromatography）（2）氨基酸序列分析儀器以Edman法測序，手工操作繁瑣，工作量大根據(jù)Edman降解的原理——自動化分析儀器自70年代初全自動序列儀誕生以來，經(jīng)過了一系列更新?lián)Q代，儀器日趨靈敏、快速。靈敏度達(dá)0.1pmol蛋白3種代表性的測序儀器簡單介紹如下：①液相旋轉(zhuǎn)杯序列儀最初的自動化儀器，對自動化測序意義很大。測定程序：整個(gè)儀器的“核心”部分是一個(gè)反應(yīng)杯，它由一個(gè)馬達(dá)帶動并有調(diào)速控制。蛋白質(zhì)或多肽樣品經(jīng)導(dǎo)管注入反應(yīng)杯，通過旋轉(zhuǎn)離心力被均勻地涂在杯壁上，形成一層薄膜，其厚薄可由轉(zhuǎn)速控制。反應(yīng)試劑和溶劑分別通過導(dǎo)管進(jìn)入反應(yīng)杯，與杯內(nèi)薄層上的樣品的N端自由氨基進(jìn)行Edman反應(yīng)；降解下來的ATZ—氨基酸衍生物通過另一導(dǎo)管引出并收集；再將ATZ氨基酸→PTH氨基酸→鑒定；洗滌反應(yīng)杯，依次循環(huán)分析。特點(diǎn)：該儀器樣品流失較大，樣品消耗量大，目前已很少使用。②固相序列分析儀發(fā)展的動力和原因： 克服液相旋轉(zhuǎn)杯分析儀的缺點(diǎn)。多肽不易吸附旋轉(zhuǎn)杯上，樣品流失較大；原理：蛋白質(zhì)C端羧基共價(jià)固定在惰性載體上，進(jìn)行Edman降解。特點(diǎn)：樣品與載體共價(jià)結(jié)合，洗滌和抽提等過程不會丟失樣品，增加循環(huán)次數(shù)。缺點(diǎn)：（1）若多肽中其它殘基的羧基與載體結(jié)合，影響測定。如：酸性氨基酸殘基（Asp、Glu）（2）測定效率低3-氨基丙基玻璃N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基玻璃惰性載體成功的關(guān)鍵是肽段的固定，目前采用C端α-羧基固定法，重復(fù)法高，高絲氨酸內(nèi)酯法及雙異硫氰酯法(DITC)最好，固定率可達(dá)90-95%。③氣相蛋白序列分析儀彈筒型玻璃反應(yīng)室反應(yīng)室容積0.05ml，代替液相序列儀中的旋轉(zhuǎn)玻璃杯，用一種惰性聚合物“polybrene”固定樣品。多肽鏈與氣態(tài)試劑反應(yīng)，完成Edamn降解。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，耗費(fèi)樣品量少，通常僅需10~100pmol；試劑和溶劑消耗少，大約是液相序列儀的1／10，降低了費(fèi)用；縮短了每步降解循環(huán)時(shí)間，提高了分析效率。趨勢：靈敏度不斷提高氣相蛋白序列分析儀（3）Edman方法改進(jìn)

DABITC法：1976年，（華裔科學(xué)家）張瑞耀提出試劑：甲氨偶氮苯基異硫氰酸苯酯替代了異硫氰酸苯酯（PITC）DABITC：4-N,N-對甲氨基偶氮苯-4’-異硫氰酸酯原理：與PITC相似，形成有色產(chǎn)物DABIH—氨基酸，呈桔黃色也稱為有色的Edman降解法，氨基酸鑒定無需染色，肉眼可分辨特點(diǎn)：靈敏度很高，分析小肽段只要幾個(gè)nanomole樣品即可。但DABITC試劑與多肽N端aa耦合率低（20%-30%），測序干擾大！如何解決？DABITC—PITC兩種方法耦合，更加靈敏可靠。適用于：液相還是固相，手工還是自動方法，效果良好。異硫氰酸酯進(jìn)行35S標(biāo)記：使分析樣品更向微量化方向發(fā)展。二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）熒光劑—DNS-Cl，與肽鏈N端氨基反應(yīng)生成DNS-肽經(jīng)酸水解，N-末端殘基形成DNS-氨基酸，檢測靈敏度提高310倍。乙酸乙酯抽提，層析鑒定，DNS-氨基酸于360nm或280nm處產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，根據(jù)熒光點(diǎn)位置確定N端氨基酸。6MHCl，110℃水解過夜

DNS-脯氨酸70%被破壞。

Gln→Glu，Asn→AspTrp及其DNS衍生物完全被破壞

(可用巰基乙烷磺酸真空下水解)特點(diǎn)：不能連續(xù)降解，適用于N末端分析（n-1）肽熒光？DNS—Edman測定法兩種方法的結(jié)合DNS法，靈敏的高，但不能連續(xù)進(jìn)行Edman降解法N肽DNS-ClN末端氨基酸測定Edman降解除去N末端氨基酸水層（n-1）肽乙酸乙酯層（N末端氨基酸衍生物）DNS-ClN末端氨基酸測定Edman降解除去N末端氨基酸DNS—Edman測定流程示意圖思考？為何要?jiǎng)?chuàng)新很多方法？什么樣的方法能延續(xù)下去？（4）氨基酸自動序列儀的使用方法依據(jù)Ednan原理，氨基酸自動測序儀，序列分析加快測序儀發(fā)展方向：微量化、自動化加樣量達(dá)到微量：10-9—10-12mol水平推出從進(jìn)樣到色譜分析一體化分析儀舉例：Shimadzu（日本島津）公司PPSQ-21A氨基酸自動測序儀工作原理：

Ednan降解，產(chǎn)物乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸），柱前衍生的液相色譜（HPLC）分析。工作流程固定樣品固定將蛋白固定在高聚纖維素上，在放在能固定蛋白的聚偏氟乙烯（PDVF）膜上，進(jìn)行Edman降解。反應(yīng)器耦合以N-甲基哌啶水/甲醇（TMA）氣霧環(huán)境讓蛋白末端氨基酸與PITC反應(yīng)，生產(chǎn)PTC-肽反應(yīng)器終止反應(yīng)用乙酸清洗出去多余的試劑和副產(chǎn)物反應(yīng)器裂解無水TFA溶液，將PTC-肽裂解為ATZ-氨基酸和（n-1）肽，排出并洗滌轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換反應(yīng)采用25%TFA溶液將ATZ-AA轉(zhuǎn)化為PTH-AA轉(zhuǎn)換器提取在轉(zhuǎn)換器提取游離的PTH-氨基酸樣品進(jìn)樣進(jìn)樣用乙腈溶液溶解PTH-氨基酸，并進(jìn)樣到HPLCHPLC分析分離鑒定反向HPLC分離PTH-氨基酸，并檢測數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)分析顯示和處理數(shù)據(jù)，確定PTH-氨基酸，并進(jìn)行定量和回收率計(jì)算（5）影響N端Edman反應(yīng)裂解率的因素在測序中，即使N端很均一的蛋白質(zhì)(第一個(gè)循環(huán)出現(xiàn)單個(gè)氨基酸殘基)，經(jīng)過十幾個(gè)循環(huán)后背景明顯不及第一個(gè)殘基清晰。原因：Edman反應(yīng)是一個(gè)化學(xué)過程，在其偶聯(lián)、裂解、轉(zhuǎn)化等步驟都有可能發(fā)生一些副反應(yīng)，從而影響最終裂解效率。三氟乙酸除了裂解作用外，可與Ser和Thr上的-OH反應(yīng)，繼而部分封閉Ser和Thr的N端α-氨基，導(dǎo)致Ser和Thr時(shí)產(chǎn)率突然降低。Ser和Thr的PTH-衍生物部分轉(zhuǎn)化成其他產(chǎn)物，造成產(chǎn)率降低。偶聯(lián)試劑PITC本身也將發(fā)生副反應(yīng)，形成一些“雜質(zhì)”。（6）N端測序前樣品處理純度鑒定（97%）脫鹽疏基修飾去除N端封閉的基團(tuán)（酸水解，酶處理）（二）C端測序法雖然自動化N端測序技術(shù)日趨成熟，但仍有不少問題需借助C端序列分析來解決（？）C端測序優(yōu)勢：尤其適合于基因重組蛋白是否正確表達(dá)的鑒定（Why？）大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)的質(zhì)量控制、N端封閉蛋白的分析DNA探針或引物的設(shè)計(jì)。（不做詳細(xì)講述，感興趣者自己閱讀學(xué)習(xí)）1、原理（C端分析）基于與N端Edman降解類似的原理，采用化學(xué)試劑與蛋白質(zhì)和多肽的α-COOH反應(yīng)，反應(yīng)后的C末端衍生物被切割下來，通過HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分離分析。已有自動化的C端序列分析儀(1)活化C端的自由羧基與乙酸酐反應(yīng)生成混合酸酐，混合酸酐再環(huán)化成聚噁唑酮，在四丁基銨硫氰酸鹽的作用下，轉(zhuǎn)化為乙內(nèi)酰硫脲

(TH)。而側(cè)鏈上的羧基形成的混合酸酐則難以成環(huán)。2、C端序列分析程序六個(gè)步驟、羧基活化→側(cè)鏈羧基保護(hù)→烷基化TH–肽→側(cè)鏈羥基保護(hù)→斷裂形成ATH-AA→AA分析(2)側(cè)鏈羧基的酰胺化保護(hù)

側(cè)鏈羧基形成混合酸酐，與哌叮硫氰酸鹽（piperidinethiocyanate）進(jìn)一步作用形成酰胺，以保護(hù)側(cè)鏈羧基。(3)烷基化C末端環(huán)化成的乙內(nèi)酰硫脲（TH）衍生物較為穩(wěn)定而不易被切割，產(chǎn)率不高。選擇性地烷基化修飾硫原子，形成烷基化-TH(ATH)衍生物，裂解產(chǎn)率將大大提高。(4)修飾側(cè)鏈羥基（保護(hù)）Thr和Ser殘基的側(cè)鏈上具有羥基羥基不穩(wěn)定，會干擾測序，需要修飾。乙酸酐將羥基乙酰化，但反應(yīng)不完全。N-甲基咪唑（NMI）和乙酸酐共同作用，將Thr和Ser的羥基乙?；?。(5)裂解和衍生C末端ATH衍生物在酸性條件下與硫氰酸鹽反應(yīng)而被裂解生成ATH-氨基酸。新的C末端自動環(huán)化形成乙內(nèi)酰硫脲（TH），而不必重新活化。整個(gè)測序過程只需在開始時(shí)對C端進(jìn)行一次性活化，并修飾Asp和Glu側(cè)鏈羧基，以及Thr和Ser的羥基。(6)ATH-AA分析（常規(guī)分析）小結(jié)——C末端測序程序羧基活化→側(cè)鏈羧基保護(hù)→烷基化TH–肽→側(cè)鏈羥基保護(hù)→斷裂形成ATH-AA→AA分析測定C端第一個(gè)和第二個(gè)氨基酸工藝的區(qū)別3、C末端蛋白質(zhì)序列儀可由N端序列儀改裝而成，不同之處主要在于:(1)

反應(yīng)所用的試劑不同，兩者不兼容，否則易堵塞管道。C端序列儀：所有的化學(xué)反應(yīng)均在彈筒型反應(yīng)室中進(jìn)行，切割下來的ATH-AA僅在轉(zhuǎn)化腔內(nèi)干燥和溶解后即可進(jìn)入HPLC系統(tǒng)分離分析。N端測序儀：ATZ-AA需在轉(zhuǎn)化腔中轉(zhuǎn)化為PTH-AA。4、C端測序樣品前處理純度鑒定脫鹽疏基修飾ε-氨基的衍生5、影響C端測序反應(yīng)產(chǎn)率的因素不同的氨基酸的反應(yīng)產(chǎn)率不同，圖譜分析比N端測序復(fù)雜。C端測序副反應(yīng)較多，最高起始產(chǎn)率僅為20%，GluAspSerThr等殘基的產(chǎn)率更低。若C端富含這幾種殘基，測序十分困難。Pro殘基終止測序過程Pro殘基有吡咯環(huán)，其羧基與乙酸酐反應(yīng)不能成環(huán)。一旦遇到Pro，整個(gè)測序過程將終止。到目前為止，C端序列可測l~10個(gè)殘基，平均3~5個(gè)，一次測序需要的量比N端測序要大得多，至少需1nmol。作為N端測序的補(bǔ)充。（三）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定步驟蛋白質(zhì)水解——多個(gè)短肽測定——每個(gè)短肽的序列序列拼接——蛋白質(zhì)序列二硫鍵和酰胺位置的確定1、酶解和分離長肽鏈降解成短肽以利于多肽的序列測定長肽鏈降解成短肽與氨基酸測序結(jié)合進(jìn)行序列分析長肽鏈降解成短肽以利于測定肽譜常用酶及降解位點(diǎn)胰蛋白酶Lys、Arg等堿性aa羧基端，不切-Arg-Pro-、-Lys-Pro-胰凝乳蛋白酶芳香aa羧基端胃蛋白酶Phe、Trp、Leu、Ala等aa羧基端梭菌蛋白酶Arg等堿性aa羧基端V8蛋白酶Asp、Glu等酸性aa羧基端Lys內(nèi)肽酶Lys羧基端優(yōu)點(diǎn)：專一性強(qiáng)、條件溫和、副反應(yīng)少、水解率高短肽分離：采用HPLC方法——蛋白質(zhì)分離純化章節(jié)詳細(xì)介紹方法和原理測序不能太長，常常需要酶切測序，肽鏈拼接。（拼圖游戲）根據(jù)肽鏈測序結(jié)果若一條簡單肽鏈：僅有1～2個(gè)斷裂點(diǎn)，根據(jù)N和C末端氨基酸，很容易確定其一級結(jié)構(gòu)。若為復(fù)雜的肽鏈：不能只靠一套肽鏈斷裂方法，需要兩套甚至更多的斷裂方法分別測序，通過查找疊肽的方法，分析確定完整的氨基酸序列。舉例說明：（拼圖）2、肽鏈拼接——重疊肽法一條15個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，其N末端為His，C末端為Glu。采用兩套斷裂方法分別測序：第一套將肽段斷裂成5個(gè)小片段，其序列分別為Lys-Trp-Glu，Cys-Glu，Asp-Lys-Va-Asp，Leu-Pro-Ala和（1）His-Lys-Ile-Tyr。第二套肽段斷裂為Glu-Asp-Lys，（4）Ile-Tyr-Lys-Trp，Val-Asp-Leu-Pro，（2）Ala-Cys-Glu和（3）His-Lys。通過N、C末端及重疊肽最后可定編為：

His-Lys-Ile-Tyr-Lys-Trp-Glu-Asp-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Ala-Cys-Glu3、二硫鍵和酰胺基位置的確定（1）為何要確定？Cys如何存在，是否形成二硫鍵Gln和Asn在測序過程中水解形成Glu和Asp（2）二硫鍵位置的確定方法（對角線電泳、測序法）用碘代乙酰胺保護(hù)蛋白樣品中未參與二硫鍵的巰基；（胃蛋白酶）水解，水解肽段進(jìn)行對角線法電泳分離。點(diǎn)在方形濾紙中心點(diǎn)上，進(jìn)行第一相電泳分離(pH6.5)。將濾紙用過甲酸蒸汽熏蒸，二硫鍵氧化成半胱氨磺酸。（酶切片段若含有二硫鍵，即分成2個(gè)小肽）第二向電泳，含半胱氨磺酸的肽比原來小，且?guī)Я烁嗟呢?fù)電荷，偏離了對角線，其余肽均對角線位置上。（Why？）染色后，剪下偏離對角線的肽斑，分析其氨基酸順序，與已確定的氨基酸順序比較，即可確定二硫鍵的位置。（3）酰胺基位置的確定方法：肽鏈酶解片段定量NH4＋推測法肽鏈中酰胺基以Asn或Gln形式存在。酰胺基水解可釋放NH4＋，測定NH4＋量推測酰胺基的含量。蛋白水解酶水解分離，可以得到含有酰胺基的肽段。測定其酰胺基數(shù)和推測可能形成酰胺基的數(shù)量，如果二者數(shù)量相等，就可以確定酰胺基位置。若不符，應(yīng)將肽鏈裂解為更小片段，再測酰胺基含量和可能存在的位置數(shù)目，直到兩者相符為止。三、序列測定其它方法——基因序列分析法（1）原理：翻譯密碼子（2）步驟：蛋白質(zhì)N末端和C末端氨基酸分析特異性引物設(shè)計(jì)總mRNA提?。ㄌ囟ǖ鞍踪|(zhì)）：分離法：免疫法——結(jié)合蛋白與mRNA分子雜交?？寺RNA：測定蛋白質(zhì)N端10—15殘基序列，設(shè)計(jì)兼并引物。cDNA序列分析：RT-PCR，測定cDNA序列（？方法）例如：熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷末端終止法（？？？）全自動系列分析儀，1000bp/反應(yīng)，簡單快速，成本低廉根據(jù)密碼規(guī)則讀取蛋白質(zhì)序列。四、蛋白質(zhì)測定新技術(shù)（分離純化部分再介紹）1、高效液相色譜（HPLC）用于蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸的分析色譜填充料：大孔徑烷基化硅膠吸附劑（C18）普通孔徑：5—10um進(jìn)一步提高分析速度和靈敏度 大孔徑：3×10-5mm（大肽） 小孔徑：1×10-5mm（小肽）（1）微柱高效液相色譜（microcolum-HPLC）柱直徑<2.1mm(普通4.6mm)，Ishii首次提出是低分子量蛋白或肽的基礎(chǔ)樣品用量少，速度快，靈敏度高（1pmol），峰形尖窄，回收率高，非特異性吸附少。是目前肽譜分析最靈敏最先進(jìn)的技術(shù)之一應(yīng)用于肽譜和基因工程產(chǎn)物的分析（2）無孔色譜短柱填充直徑1.5um無孔硅膠，達(dá)到快速分離。特點(diǎn)：顯著改善分析靈敏度縮短分析時(shí)間（幾分鐘完成）減少生物分子的非專一性吸附（回收率100%）降低洗脫體積（幾個(gè)微升—1mL）可耐受較高壓力（30MPa）（3）毛細(xì)管液相色譜1995年Yamada建立柱內(nèi)徑：250um—500um，填充物直徑3-5um，孔徑3×10-5mm，2.5ml注射泵，流速僅3—5uL/min，上樣量5—25ul，檢測器：紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測器毛細(xì)管流出樣品直接點(diǎn)樣到聚偏氟乙烯膜（PVDF）上，樣品用刀片割1—2mm條帶，用于蛋白質(zhì)序列分析。靈敏度很高2、毛細(xì)管電泳（CE）20世紀(jì)90年代微量分析技術(shù)材料：熔融石英玻璃，內(nèi)徑小（<100um）上樣量極少（<10uL）,靈敏度高，比HPLC高2個(gè)數(shù)量級（10-15mol）分類：毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）；荷質(zhì)比等電聚焦電泳（CIEF）；等電點(diǎn)微團(tuán)電動毛細(xì)管電泳（MECC）；疏水或離子交換毛細(xì)管篩分電泳（CSE）；分子大小和電荷毛細(xì)管柔和免疫電泳（IACE）：與抗體結(jié)合專一性本節(jié)小結(jié)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定化學(xué)法測定原理及方法重點(diǎn)N端降解的原理、方法和影響因素，特別是Edman降解及其方法改進(jìn)。三種序列分析儀（旋轉(zhuǎn)杯、固相、氣相）簡單介紹了C端降解法的原理、方法和儀器，化學(xué)法測定蛋白質(zhì)序列測定的步驟酶解、分離純化、肽段序列測定、序列拼接、二硫鍵和酰胺基位置的確定簡述基因序列分析原理和方法HPLC和毛細(xì)管電泳等蛋白質(zhì)測定新技術(shù)（略）第二節(jié)：X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析本節(jié)主要內(nèi)容研究進(jìn)展基本概念基本原理特點(diǎn)X射線衍射技術(shù)：精確測定原子在晶體中的空間位置的一整套測量及分析技術(shù)，是迄今研究生物大分子結(jié)構(gòu)的主要技術(shù)。1.研究進(jìn)展背景1895年，倫琴發(fā)現(xiàn)X射線1913年布拉格父子用X射線衍射法對氯化鈉、氯化鉀晶體進(jìn)行了測定

1915年布拉格父子因此獲諾貝爾物理獎(jiǎng)，建立了晶體學(xué)1934年第一張蛋白質(zhì)-胃蛋白酶單晶體1957年-1959年相繼8種蛋白質(zhì)獲得了高分辨率結(jié)果1960年以后從單純的結(jié)構(gòu)學(xué)邁入結(jié)構(gòu)-功能研究。1990年以后突飛猛進(jìn)，15個(gè)結(jié)構(gòu)/天2003年，PDB收錄的84.8%蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來自X-射線衍射我國的標(biāo)志性成果1

中國科學(xué)院生物物理研究所和植物研究所“菠菜捕光復(fù)合物L(fēng)HC-II晶體結(jié)構(gòu)（2.72A）2004年，世界上權(quán)威性的著名雜志《Nature》該晶體的結(jié)構(gòu)彩圖被選作該期雜志的“封面照片”。世界上率先完成了這一具有高度挑戰(zhàn)性的國際前沿課題。推動了中國“光合作用機(jī)理與膜蛋白三維結(jié)構(gòu)”研究進(jìn)入國際領(lǐng)先水平。意義：基于精確的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)對高等植物的光能吸收、傳遞和光保護(hù)等光合作用機(jī)理研究的熱點(diǎn)問題進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)了膜蛋白結(jié)晶的第3種類型，TYPE-III膜蛋白晶體，并建立了包括膜蛋白、色素分子和脂分子在內(nèi)的蛋白脂質(zhì)體的完整的結(jié)構(gòu)模型，提供了近3萬個(gè)獨(dú)立的精確的原子坐標(biāo)?？锿⒃圃菏?005年7月1日，清華大學(xué)+生物物理所解析了“線粒體膜蛋白復(fù)合物II”的精細(xì)結(jié)構(gòu)意義：填補(bǔ)了線粒體結(jié)構(gòu)生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的空白，稱為線粒體呼吸鏈研究領(lǐng)域的一個(gè)新的里程碑。為線粒體疾病研究提供了真實(shí)可靠的模型我國的標(biāo)志性成果2晶體：離子、原子或分子等粒子在三維空間上重復(fù)排列形成的有規(guī)律的高度有序結(jié)構(gòu)。點(diǎn)陣：晶體的幾何圖形。晶體中的粒子，在空間上按一定的重復(fù)規(guī)律排列而成的幾何圖形。晶格：晶胞—是構(gòu)成晶體的基本單元。按確定的單位劃分成空間格子，在晶體中稱晶格。NaCl晶體2.晶體的基本概念2dsinα=kλ(k=1,2,3……，α：掠射角)2dcosβ=kλ(k=1,2,3……，β：入射角)布拉格X射線衍射原理布拉格衍射布拉格公式

3.晶體結(jié)構(gòu)測定程序（1）樣品制備：

要求純度達(dá)95%以上 濃度通常在10mg/ml—50mg/ml以上（2）結(jié)晶和晶體生長（掌握） 原理、結(jié)晶（晶體生長、影響因素）及鑒定（3）衍射及數(shù)據(jù)的收集和處理：（4）位相確定：（5）模型的建立和修正：

結(jié)晶原理：在飽和溶液中，蛋白質(zhì)分子間以規(guī)則方式慢慢堆積形成高度有序的結(jié)構(gòu)。晶體生長：首先形成晶核。晶核形成的影響因素有：化學(xué)：pH、沉淀劑種類、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)濃度等；物理：溶液達(dá)成過飽和狀態(tài)的速率、溫度、重力、壓力、震動、時(shí)間、電場磁場、介質(zhì)、粘度、均相和非均相等。生化因素：純度、配合體、抑制劑、聚合態(tài)、等電點(diǎn)等。結(jié)晶方法：批量結(jié)晶法batchcrystallization透析法：crystallizationbydialysis液相擴(kuò)散法：liquiddiffusion氣相擴(kuò)散法（VaporDiffusionMethod）。多孔材料吸附蛋白而讓其生長：bioglass鈣+磷酸+硅晶體的鑒定硬度、穩(wěn)定性、染色、蛋白質(zhì)電泳、偏振光、密度差法、沉降性能等。（2）結(jié)晶蛋白質(zhì)的晶體四園衍射儀基本構(gòu)造（3-1）四園衍射儀（全方位測定晶體）（3）衍射及數(shù)據(jù)的收集和處理（3-2）衍射舉例——溶菌酶蛋白X線衍射圖X線衍射——探視物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的一雙“銳眼”！當(dāng)一束強(qiáng)光穿過溶菌酶蛋白質(zhì)晶體，顯示器上出現(xiàn)了一幅精細(xì)的晶體衍射圖像中國科學(xué)院“上海光源”獲得了第一幅生物大分子晶體衍射圖像！文獻(xiàn)來源：文匯報(bào)2009-4-10記者許琦敏富蘭克林和她的DNAX光衍射結(jié)果（3-3）衍射及其數(shù)據(jù)的收集和處理衍射和數(shù)據(jù)收集中等大小晶胞的一套高分辨率數(shù)據(jù)，至少收集幾萬個(gè)衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù)，

X-射線源：強(qiáng)度高，時(shí)間短（同步輻射）溫度：低溫液氮數(shù)據(jù)收集：現(xiàn)獲現(xiàn)測，與衍射同時(shí)進(jìn)行，數(shù)據(jù)處理經(jīng)過專門的數(shù)據(jù)處理，給出一套數(shù)據(jù)的各種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，才能判斷數(shù)據(jù)質(zhì)量的好壞。

需要篩選多個(gè)晶體，選擇最合適的衍射質(zhì)量和取向的樣品突變蛋白等需要很少的實(shí)驗(yàn)就可以測定結(jié)構(gòu)膜蛋白或多結(jié)構(gòu)域蛋白需要幾百次實(shí)驗(yàn)，才能獲得好的模型發(fā)展方向：

自動化操作，軟件的開發(fā)(3-4)位相確定：解決衍射點(diǎn)的位相問題——關(guān)鍵環(huán)節(jié)分子置換法（MR）多對同晶型置換法多波長反常散射法（MAD）(3-5)模型建立和修正獲得電子密度圖：依據(jù)衍射線的振幅和位相，依據(jù)公式計(jì)算電子密度圖，包含了結(jié)構(gòu)的全部信息電子密度圖解析：結(jié)構(gòu)模型顯示系統(tǒng)和相關(guān)軟件結(jié)構(gòu)模型建立：反復(fù)修正原子坐標(biāo)、改善位相模型的修正：軟件處理，獲得結(jié)構(gòu)模型和結(jié)構(gòu)參數(shù)。是迄今研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最有效的方法優(yōu)點(diǎn)：不損傷樣品：水溶性蛋白、膜蛋白、大分子組裝體與復(fù)合體分辨率高，：能達(dá)到的精度是其它任何方法所不能比擬的。無污染、快捷能得到有關(guān)晶體完整性的大量信息蛋白質(zhì)分子大小：10nm

分子中原子的距離：0.1nm=1AX-射線的波長：0.5A-1.5A缺點(diǎn)：蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)要求高蛋白質(zhì)晶體難以培養(yǎng)，晶體結(jié)構(gòu)測定時(shí)間較長。很難捕捉到分子的動態(tài)信息4.優(yōu)缺點(diǎn)本節(jié)小結(jié)晶體及衍射的基本概念蛋白質(zhì)晶體X衍射基本程序X衍射分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的優(yōu)缺點(diǎn)蛋白質(zhì)N端測序儀器基于的化學(xué)原理是什么，簡述之。代表儀器有哪些？它們有什么進(jìn)步？N-末端氨基酸的測定方法有哪些，簡述之。蛋白質(zhì)Edman降解法的原理，Edman降解法的改良方法有哪些，簡述之。簡述蛋白質(zhì)C末端降解測序的程序氨基酸分析儀測序操作流程。C末端與N末端蛋白質(zhì)序列儀有哪些相同和不同之處。試比較C末端與N末端蛋白質(zhì)序列的優(yōu)缺點(diǎn)（影響因素）。化學(xué)法一級結(jié)構(gòu)測定的步驟有哪些，簡述之。基因測序法翻譯蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)方法。如何確定二硫鍵和酰胺基位置，為和要確定？X射線衍射測定蛋白質(zhì)構(gòu)象的原理和基本程序。思考題第三節(jié)核磁共振技術(shù)

NuclearMagneticResonance（NMR）原理適用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)基本概念核磁共振結(jié)構(gòu)測定基本程序另外，蛋白質(zhì)的晶體狀態(tài)與自然狀態(tài)也不盡相同，在分析的時(shí)候要考慮到這個(gè)問題。核磁共振技術(shù)可以分析液態(tài)下的肽鏈結(jié)構(gòu)，這種方法繞過了結(jié)晶、X－射線衍射成像分析等難點(diǎn)，直接分析自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)代核磁共振技術(shù)已經(jīng)從一維發(fā)展到三維，在計(jì)算機(jī)的輔助下，可以有效地分析并直接模擬出蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)與輔基和底物結(jié)合的情況以及酶催化的動態(tài)機(jī)理。從某種意義上講，核磁共振可以更有效地分析蛋白質(zhì)的突變。1.核磁共振波譜儀原理1．永久磁鐵：提供外磁場，要求穩(wěn)定性好，均勻，不均勻性小于六千萬分之一。掃場線圈。2．射頻振蕩器：線圈垂直于外磁場，發(fā)射一定頻率的電磁輻射信號。60MHz或100MHz。3．射頻信號接受器（檢測器）：當(dāng)質(zhì)子的進(jìn)動頻率與輻射頻率相匹配時(shí)，發(fā)生能級躍遷，吸收能量，在感應(yīng)線圈中產(chǎn)生毫伏級信號。4．樣品管：外徑5mm的玻璃管,測量過程中旋轉(zhuǎn),磁場作用均勻。與UV-vis和紅外光譜法類似，NMR也屬于吸收光譜（是處于強(qiáng)磁場中原子核對射頻輻射的吸收核磁共振波譜儀2.適用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)近生理狀態(tài)溶液中的蛋白質(zhì)構(gòu)象測定蛋白質(zhì)分子動力學(xué)（在s到ps時(shí)間尺度上）小分子和蛋白質(zhì)作用的動力學(xué)過程蛋白質(zhì)可變形尾巴部分的構(gòu)象觀察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的運(yùn)動過程（主側(cè)鏈運(yùn)動、不同溫度和壓力下蛋白質(zhì)的折疊和去折疊過程）結(jié)構(gòu)定性和定量分析非損傷性測定法，對樣品無破壞作用，但不能太大，溶解性要好，穩(wěn)定性要高，不降解不聚合，可進(jìn)行同位素標(biāo)記等。缺點(diǎn)：靈敏度低適用分子量較小的蛋白質(zhì)3.基本概念參數(shù)/概念含義結(jié)構(gòu)信息峰位基團(tuán)的化學(xué)勢移δ二級結(jié)構(gòu)信息，反映微環(huán)境變化峰形耦合常數(shù)及基團(tuán)間的耦合關(guān)系主鏈和側(cè)鏈構(gòu)象變化峰面積/峰強(qiáng)度核的相對數(shù)量以及弛豫弛豫過程從激化的狀態(tài)回復(fù)到平衡狀態(tài)的過程弛豫時(shí)間弛豫過程所需要的時(shí)間NOE信號強(qiáng)度質(zhì)子對間的距離，越大反映殘基間短程二維同核核磁共振100以下氨基酸殘基數(shù)，穩(wěn)定的溶于水的自然風(fēng)度的蛋白質(zhì)樣品三維/四維異核核磁共振大于100以上氨基酸殘基數(shù)檢測1H、13C、15N核之間的相關(guān)共振信號。液體核磁共振13C直接檢測、長程N(yùn)OE信息收集膜蛋白／去污劑膠束復(fù)合物(應(yīng)用去污劑膠束來模擬膜蛋白的磷脂雙分子層環(huán)境)固體核磁共振只能關(guān)注較小分子的結(jié)構(gòu)膜蛋白／磷脂復(fù)合譜儀頻率30MHz→900MH→1000MHz儀器工作方式連續(xù)波譜儀→脈沖-傅里葉變換譜儀4.NMR結(jié)構(gòu)測定基本程序純度：不應(yīng)有鐵及其它雜質(zhì)、粘度要低、濃度：5-10%；5mg(1H),15-30mg(13C)；傅立葉變換-NMR需1mg溶劑：1H譜=四氯化碳(1H),、二硫化碳氘代溶劑：氯仿、丙酮、苯、二甲基亞砜的氘代物標(biāo)樣濃度（四甲基硅烷TMS）：1%樣品→1