會(huì)計(jì)學(xué)1種質(zhì)離體保存第1頁(yè)/共30頁(yè)具有世界先進(jìn)水平的國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)內(nèi)景一角國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)內(nèi)景第2頁(yè)/共30頁(yè)國(guó)家種質(zhì)庫(kù)是全國(guó)作物種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存與研究中心。該庫(kù)在美國(guó)洛克菲勒基金會(huì)和國(guó)際植物遺傳資源委員會(huì)的部分資助下，于1986年10月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院落成，隸屬于作物品種資源研究所。由試驗(yàn)區(qū)、種子入庫(kù)前處理操作區(qū)、保存區(qū)三部分組成。種質(zhì)貯藏條件為：溫度-18℃±1℃，相對(duì)濕度<50%。第3頁(yè)/共30頁(yè)國(guó)家種質(zhì)庫(kù)保存對(duì)象是農(nóng)作物及其近緣野生植物種質(zhì)資源，這些資源是以種子作為種質(zhì)的載體，其種子可耐低溫和耐干燥脫水。國(guó)家種質(zhì)庫(kù)在接納到種子后，需對(duì)種子進(jìn)行清選、生活力檢測(cè)、干燥脫水等入庫(kù)保存前處理，然后密封包裝存入冷庫(kù)。入庫(kù)保存種子的初始發(fā)芽率一般要求高于90%，種子含水量干燥脫水至5%～7%，大豆8%。根據(jù)科學(xué)家估算，在上述貯藏條件下，一般作物種子壽命可保存50年以上。

第4頁(yè)/共30頁(yè)國(guó)家種質(zhì)庫(kù)的任務(wù)：負(fù)責(zé)全國(guó)農(nóng)業(yè)植物種質(zhì)資源的長(zhǎng)期保存，以及部分糧食作物種質(zhì)資源的中期保存。進(jìn)行低溫庫(kù)種質(zhì)安全保存基礎(chǔ)理論的研究，發(fā)展庫(kù)存種質(zhì)安全保存的預(yù)警、監(jiān)測(cè)及更新等技術(shù)。研究無(wú)性繁殖作物、頑拗型種子作物等特殊種質(zhì)的中長(zhǎng)期離體保存理論和技術(shù)，探索和發(fā)展種質(zhì)資源新的保存方法與技術(shù)。第5頁(yè)/共30頁(yè)保存對(duì)象：凡能通過(guò)種子繁殖維持物種遺傳完整性的各類(lèi)植物種質(zhì)資源，都可保存到國(guó)家種質(zhì)庫(kù)，其種子應(yīng)是耐低溫和耐干燥類(lèi)型，即正常型種子（orthodoxseeds）。第6頁(yè)/共30頁(yè)

入國(guó)家種質(zhì)庫(kù)保存種質(zhì)的基本要求●提供每份種質(zhì)材料的背景信息資料，如品種名稱(chēng)、學(xué)名（科、屬、種的拉丁文）、原產(chǎn)地、繁育條件及種植時(shí)間；●每份送交材料須提供一定數(shù)量的種子，一般3000至5000粒特殊情況可適當(dāng)減少，但不應(yīng)少于1500粒；●應(yīng)是當(dāng)季新種植收獲的種子，發(fā)芽率一般要求85%以上。種子無(wú)明顯病蟲(chóng)損害，未受損傷和拌用藥物或包衣處理；第7頁(yè)/共30頁(yè)●送交時(shí)包裝的要求：送交或郵寄種子要妥善包裝，每份材料包裝袋內(nèi)和袋外都應(yīng)有標(biāo)簽，標(biāo)明品種名稱(chēng)、統(tǒng)一編號(hào)保存單位編號(hào)。包裝要結(jié)實(shí)牢固、防漏、防潮、防混雜、防散包，以避免種子在送交或郵寄途中受損；●送交種子要清選干凈，去除破碎粒、蟲(chóng)蝕粒、無(wú)胚粒、秕粒、瘦小粒、雜粒等，雜質(zhì)不得超過(guò)2%；●送交時(shí)種子含水量的要求：禾谷類(lèi)不得超過(guò)13%；蛋白質(zhì)類(lèi)與油脂類(lèi)種子含水量應(yīng)更低一些?！裼衅渌闆r可與國(guó)家種質(zhì)庫(kù)預(yù)先聯(lián)系。第8頁(yè)/共30頁(yè)江蘇鎮(zhèn)江桑樹(shù)圃呼和浩特牧草圃浙江杭州茶樹(shù)圃國(guó)家種質(zhì)圃（包括試管苗庫(kù)）第9頁(yè)/共30頁(yè)中國(guó)野生苧麻種質(zhì)基因庫(kù)在江西建成兩位市民在江西宜春市中國(guó)野生苧麻種質(zhì)基因庫(kù)參觀。第10頁(yè)/共30頁(yè)種質(zhì)是指親代通過(guò)生殖細(xì)胞或體細(xì)胞傳遞給子代的遺傳物質(zhì)。植物種質(zhì)保存是利用天然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境，使個(gè)體中所含有的遺傳物質(zhì)保持遺傳完整性，有高的活力，能通過(guò)繁殖將其遺傳特性傳遞下去。種質(zhì)保存方式：原地保存和異地保存。前者通過(guò)建立自然保護(hù)區(qū)和天然公園里實(shí)現(xiàn)，后者通過(guò)植物園、種質(zhì)園、種子庫(kù)及離體保存來(lái)實(shí)現(xiàn)。

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第12頁(yè)/共30頁(yè)離體保存：將組織和細(xì)胞培養(yǎng)中的外植體或試管苗貯存在使其抑制生長(zhǎng)，緩慢生長(zhǎng)或無(wú)生長(zhǎng)的條件下，達(dá)到長(zhǎng)期保存的方法。離體保存的優(yōu)點(diǎn)：1、解決一些無(wú)性繁殖作物種質(zhì)資源在低溫下長(zhǎng)期保存問(wèn)題，可有效避免資源的丟失。2、節(jié)省土地和勞動(dòng)力，保存方法簡(jiǎn)單，花費(fèi)少，且能在保存中脫毒。3、在提供利用時(shí)，可快速繁殖，也有利于國(guó)際國(guó)內(nèi)種質(zhì)交換。第13頁(yè)/共30頁(yè)

一、

常溫保存在常溫（20±5）℃下，通過(guò)改變培養(yǎng)基中某些培養(yǎng)物質(zhì)的濃度，改變培養(yǎng)的環(huán)境條件，可達(dá)到保存目的。方法：§改變培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽的濃度，主要降低?！炫囵B(yǎng)基里添加甘露醇，蔗糖等物質(zhì)。§培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑．§降低培養(yǎng)環(huán)境的氧含量步驟：在保存材料上覆蓋一層礦物油如石蠟、硅酮油或液態(tài)石油。降低培養(yǎng)環(huán)境的氧分壓。第14頁(yè)/共30頁(yè)二、常低溫和低溫保存

常低溫（15-0℃）和低溫（0--50℃）保存，還可輔以改變培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，以減緩材料的生長(zhǎng)速度減緩繼代時(shí)間，故又稱(chēng)為最小生長(zhǎng)法。根據(jù)植物對(duì)溫度的耐受力確定其抑制生長(zhǎng)的保存溫度。在低溫保存時(shí)還可以結(jié)合低壓來(lái)取得更好的效果主要通過(guò)降低培養(yǎng)物周?chē)拇髿鈮?，也可以通過(guò)在正常的氣壓下加入惰性氣體而降低氧分壓。低氣壓和低氧壓都可抑制植物的生長(zhǎng)，但不會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)物表現(xiàn)型上的差異。

第15頁(yè)/共30頁(yè)三、超低溫保存

也叫冷凍保存。主要是指在液氮（-196℃）的超低溫下使細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)處于基本停止的狀態(tài)，在適宜的條件下可迅速繁殖，生出新的植株，并保持原來(lái)的遺傳特性。

第16頁(yè)/共30頁(yè)（1）冰凍保護(hù)劑

滲透型抗凍劑：二甲亞砜（DMSO）、乙二醇、乙酰胺、丙二醇、甘油。

特點(diǎn)：多屬低分子中性物質(zhì)，在溶液中易結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使溶液的的粘性增加而減少水的結(jié)晶過(guò)程，達(dá)到保護(hù)的目的。非滲透型抗凍劑：聚乙烯吡咯烷酮（pvp）、蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇等為非滲透型抗凍劑特點(diǎn)：可溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞，可在特定的溫度下降低溶質(zhì)（電解質(zhì)）濃度，從而起到保護(hù)作用。第17頁(yè)/共30頁(yè)（2）保存液組成部分：電解質(zhì)平衡鹽溶液

高滲溶液：選用葡萄糖、甘露醇、蔗糖等作為高滲劑。

營(yíng)養(yǎng)液：氨基酸、核甘類(lèi)、葡萄糖。第18頁(yè)/共30頁(yè)

（3）材料的預(yù)備和預(yù)處理

材料的生長(zhǎng)狀態(tài)和年齡的選擇培養(yǎng)細(xì)胞處于旺盛的對(duì)數(shù)分裂期液體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞以5—7天抗凍能力強(qiáng)，固體培養(yǎng)的愈傷組織以9—12天為宜存活率高野外生長(zhǎng)的植物的芽（冬天低溫鍛煉）第19頁(yè)/共30頁(yè)預(yù)培養(yǎng)：在冰凍保存前的預(yù)培養(yǎng)中加入提高抗寒力的物質(zhì)如：梨糖醇、脫落酸等，或?qū)⑴囵B(yǎng)基的糖濃度提高，這樣可以提高存活率。冰凍保護(hù)劑：由于一些冰凍保護(hù)劑的成分有毒性，冰凍保護(hù)劑預(yù)處理必須在0℃下進(jìn)行處理時(shí)間不能太長(zhǎng)，一般不超過(guò)1h。第20頁(yè)/共30頁(yè)（4）超低溫保存操作?

快速冷凍法?

慢速冷凍法?

分步冷凍法?

脫水干燥法?

化凍操作再培養(yǎng)?

生活力和存活力的測(cè)定熒光素雙醋酸酯染色法FAD

氯化三苯四氮唑法TTC第21頁(yè)/共30頁(yè)快速冷凍法：適用于培養(yǎng)物細(xì)胞體能小，胞質(zhì)濃、含水量低、液泡化程度低的材料。將植物材料從0℃或其他預(yù)處理溫度直接投入液氮罐中，降溫速度為1000℃/min以上。這種快速降溫可使細(xì)胞內(nèi)的水在迅速越過(guò)-140℃這一冰晶形成的危險(xiǎn)溫度期后，細(xì)胞內(nèi)的水形成“玻璃化”狀態(tài)，不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用。第22頁(yè)/共30頁(yè)慢速冷凍法：適用于含有大液泡的成熟細(xì)胞，這種細(xì)胞含水量高，在慢速降溫過(guò)程中，可以使細(xì)胞內(nèi)的水有充足的時(shí)間不斷地滲到細(xì)胞外結(jié)冰而避免在細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。將植物材料以0.1—10℃/min的降溫速度從0℃降到-100℃左右，而后立即浸入液氮罐中或以同樣的速度連續(xù)降溫至-196℃。第23頁(yè)/共30頁(yè)1、先慢速降溫，以0.5~4℃/min的速度將材料慢速降溫至-40℃，停留一段時(shí)間后，是材料充分脫水，然后投入液氮迅速冷凍。

2、把材料在0℃預(yù)處理后，逐級(jí)通過(guò)不同的低溫溫度一段時(shí)間，然后投入液氮管。第24頁(yè)/共30頁(yè)脫水干燥法：將培養(yǎng)材料的含水量降到一定程度，在進(jìn)入液氮罐中，這樣可使植物免遭凍死。無(wú)菌氣流中干燥、硅膠干燥、21—29℃烘箱內(nèi)真空干燥法等方法將含水量降到27-40%。玻璃化法：用高濃度的復(fù)合玻璃化保護(hù)劑使樣品脫水減輕機(jī)械損傷和溶液效應(yīng)，應(yīng)用價(jià)值高。包埋脫水法：將樣品用高濃度的蔗糖進(jìn)行預(yù)處理，包埋到海藻酸膠中，避免了二甲亞砜和甘油的毒性。第25頁(yè)/共30頁(yè)

化凍操作快速化凍：在35—40℃溫水中化凍慢速化凍：在0℃，2—3℃或室溫下進(jìn)行化凍注意事項(xiàng)：1、操作輕，避免組織和細(xì)胞的機(jī)械損傷2、將冰凍樣品試管插入溫水浴中時(shí)，注意避免管口污染；3、試管內(nèi)的冰一旦化凍后，要立即將試管移到20-25℃的水浴中，并立即迅速進(jìn)行洗滌和再培養(yǎng)。

第26頁(yè)/共30頁(yè)再培養(yǎng)：化凍后立即將材料轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上進(jìn)行再培養(yǎng)。在這過(guò)程中可以觀測(cè)細(xì)胞的增生數(shù)量，愈傷組織的形成和增長(zhǎng)情況，大小和數(shù)量的變化，新植株分化的能力等。熒光素雙醋酸酯（FAD）染色法：先配制0.1%的熒光素材料，用一滴染料和一滴化凍后的細(xì)胞懸浮液相混合，分別置于普通光學(xué)顯微鏡（觀察總細(xì)胞數(shù)）和紫外熒光顯微鏡（觀察活細(xì)胞數(shù)）下觀察和計(jì)數(shù)。TTC法（氯化三苯四氮唑）：此法顯示細(xì)胞