主要疫苗和菌苗的制造工藝1、HBV2、制造方法HBV感染現(xiàn)狀乙型肝炎由乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)引起，是危害全球人類健康的疾病。由HBV引起的肝硬化及原發(fā)性肝癌每年可導(dǎo)致100一200萬人死亡。WHO統(tǒng)計結(jié)果顯示,全球大約有20億人感染HBV，其中4億人為慢性感染。在中高度流行區(qū),成年人攜帶乙肝病毒的比率為2一15%，約感染的比率為30一100%。我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，普通人群中攜帶率約為10%，感染率高達50一75%。1.HBV形態(tài)結(jié)構(gòu)大球形顆粒（Dane顆粒）小球形顆粒管形顆粒100-1000nm直徑為42nm的大球形顆粒形態(tài)（完整的病毒，具有傳染性）HBsAgHBcAgHBVDNADNAP（外膜蛋白）（核衣殼蛋白）乙肝疫苗生產(chǎn)方法1、血源性疫苗2、重組蛋白疫苗3、多肽疫苗4、核酸疫苗1、血源性疫苗1980年WHO提出了從人體血漿制備乙肝疫苗的生產(chǎn)和控制規(guī)程。從乙肝病毒表帶面抗原攜者的血漿中提取HBsAg，純化滅活后制成。這種疫苗具有較強的免疫原性，但還存在一定的問題:(1)從乙肝病毒攜帶者血漿中提取的22nm顆粒滅活不徹底，會造成感染;(2)病人不愿意貢獻血液，造成疫苗來源受限，價格高居不下;2、基因重組疫苗⑴HBsAg編碼基因插入適當載體,在酵母、哺乳動物細胞中表達,分離純化表達產(chǎn)物而制備的疫苗。（免疫原性優(yōu)于血源性疫苗,以酵母細胞作為表達系統(tǒng),生產(chǎn)成本低）⑵轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)乙肝疫苗轉(zhuǎn)基因抗乙肝西紅柿(中國)，雖然不能治愈乙肝，但一年只吃幾個抗乙肝西紅柿，就完全能代替注射乙肝疫苗?？挂腋挝骷t柿屬于轉(zhuǎn)基因食品，就是將乙肝疫苗植入西紅柿內(nèi)，經(jīng)過多代繁殖，使轉(zhuǎn)入的基因穩(wěn)定化。用轉(zhuǎn)基因的植物生產(chǎn)藥物乙肝病毒制備

［預(yù)處理、粗提］乙肝疫苗制備破碎釀酒酵母，除去細胞碎片;硅膠吸附粗提HBsAg［稀釋、除菌］疏水色譜純化，硫氰酸鹽處理，稀釋和過濾除菌［檢定、甲醛處理］無菌檢查、蛋白含量測定、100μg/ml甲醛，37℃保溫［鋁吸附］［鋁佐劑］［檢定、分批、分裝和包裝］成品半成品原液發(fā)酵液粗提液2-8℃低溫鋁吸附產(chǎn)物［檢定]IFN1、概念2、分類3、臨床上常用的干擾素有哪些4、干擾素制備IFNDef：干擾素（Interferon）：由干擾素誘生劑誘導(dǎo)有關(guān)生物細胞所產(chǎn)生的一類高活性，多功能的誘生蛋白。IFN-α2、人干擾素分類類型家族染色體上位置基因數(shù)氨基酸數(shù)同源性%1型α914165-16675-85β9116629ω9＞6172-17430II型γ12117350κ9120730⑴IFN-α14個基因編碼13種IFNs，每種IFN有不同抗病毒活性和抗增殖活性；IFN-α1對B細胞瘤有較大的抗增殖活性，IFN-α2對其它腫瘤更特異；IFN-α1對人細胞的抗病毒活性低于IFN-α2

世界范圍內(nèi)用于抗腫瘤的IFNIFN-α1、IFN-α2⑵融合的IFNIFN-α1前61AA和IFN-α2的后104AA發(fā)生融合，對鼠細胞表皮具有抗病毒活性；IFN-α1前91AA與IFN-α4的后72AA融合，沒有抗病毒活性，提高小鼠的抗腫瘤活性；3、PEG化的IFN

IFN-α1在體內(nèi)的半衰期是4-8h,40KDaPEG-IFNα2a上，40KDa-IFNα2b比單獨IFN表現(xiàn)出預(yù)期改善的藥理效果。上市重組干擾素:α2a、α2b、α1b、β1b，γ；1992年我國第一個基因工程藥物IFN-α1b獲得國家一類新藥證書。研發(fā)中的重組干擾素：IFNω，臨床階段

α2a

α2b⑴體外誘生干擾素制備工藝：

Sendai病毒誘導(dǎo)人白細胞1989年，IFNα-n3/Alferon，批準上市1gIFNα，需要3億ml人血白細胞來源困難，產(chǎn)量低，價格昂貴潛在的血源性病毒污染的可能性⑵人源轉(zhuǎn)化細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：

1999年：IFNα-n1/Wellferon,批準用于臨床。優(yōu)點：首次實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。缺點：活性低，產(chǎn)量低，潛在的病毒污染。上市產(chǎn)品：1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；

1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；

2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys

表達產(chǎn)物：無糖基化，N-met，無活性包涵體工藝特點：發(fā)酵過程，變性、復(fù)性過程。⑶基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:上市產(chǎn)品：rhuIFNβ-1a1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)產(chǎn)物：166aa

糖基化蛋白，22.5kD特點：成本高，過程嚴格；分泌表達，產(chǎn)量低。⑷動物傳代細胞生產(chǎn)宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudomonasputida）上市產(chǎn)品：IFNα-2b/安福隆產(chǎn)物：無糖基化可溶性蛋白質(zhì)，具有天然分子結(jié)構(gòu)和生物活性工藝特點：發(fā)酵周期短：無需變性、復(fù)性過程。⑸基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)①構(gòu)建表達IFNα-2b的假單胞桿菌工程菌發(fā)酵液收集菌體連續(xù)流離心裂解菌體、絮凝菌體碎片、離心1、裂解液預(yù)冷2、加入裂解液,低溫攪拌2h3、加入聚乙烯亞胺、加入醋酸鈣溶液沉淀菌體碎片和DNA收集上清收集粗IFNα-2b鹽析、離心一定量的4M硫酸銨，低溫靜置過夜②粗制IFNα-2b③精制IFNα-2b

溶解低溫下，加入PH7.5的磷酸鹽緩沖液粗制IFNα-2bIFNα-2b溶液等電點沉淀、離心磷酸調(diào)PH5.0收集上清疏水層析磷酸溶液洗脫（PH4.5）洗脫液等電點沉淀、離心收集上清超濾除去大分子量、小分子量雜蛋白收集濾液陰離子交換色譜、陽離子交換色譜、凝膠過濾色譜分離合并目的峰無菌過濾、凍干后分裝、保存IFNα-2b陰離子交換層析與濃縮0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）平衡樹脂。鹽濃度線性梯度洗脫。結(jié)合SDS收集干擾素峰。除雜：10kD超濾膜，0.05M醋酸緩沖液（pH5.0）中透析。陽離子交換層析與濃縮平衡樹脂：0.1M醋酸緩沖液（pH5.0）平衡樹脂。沖洗：上樣，相同緩沖液沖洗。洗脫：鹽濃度線性梯度洗脫檢測：結(jié)合SDS收集干擾素峰。除去雜質(zhì)：10kD超濾膜。凝膠過濾層析洗滌液：0.15MNaCl-0.01M磷酸緩沖液（pH7.0）清洗系統(tǒng)和樹脂洗脫：上樣，相同緩沖液進行洗脫。合并干擾素部分胰島素

定義：胰島素是由胰島β細胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。是機體內(nèi)唯一降低血糖、促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。適用于1型糖尿病和2型糖尿病晚期病人的治療

胰島素的生物合成豬胰島素牛胰島素賴脯人胰島素（禮來公司、速效Ins）

門冬胰島素（諾和諾德公司、速效Ins）

甘精胰島素

(安萬特公司、長效Ins)人胰島素原B30A8;A10;B30

B28;B29B28A21;B31;B323DStructureofInsulin胰島素二聚體（dimer）胰島素六聚體（hexamer

）1、Mw:5807DpI:5.3～5.352、溶解度：PH4.5-6.5的范圍內(nèi)，幾乎不溶于水，易溶于稀酸和稀堿溶液，在﹤80%的乙醇中也可以溶解。3、在溶液中的狀態(tài)：二聚體和六聚體4、穩(wěn)定性：在弱酸性水溶液、中性緩沖液中穩(wěn)定；還原劑及多種金屬使Ins失活，紫外線、光氧化和超聲波會使Ins失活。Ins的性質(zhì)

胰島素制備工藝以動物胰臟為原料提取胰島素

酸醇提取法

※傳統(tǒng)胰島素豬、牛胰臟提取，只經(jīng)一步重結(jié)晶

※單峰胰島素凝膠過濾純化

※單組分胰島素凝膠過濾、離子交換純化半合成胰島素以豬胰島素為原料，酶修飾后得到人胰島素重組DNA技術(shù)生產(chǎn)人胰島素

※AB鏈合成：分別表達AB鏈，化學(xué)方法連接

※逆轉(zhuǎn)錄法：表達胰島素原，酶切得到重組人胰島素InsA鏈InsB鏈轉(zhuǎn)化大腸桿菌發(fā)酵A鏈B鏈純化二硫鍵活性胰島素AB鏈合成人胰島素重組DNA技術(shù)制造人胰島素-AB鏈合成法質(zhì)粒InsmRNA反轉(zhuǎn)錄InscDNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌PCR連接胰島素原活性胰島素二硫鍵酶切

提取質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶酶切

反轉(zhuǎn)錄酶法合成人胰島素反轉(zhuǎn)錄酶法：酵母系統(tǒng)生產(chǎn)重組胰島素

優(yōu)點：二硫鍵的位置