第八章可見分光光度法

組長：何星組員：周鑫一楊嘯肖洪楊分光光度法的基本原理光吸收的基本定律—朗伯-比耳定律分光光度計的組成可見分分光光度計的分類定量分析方法分光光度法的應(yīng)用分光光度法的基本原理

光的特性

光是一種電磁波，具有波粒二象性。光的偏振、干涉、衍射、折射等現(xiàn)象就是其波動性的反映，波長λ與頻率ν之間的關(guān)系式λν=?亦反映光的波動性。光又是由大量具有能量的粒子流組成的，稱為光子。能量與光長的關(guān)系Ε=h?/λ,可知光子的能量與光的波長有關(guān)，波長越短，光能越大；反之，光能越小。（1）光的顏色與波長人們眼睛能夠感受的光是可見光，它是電磁輻射的一小部分顏色波長/nm顏色波長/nm近紫外200～400黃綠560～580紫400～430黃580～590藍(lán)430～480橙590～620青色（藍(lán)綠）480～500紅620～760綠500～560近紅外760～2500各種顏色光的近似波長范圍（2）光的色散與互補(bǔ)當(dāng)一束白光通過光學(xué)棱鏡時，即可得到不同顏色的譜帶，這種叫光譜，這種現(xiàn)象叫光的色散。白光色散后成為紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等七色光，說明白光是由其各種色光按照一定比例混合而成的，所以叫復(fù)合光。如果兩種色光按適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度比列混合后組成白光，則這兩種色光稱為“互補(bǔ)光色”。呈直線關(guān)系的兩種光可混合成白光。例如在白色光中分離出藍(lán)光后，剩下的混合光則呈現(xiàn)黃色，因此，藍(lán)色光和黃色光為互補(bǔ)色光。物質(zhì)對光的選擇性吸收（1）物質(zhì)的顏色物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色是物質(zhì)對不同波長的光選擇性吸收的結(jié)果，物質(zhì)的顏色由透過光或反射光的顏色決定。當(dāng)一束白光通過有色溶液時，某些波長的光波的光被溶液吸收，另一些波長的光不被吸收而透過溶液。溶液的顏色由透過光波長所決定。列如，KMnO4溶液強(qiáng)烈地吸收黃綠色的光，對其他的光吸收很少或很少吸收，所以溶液呈現(xiàn)紫紅色。物質(zhì)的顏色與吸收光顏色的互補(bǔ)關(guān)系物質(zhì)的顏色黃綠黃橙紅紫紅紫藍(lán)綠藍(lán)藍(lán)綠吸收光顏色紫藍(lán)綠藍(lán)藍(lán)綠綠黃綠黃橙紅波長/nm400～450450～480480～490490～500500～560560～580580～610610～650650～760物質(zhì)對光的吸收曲線物質(zhì)對光的選擇性和吸收可用吸收光譜曲線（也稱為吸收曲線)來描述：用連續(xù)的不同波長的光照射化合物的稀溶液，部分波長的光被吸收，被吸收光的波長和吸收程度取決于物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。以波長λ為橫坐標(biāo)、吸收光度A為縱坐標(biāo)，即得吸收光譜曲線。

不同濃度的高錳酸鉀溶液吸收光譜曲線同一種物質(zhì)對不同波長光的吸光度不同。吸收度最大處對應(yīng)的波長稱為最大吸收波長λmax。②不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似，λmax不變。而對于不同物質(zhì)，他們的吸收曲線形狀和λmax則不同。③吸收曲線可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，并作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一。不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長下吸收度A有差異，在λmax處吸收度A的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。光吸收的基本定律—朗伯-比耳定律

朗伯-比耳定律:溶液的濃度愈大，通過的液厚度愈大，入射光愈強(qiáng)，則光被吸收的愈多。即物質(zhì)對光的吸收程度與液層厚度和溶液的濃度成正比，這是定量分析的依據(jù)；表達(dá)式：lg

I0/It=Kbc或A=KbcIt/I0—透射率,用符號T表示,lgI0/It—吸光度，用A表示,b—吸收池內(nèi)溶液的長度，c—溶液中吸光物質(zhì)的濃度，K—吸光系數(shù)。吸光系數(shù)的物理意義：單位濃度的溶液，當(dāng)液層厚度為1cm時，在一定波長下測得的吸光度。K值的大小取決于吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射光波長、溶液溫度和溶劑性質(zhì)等，與溶液濃度大小和液層厚度無關(guān)。光通過吸收物質(zhì)的示意圖摩爾吸光系數(shù)當(dāng)溶液的濃度以物質(zhì)的量的濃度表示，液層厚度以厘米表示時，相應(yīng)的比列常數(shù)K稱為摩爾吸光系數(shù)，以?表示，其單位為L/(mol.cm)。這樣，比爾定律可以改寫成A=?bc。摩爾吸光系數(shù)的物理意義是：濃度為1mol/L的溶液，在厚度為1cm的吸收池中，在一定波長下測得的吸光度。摩爾吸光系數(shù)表示物質(zhì)對某一特定波長光的吸收能力。?愈大，表示該物質(zhì)對某波長光的吸收能力愈強(qiáng)，測定的靈敏度也就愈高。一般認(rèn)為?<1

×10?L/(mol.cm),靈敏度較低；?在1

×10?～6

×10?L/(mol.cm),屬于中等靈敏度；?>6

×10?L/(mol.cm),屬高靈敏度。摩爾吸光系數(shù)由實驗測得。在實際測量中，不能直接取1mo/L這樣高濃度的溶液去測，只能稀溶液中測量后，換算成摩爾吸光系數(shù)。質(zhì)量吸光系數(shù)質(zhì)量吸光系數(shù)適用于摩爾質(zhì)量未知的化合物。若溶液濃度以質(zhì)量濃度ρ（g/L)表示，液層厚度以厘米（cm）表示，相應(yīng)的吸光系數(shù)則為質(zhì)量吸光系數(shù)，以α表示，其單位為L/(g.cm)。同樣朗伯-比耳定律可表示為：A=abρ偏離朗伯-比耳定律的因素當(dāng)入射光波長及光程一定時，吸收光度A與吸光物質(zhì)的濃度C呈線性關(guān)系。以某物質(zhì)的濃度C為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)，繪出A-c曲線，所得直線稱標(biāo)準(zhǔn)曲線（也稱工作曲線）。但在實際工作中，尤其當(dāng)溶液濃度較高時，標(biāo)準(zhǔn)曲線往往偏離直線，發(fā)生彎曲，這種現(xiàn)象稱為對朗伯-比耳定律的偏離。如圖：偏離朗伯-比耳定律的現(xiàn)象引起這種偏離的原因（1）物理因素引起的偏離單色光不純單色光不純引起的偏離的前提條件之一是入射光為單色光，難以獲得真正的純單色光。大多數(shù)分光光度計只能獲得近乎單色的狹窄光帶，仍是復(fù)合光。因物質(zhì)對不同波長光的吸收度不同，所以復(fù)合光引起定律的偏離。非平行光造成光的損失，使光度降低。雜散光是指從單色器分出的光不在入射光譜帶寬度范圍內(nèi)，與所選波長相距較遠(yuǎn)。雜散光來源主要有儀器本身缺陷和光學(xué)元件污染。（2）化學(xué)因素引起的偏離化學(xué)因素主要包括吸光質(zhì)點間的相互作用和化學(xué)平衡。按照朗伯-比耳定律的假設(shè)，所有的吸光質(zhì)點之間不發(fā)生相互作用。但實驗證明只有在稀溶液時才符合假設(shè)條件。當(dāng)溶液濃度較大時，吸光質(zhì)點間可能發(fā)生締合作用，直接影響對光的吸收。在實際測定中應(yīng)注意選擇適當(dāng)?shù)臐舛确秶刮舛茸x數(shù)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。

另外，溶液中存在解離、締合、互變異構(gòu)。配合物的形成等化學(xué)平衡，可導(dǎo)致吸光質(zhì)點的濃度和吸光性質(zhì)發(fā)生變化而產(chǎn)生對朗伯-比耳定律的偏離，列如：Cr2O72-+H2O?2H++2CrO42-CrO42-和Cr2O72-的顏色不同，在同波長下的ε值不同，所以當(dāng)稀釋溶液或增大PH時，平衡右移，Cr2O72-濃度下降，引起朗伯-比耳定律的偏離。分光光度計的組成

分光光度法是根據(jù)物質(zhì)對一定波長光的吸收程度來確定物質(zhì)含量的分析方法。在可見光區(qū)的分光光度法稱為可見光分光光度法。分光光度法是利用分光光度計來測量溶液的透射率或吸光度的。

分光光度計的基本部件有：光源、單色器、吸收池、檢測系統(tǒng)、信號顯示系統(tǒng)。光源→單色器→吸收池→檢測系統(tǒng)→信號顯示系統(tǒng)（1）光源光源的作用是供給符合要求的入射光。實際應(yīng)用的光源一般分為紫外光光源和可見光光源。（2單色器單色器的作用是把光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解成單色光，并能準(zhǔn)確方便地“取出”所需要的某一波長的光，它是分光光度計的心臟部分。單色器示意圖單色器主要由狹縫、色散元件和透鏡系統(tǒng)組成。其中色散元件是關(guān)鍵部分，色散元件是棱鏡和反射光柵或兩者的組合，它能將連續(xù)光譜色散成單色光。狹縫和透鏡系統(tǒng)主要是用來控制光的方向，調(diào)節(jié)光的強(qiáng)度和“取出”所需要的單色光，狹縫對單色器的分辨率起重要作用，它對單色光的純度在一定范圍內(nèi)起著調(diào)節(jié)作用。

分光光度計的單色器有棱鏡和光柵兩種。棱鏡由玻璃或石英制成。玻璃棱鏡只適用于可見光區(qū)，而石英棱鏡可用于紫外-可見的整個光譜區(qū)。（3）吸收池吸收池又稱比色皿，是用于盛放待測液和決定透光液層厚度的器件。根據(jù)光學(xué)透光面的材質(zhì)，吸收池有玻璃吸收池和石英吸收池。玻璃吸收池用于可見光光區(qū)測定；若在紫外光區(qū)測定，則必須使用石英吸收池。在實際工作中，為了消除誤差，在測量前還必須對吸收池進(jìn)行配套性檢驗。為此，必須做到以下幾點。拿取吸收池時，只能用手指接觸兩側(cè)的毛玻璃，不可接觸光學(xué)面。不能將光學(xué)面與硬物或臟物接觸，只能用擦鏡紙或絲綢擦拭光學(xué)面。凡含有腐蝕玻璃的物質(zhì)的溶液，不得長時間盛放在吸收池中。吸收池使用應(yīng)立即用水沖洗干凈。有色物污染可以用3mol/LHCl和等體積乙醇的混合液浸泡洗滌不得在火焰或電爐上加熱或烘烤吸收池。（4）檢測器檢測器又稱接收器，其作用是對透過吸收池的光作出響應(yīng)，并把它轉(zhuǎn)變成電信號輸出，其輸出電信號大小與透過光的強(qiáng)度成正比。常用的檢測器光電池、光電管、光電倍增管等，對光電轉(zhuǎn)換器的要求是：光電轉(zhuǎn)換有恒定的函數(shù)關(guān)系，響應(yīng)靈敏度要高、速度要快，噪音低、穩(wěn)定性高，產(chǎn)生的電信號易于檢測放大等。光電管工作電路示意圖（5）顯示系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換器產(chǎn)生的各種電信號，經(jīng)放大等處理后，用一定方式顯示出來，以便于計算和記錄?？梢姺止夤舛扔嫷姆诸?/p>

1單光束分光光度計

單光束分光光度計的光路示意圖如圖所示，經(jīng)單色器分光后的一束平行光，輪流通過參比溶液和樣品溶液，以進(jìn)行吸光度的測定。這種分光光度計結(jié)構(gòu)簡單、操作方便、容易維修，用于常規(guī)分析。國產(chǎn)721型、722型分光光度計等均屬于此類光度計。721型分光光度計示意圖2.雙光束分光光度計雙光束分光光度計的光路，經(jīng)單色器分光后由扇形鏡分解為強(qiáng)度相等的兩束光，一束通過參比池，另一束通過樣品池，光度計能自動比較兩束光的強(qiáng)度，此比值即為試樣的透射率，經(jīng)對數(shù)變換將它轉(zhuǎn)換成吸收度并作為波長的函數(shù)記錄下來。由于兩束光同時分別通過參比池和樣品池，還能自動消除光源強(qiáng)度變化引起的誤差。3.雙波長分光光度計雙波長分光光度計是一種新型的分光光度計，能把同一光源發(fā)出的光通過一個特別的單色器，把光調(diào)成兩束不同波長的光，經(jīng)過切光器，使其交替通過吸收池，再至檢測器，通過電子系統(tǒng)可以測出樣品與參比的吸光度值，從而計算出被測組分的濃度。優(yōu)點是可以消除人工配制的空白溶液與基底之間的差別而引起的誤差，還能測定混合物溶液的吸光度。雙波長分光光度計的原理示意圖儀器波長的檢驗與校正按照分光光度計使用的步驟，以空氣作參比，以譜釹光片進(jìn)行波長的校正，具體步驟如下：

（1）調(diào)節(jié)好儀器后，在波長500~540nm范圍內(nèi)，每隔2nm測一次吸光度，找出吸光度最大時應(yīng)的波長示值(λ測)。

（2）當(dāng)|λ測-529|?3nm時，應(yīng)仔細(xì)調(diào)節(jié)波長調(diào)節(jié)螺絲，再按（1）的方法測定。重復(fù)以上兩步操作，直至λ=529對應(yīng)的吸光度最大。（3）波長矯正之后，就可以使用該儀器進(jìn)行測定了。吸收池配套性的檢查:石英吸收池在波長220nm處裝蒸餾水，在波長350nm處裝0.001mol/L的K2Cr2O7的HClO4溶液；玻璃吸收池在波長600nm處裝蒸餾水，在波長400nm處裝0.001mol/L的K2Cr2O7的HClO4溶液。以一個吸收池為參比，調(diào)節(jié)T為100%，測量其他各吸收池的透射率。透射率的偏差小于0.5%吸收池可配成一套?？梢姺止夤舛扔嫷娜粘＞S護(hù)與保養(yǎng)（1）對儀器的工作環(huán)境的要求應(yīng)安放在穩(wěn)定的工作臺上，室溫保持在15~28℃，室內(nèi)應(yīng)干燥，相對濕度宜控制在45％~75％（不超過80%）。室內(nèi)無腐蝕氣體（如SO2,NO2及酸霧），應(yīng)于化學(xué)分析操作室隔開，室內(nèi)光線不宜過強(qiáng)。（2）儀器保養(yǎng)和維護(hù)方法儀器工作電源一般允許（220±22）V的電壓波動。為了延長光源使用壽命，在不使用時不要開光燈源，光度減弱及時換新燈，手不要直接接觸燈泡，若接觸了應(yīng)用無水乙醇擦拭。單色器是儀器的核心部分，裝在密封盒內(nèi)，不能拆開，還應(yīng)及時更換單色器內(nèi)的干燥劑。必須正確使用吸收池，保護(hù)吸收池光學(xué)面。電轉(zhuǎn)換元件不能長時間曝光，應(yīng)避免光照射或受潮積塵。定量分析方法1.工作曲線法

工作曲線法又稱標(biāo)準(zhǔn)曲線法，它是實際工作中使用最多的一種定量方法。工作曲線的繪制方法是：配置四個以上濃度不同的待測組分的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以空白溶液為參比溶液，在選定的波長下，分別測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制曲線，此曲線即稱為工作曲線。在相同條件下對待測試樣進(jìn)行顯色反應(yīng)，并測定其吸收光度Ax。再從坐標(biāo)曲線上查找試樣中待測組分的含量mx。若式樣本身為有色的，則無需顯色反應(yīng)。2.比較法這種方法是用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（?s），在一定條件下，測得其吸光度As，然后在相同條件下測得試液?x的吸光度Ax。設(shè)試液、標(biāo)準(zhǔn)溶液完全符合朗伯-比耳定律：3.多組分定量

多組分是指在被測溶液中含有兩個或兩個以上的吸光組分。對于多組分的試液，如果各種吸光物質(zhì)之間沒有相互作用，且服從朗伯-比耳定律，這時體系的總吸光度等于各組分吸光度之和，即吸光度具有加和性，由此可得：A總=A1+A2+…An=ε1bc1+ε2bc2…+εnbcn進(jìn)行多組分混合物定量分析的依據(jù)是吸光度的加和性。假設(shè)溶液中同時存在兩種組分a和b，他們的吸收光譜一般有三種情況。（1）吸收光譜曲線不重疊，或在a組分的最大吸收波長處b不吸收，在b組分的最大吸收波長處a不吸收，則可分別在波長λ1和λ2處測定組分a和b，而相互不產(chǎn)生干擾。（2）吸收光譜曲線部分重疊，在a組分的最大吸收波長處b不吸收，在b組分的最大吸收波長處a有吸收，則可看作a組分的單組份溶液，在波長λ1處測定組分a。（3）吸收光譜曲線重疊時，可選定兩個波長λ1和λ2，并分別在λ1和λ2處測定吸光度A1和A2，根據(jù)吸光度的加和性，可得:

式中，Ca、Cb分別為a組分和b組分的濃度,畫藍(lán)色線的分別表示組分a和b在波長λ1處的摩爾吸光系數(shù)，紫色線分別表示為組分a和b組分在波長λ2處的摩爾吸光系數(shù)。高含量組分的測定—示差分光光度法

一般分光光度法僅適用于微量組分的測定，對于常量或高含量組分的測定則會產(chǎn)生較大的誤差。這是因為待測組分濃度過高時，會偏離朗博-比耳定律，也會因超過適宜的讀數(shù)范圍而產(chǎn)生較大的誤差，使結(jié)果準(zhǔn)確度降低。示差分光光度法與普通光度法主要區(qū)別在于它們所采用的參比溶液不同。示差法一般采用一個合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比溶液來調(diào)節(jié)光度計標(biāo)尺讀數(shù)以進(jìn)行測量。

設(shè)待測溶液的濃度為cx，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為cs。示差法測定時，首先用標(biāo)準(zhǔn)溶液cs作參比調(diào)節(jié)儀器透射率T為100%（A=0），然后測定待測溶液的吸光度，該吸光度為相對吸光度ΔA。列如