液相色譜(sèpǔ)基礎(chǔ)知識2017年04月11日第一頁，共21頁。一、什么(shénme)是色譜色譜是一種分離工具，而不是傳統(tǒng)意義上的分析儀器。色譜法也叫層析法，它是一種高效能的物理分離技術(shù)，將它用于分析化學(xué)并配合適當(dāng)?shù)臋z測手段，就成為色譜分析法。常見的分離方法：蒸餾、離心(líxīn)、電泳、過濾、超濾、等等。色譜法的發(fā)明人：俄國科學(xué)家：麥克海爾.塞蒙諾維奇.維茨特M.S.Tswett第二頁，共21頁。二、什么(shénme)是液相色譜呢液相色譜(sèpǔ)：流動相是液相液相色譜柱色譜紙色譜HPLC薄層色譜第三頁，共21頁。三、什么是高效(ɡāoxiào)液相色譜HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色譜法，簡稱：HPLC是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜；基于儀器方法的高效能分離手段。具有(jùyǒu)高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度的檢測器。第四頁，共21頁。HPLC的分離原理、儀器配制(pèizhì)和工作流程分離(fēnlí)原理動畫演示(yǎnshì)溶劑

色譜泵進(jìn)樣器

HPLC色譜柱檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)請單擊請單擊請單擊請單擊請單擊第五頁，共21頁。四、高效(ɡāoxiào)液相色譜法的特點“三高一廣一快”：①高壓：對載液加高,流動相能迅速通過色譜柱壓.②高效：分離效能高。③高靈敏度：紫外檢測器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在uL數(shù)量級。④應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析(fēnxī)。⑤分析(fēnxī)速度快：較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析(fēnxī)一個樣品在15—30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時。第六頁，共21頁。五、高效液相色譜法的主要(zhǔyào)類型及原理1、液-液分配色譜(sèpǔ)2、液-固吸附色譜(sèpǔ)3、離子交換色譜(sèpǔ)4、離子對色譜(sèpǔ)5、離子色譜(sèpǔ)6、排阻色譜(sèpǔ)7、親和色譜(sèpǔ)(AC)第七頁，共21頁。1、液-液分配(fēnpèi)色譜固定相與流動相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相normalphase），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相reversephase）。正相與反相的出峰順序相反(xiāngfǎn)；固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C18柱（反相柱）以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。第八頁，共21頁。反相高效(ɡāoxiào)液相色譜法即指流動相的極性大于固定相極性的色譜方法。在本法中常采用化學(xué)鍵合相作為固定相，流動相采用水—甲醇或水—乙腈系統(tǒng)，在反相色譜中，極性強(qiáng)的組分在分離時先流出柱子，極性弱的組分后流出。因此適合于共存組分極性差異(chāyì)較大的樣品分析。第九頁，共21頁。乙腈(jīng)乙腈又名甲基氰，分子式CH3CN，無色透明(tòumíng)液體，密度小于水，約為0.79，能與水和乙醇等有機(jī)溶劑以任意比混溶，易燃，有毒性。第十頁，共21頁。2、液-固吸附(xīfù)色譜基本原理：各組分在固定相吸附劑上競爭性吸附與解吸固定相：固體吸附劑為硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。特點：適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣(shìyànɡ)，對具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；缺點：非線形等溫吸附，常引起峰的拖尾第十一頁，共21頁。六、色譜(sèpǔ)柱液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進(jìn)行的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。正相柱：多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒直徑在3-10μm的范圍內(nèi).另一類正相填料是硅膠表面鍵合-CN,-NH2等官能團(tuán)即所謂(suǒwèi)的鍵合相硅膠。反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的(C18)非極性填料。也有無定型和球型之分。常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3—10μm之間。第十二頁，共21頁。1.色譜(sèpǔ)柱的選擇第十三頁，共21頁。2.本公司使用(shǐyòng)的柱子主要特點:使用(shǐyòng)過程中柱壓穩(wěn)定，即使長時間使用(shǐyòng)也不會出現(xiàn)拖尾等異常情況使用(shǐyòng)壽命長，清洗頻度低，僅為同類產(chǎn)品的15%第十四頁，共21頁。七、樣品(yàngpǐn)的前處理a、最好使用(shǐyòng)流動相溶解樣品。b、使用(shǐyòng)予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。c、使用(shǐyòng)0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。d、利用超聲儀脫氣。第十五頁，共21頁。八、流動(liúdòng)相的配制a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證(bǎozhèng)樣品組分不會沉淀在柱中

。b、流動相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。c、流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；同時降低柱壓，延長液體泵的使用壽命d、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。e、流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡。f、在流動相配制好后，使用0.45μm濾膜過濾，并進(jìn)行脫氣。第十六頁，共21頁。九、流動(liúdòng)相流速的選擇因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。當(dāng)選用最佳流速時，分析時間可能延長。可采用(cǎiyòng)改變流動相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。第十七頁，共21頁。十、檢測過程(guòchéng)的操作樣品檢測(jiǎncè)前控制平臺的準(zhǔn)備工作樣品檢測(jiǎncè)時的操作請單擊請單擊請單擊第十八頁，共21頁。十一(Shí－Yī)、HPLC常用操作步驟1)首先對流動相進(jìn)行過濾，常用的孔徑為0.22um和0.45um。2)對抽濾后的流動相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。3)正常情況下，先用甲醇沖洗10-20分鐘，然后再進(jìn)入測試用流動相。4)一般情況下，流動相沖洗20-30分鐘后，儀器和基線穩(wěn)定，方可進(jìn)樣測試。5)同時進(jìn)兩針標(biāo)樣，若結(jié)果的比值在0.98-1.02之間，可正式進(jìn)樣。6)測試結(jié)束，要進(jìn)行色譜儀及色譜柱的清洗(qīngxǐ)和維護(hù)。如流動相為緩沖試劑，要用重蒸水清洗(qīngxǐ)10-20分鐘，方可用有機(jī)相進(jìn)行保護(hù)，否則，有損色譜柱。7)關(guān)機(jī)時，先關(guān)計算機(jī)，再關(guān)液相色譜。第十九頁，共21頁。注意事項：1)流動相均需色譜純度，水用20M的去離子水。2)脫氣后的流動相不要振動(zhèndòng)，盡量不引起氣泡。3)