RNAi介導(dǎo)的抗麥長(zhǎng)管蚜轉(zhuǎn)基因小麥的培育梁榮奇，副教授植物遺傳育種系第三期學(xué)術(shù)沙龍2014年6月26日1立論依據(jù)2材料和方法3結(jié)果與分析3.1羧酸酯酶基因3.2脂蛋白酯酶基因3.3嗅覺(jué)相關(guān)蛋白Gqa基因4結(jié)論匯報(bào)提綱1.1小麥蚜蟲是小麥生產(chǎn)中影響產(chǎn)量和品質(zhì)的主要害蟲1立論依據(jù)對(duì)抽穗以及灌漿期的小麥影響最大，平均每年造成小麥減產(chǎn)10%左右，嚴(yán)重的年份造成產(chǎn)量損失約30%，現(xiàn)已成為小麥主要害蟲。麥蚜危害后可降低小麥面粉的出粉率、面粉營(yíng)養(yǎng)成分（總氨基酸含量、總蛋白質(zhì)含量及微量元素含量）、面團(tuán)特性（穩(wěn)定時(shí)間、延伸性、筋力、彈性指數(shù)）等品質(zhì)指標(biāo)顯著下降。1立論依據(jù)麥長(zhǎng)管蚜麥二叉蚜禾谷縊管蚜SitobionavenaeSchizaphisgraminum

Rhopalosiphumpadi

EnglishGrainAphid

Greenbug麥長(zhǎng)管蚜多在植物上部葉片正面為害，抽穗灌漿后，迅速增殖，集中穗部為害。麥二叉蚜喜在作物苗期為害，被害部形成枯斑，其他蚜蟲無(wú)此癥狀。王春芝，3種小麥蚜蟲的形態(tài)識(shí)別與防治技術(shù)，農(nóng)技服務(wù)，2008，25（3）：50,58

1.2防治麥蚜蟲或者其他害蟲主要還是依靠化學(xué)殺蟲劑，導(dǎo)致蚜蟲天敵殺傷嚴(yán)重，環(huán)境污染加劇。

拔節(jié)期：百株蚜量500頭（或30-60頭/平米）1）高效25%阿維·烯啶蟲胺；2）抗蚜威可濕性粉劑

；3）吡蟲啉可濕性粉劑

孕穗期、灌漿期：有蚜株率15%（或10頭/株）

1）菊馬乳油；2）百蚜凈；3）保得豐；4）蚜必殺；5）劈蚜60毫升；6）吡蚜酮可濕性粉劑；7）啶蟲脒乳油；8）熏蒸類：敵敵畏、烯炔菊酯有機(jī)磷類；氨基甲酸酯類；菊酯類

化學(xué)防治具有成本高、易殘留、污染環(huán)境、誤傷天敵及益蟲、長(zhǎng)期大量使用農(nóng)藥使害蟲產(chǎn)生抗藥性等諸多弊端。1立論依據(jù)

1.3

轉(zhuǎn)基因抗蚜蟲是解決蟲害的“綠色、安全、環(huán)境友好”途徑之一。植物凝集素對(duì)刺吸式口器害蟲以及線蟲有強(qiáng)烈的毒性。

1立論依據(jù)馬爾比基氏管凝集素與昆蟲的腸上皮細(xì)胞結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)到血液中腸是唯一含有暴露細(xì)胞的表面的腸道，而且是在循環(huán)系統(tǒng)（血淋巴）和腸道中物質(zhì)交換的主要場(chǎng)所。1.4利用RNAi技術(shù)改良小麥的抗蚜性1立論依據(jù)

用外源性dsRNA沉默或破壞害蟲體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育或生殖相關(guān)的重要基因，從而導(dǎo)致害蟲發(fā)育停滯、異?；蛘咧苯赢a(chǎn)生致死作用，進(jìn)而達(dá)到控制靶標(biāo)害蟲種群的目的。利用植物介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)特異抑制昆蟲防御基因、生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵基因的表達(dá)，已經(jīng)成為開(kāi)發(fā)安全高效轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的新方向，該法對(duì)環(huán)境及其他生物的負(fù)面影響小，害蟲不易產(chǎn)生抗藥性等。8雙鏈RNA(dsRNA)的導(dǎo)入方法方法特點(diǎn)靶標(biāo)害蟲參考文獻(xiàn)1浸泡法將體外合成dsRNA加入害蟲生活環(huán)境水生昆蟲及其卵和蛹Eatonetal.,2002；MarchandBentley,20072注射法將體外合成dsRNA注射到昆蟲體腔內(nèi)，再滲透或轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，從而引起靶基因mRNA的降解線蟲、昆蟲如蟋蟀、赤擬谷盜、德國(guó)小蠊、家蠶、甜菜夜蛾Bucheretal.2002；Cruzetal．2007；Muttietal．2006；

Tomoyasuetal.2008；Chengetal.2008；Ohnishietal.20083病毒介導(dǎo)法利用重組病毒侵染害蟲，在害蟲體內(nèi)產(chǎn)生dsRNA4飼喂法通過(guò)攝食，體外合成dsRNA自然進(jìn)入昆蟲體內(nèi)膜翅目昆蟲蜜蜂、鱗翅目昆蟲小菜蛾和棉鈴蟲等害蟲蚜蟲Baumetal.2007；Kumaretal.2009；Maoetal.2009；Zhaoetal,2009王暉等,2012Anetal,2012Dengetal,20145轉(zhuǎn)基因植物法在植物體中表達(dá)含有目標(biāo)病蟲基因的hpRNA介導(dǎo)的RNAi水稻褐飛虱桃蚜麥蚜Zhaoetal,2011Maoetal,2013XUetal,2014目前已知的蚜蟲基因及其功能1立論依據(jù)1立論依據(jù)研究目標(biāo)以顯著抑制麥長(zhǎng)管蚜生長(zhǎng)發(fā)育或有明顯致死效應(yīng)的候選靶標(biāo)基因，創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因抗蚜小麥種質(zhì)，為小麥蚜害的防治提供重要參考信息。研究?jī)?nèi)容技術(shù)路線1立論依據(jù)2材料和方法3結(jié)果與分析3.1羧酸酯酶基因3.2脂蛋白酯酶基因3.3嗅覺(jué)相關(guān)蛋白Gqa基因4結(jié)論匯報(bào)提綱蚜量比值=某材料的蚜量－全部觀測(cè)材料的平均蚜量2.1田間抗蚜鑒定X=x代表某個(gè)株系的單分蘗蚜蟲發(fā)生量，a1、a2…a10分別代表不同單株整株某個(gè)時(shí)期蚜蟲發(fā)生量，b1、b2…b10分別代表相應(yīng)單株的分蘗數(shù)單分蘗蚜蟲發(fā)生量（X）：培養(yǎng)皿離體葉片接種蚜蟲2.2室內(nèi)抗蚜鑒定人工氣候室幼苗接種蚜蟲蚜口密度抑制率%＝（對(duì)照植株蟲數(shù)－轉(zhuǎn)化植株蟲數(shù)）/對(duì)照植株蟲數(shù)×100%平均蚜口密度抑制率%＝各個(gè)克隆的蚜口密度抑制率之和

/克隆個(gè)數(shù)×100%繁殖率：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)繁殖成功得到成活個(gè)體的數(shù)目。1立論依據(jù)2材料和方法3結(jié)果與分析3.1羧酸酯酶基因3.2脂蛋白酯酶基因3.3嗅覺(jué)相關(guān)蛋白Gqa基因4結(jié)論匯報(bào)提綱羧酸酯酶水解示意圖3.1利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜羧酸酯酶基因

羧酸酯酶（Carboxylesterases，CarE)是一個(gè)多功能酶系，其活性中心含有Ser殘基，能夠有效的水解酯類（羧酸酯類和硫酯類）、酰胺類化合物。屬于絲氨酸酯酶家族。不同種屬間的昆蟲羧酸酯酶氨基酸序列同源性則相對(duì)較低。171.昆蟲的抗性機(jī)制

與多種藥物、環(huán)境毒物及致癌物的解毒和代謝有關(guān)2.參與昆蟲信息素和激素的降解3.參與神經(jīng)形成與發(fā)育的調(diào)節(jié)4.參與脂類的運(yùn)輸和代謝昆蟲羧酸酯酶的生物學(xué)功能3.1利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜羧酸酯酶基因3.1.1不同齡期蚜蟲CbEE4表達(dá)量分析3.1利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜羧酸酯酶基因

2齡→33%3齡→53%4齡→156%成蟲→303%RelativeCbEE4mRNAexpressionlevelatdifferentaphidgrowthstages.ExpressionlevelsofCbEE4increasedfrominstar1throughtotheadultstage.3.1.2辛硫磷對(duì)麥長(zhǎng)管蚜CbEE4表達(dá)量的影響3.1利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜羧酸酯酶基因100ｕmol/L→34.4%200ｕmol/L→78.2%qRT-PCRanalysisofCbEE4transcriptsintheadultlarvaesprayedwithdifferentconcentrationsofPhoximsolutionfor1h.TheCbEE4wasmorehighlyexpressedinsamplestreatedwiththe200lMPhoximsolutionthaninsamplestreatedwiththe100lMsolution.12

M2

麥長(zhǎng)管蚜總RNA1-2：麥長(zhǎng)管蚜總RNART-PCR獲得CbEE4片段M：2000bpLadder，1：PCR擴(kuò)增結(jié)果0.350kb1)麥長(zhǎng)管蚜CbEE4基因片段的獲得

3.1利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜羧酸酯酶基因3.1.3CbEE4基因片段的獲得及載體構(gòu)建SaCbE-s1SaCbE-a1桃蚜羧酸酯酶基因（GenBank：X74554）

2)麥長(zhǎng)管蚜與桃蚜CbEE4序列比對(duì)有61個(gè)堿基與桃蚜（GenBank：X74554）mRNA不同，同源性達(dá)到83.1%。3.1利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜羧酸酯酶基因3)目的片斷反向插入FAD2Intron1的下游460bpM1

AtFAD2I9FAtFAD2I9R擬南芥FAD2基因的內(nèi)含子（GenBankNO.AJ27184.1）SaCbE-s1/AtFAD2I9FPCR擴(kuò)增3.1利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜羧酸酯酶基因4)目的片斷正插入FAD2Intron1的上游M1505bpSaCbE-s1/AtFAD2I9RPCR擴(kuò)增3.1利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜羧酸酯酶基因5)插入啟動(dòng)子和終止子

4.0kb1.8kb1.8kb4kb3M12

KpnI、BamHI酶切驗(yàn)證

M：1kbLadder；

1：KpnI、BamHI酶切pBSK-CbEE4R；

2：KpnI、BamHI酶切pBAC-rbcs-pta；

3：KpnI、BamHI酶切pBAC-rbcs-CbEE4.以番茄核酮糖-1,5-二磷羧化酶小亞基(smallsubunitofribulose-1,5-bisphospatecarboxylase，rbcS)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)RNAi構(gòu)件在葉肉細(xì)胞特異表達(dá)3.1利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜羧酸酯酶基因愈傷組織篩選分化生根壯苗利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜羧酸酯酶基因3.1.4轉(zhuǎn)基因小麥的獲得共轉(zhuǎn)化3.1.5轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定

987654321-+M轉(zhuǎn)基因植株AtFAD-s1/AtFAD-a1PCR檢測(cè)結(jié)果M：2000bpLadder；+：pBAC-rbcs-CbEE4；—：未轉(zhuǎn)基因小麥；泳道1-9：轉(zhuǎn)基因植株株系987654321-+M轉(zhuǎn)基因植株SaCbE-s1/SaCbE-a1PCR檢測(cè)結(jié)果M：2000bpLadder；+：pBAC-rbcs-CbEE4；—：未轉(zhuǎn)基因小麥；泳道1-9：轉(zhuǎn)基因植株株系3.1利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜羧酸酯酶基因3.1.6轉(zhuǎn)基因株系對(duì)蚜蟲CbEE4表達(dá)量的影響

1d

3d

5ddsCbE1-5→18.9%19.1%45.8%dsCbE2-2→37.3%101.9%102.8%3.1利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜羧酸酯酶基因3.1.7轉(zhuǎn)基因株系對(duì)麥長(zhǎng)管蚜CbEE4活性的影響利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜羧酸酯酶基因EnzymeactivityofS.avenaeCbEE4inducedbywheat-mediatedRNAiAphidsfedontransgenicdsCbE1-5anddsCbE2-2leavesfor5and7dayswereharvestedandmeasuredforCbEE4activitybyuseofspectrophotometry.bDegradationofPhoximsolutionbyCbEE4enzymesolutionEnzymeextractsofdsCbE1-5,dsCbE2-2,andcontrolleaveshydrolyzed30,20,and60%ofthePhoximsolution,respectively.3.1利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜羧酸酯酶基因3.1.8轉(zhuǎn)基因株系對(duì)麥長(zhǎng)管蚜繁殖率的影響dsCbE1-5→31.9%dsCbE2-2→45.2%Thenumbersofnymphsproducedbytheaphidsanalyzedfordown-regulationofCbEwerecountedandcomparedwiththenumberofnymphsproducedfromaphidsfedonthecontrol.3.1利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜羧酸酯酶基因小結(jié)3.1利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜羧酸酯酶基因?qū)⒀料x羧酸酯酶（Carboxylesterase，CarE）的RNAi載體轉(zhuǎn)化小麥，利用植物介導(dǎo)RNAi策略培育轉(zhuǎn)基因小麥；

將轉(zhuǎn)基因葉片飼喂麥長(zhǎng)管蚜，可以特異干擾蚜蟲CarE基因的表達(dá)，降低蚜蟲對(duì)無(wú)機(jī)磷農(nóng)藥耐受力，從而顯著抑制麥長(zhǎng)管蚜的繁殖率。LanjieXu,XiaoliangDuan,YanhuaLv,XiaohuaZhang,ZhanshengNie,ChaojieXie,ZhongfuNi,RongqiLiang*.Silencingofanaphidcarboxylesterasegenebyuseofplant-mediatedRNAiimpairsSitobionavenaetoleranceofPhoximinsecticides.TransgenicResearch,2014,23(2):389-396.梁榮奇等。表達(dá)抑制麥長(zhǎng)管蚜羧酸酯酶的發(fā)卡RNA的DNA分子及其應(yīng)用。申請(qǐng)?zhí)枺?01310552870.5，申請(qǐng)日期：2013-11-081立論依據(jù)2材料和方法3結(jié)果與分析3.1羧酸酯酶基因

3.2脂蛋白酯酶基因3.3嗅覺(jué)相關(guān)蛋白Gqa基因4結(jié)論匯報(bào)提綱

脂蛋白脂酶（lipoproteinlipase，LPL，EC3.1.1.34）是脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，主要催化乳糜微粒和極低密度脂蛋白中的甘油三酯水解，產(chǎn)生供組織利用的脂肪酸和單酰甘油。LPL基因突變影響LPL活性，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂。3.2利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜LPL和Gqa基因G蛋白（Gqa）位于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的樞紐地位，參與細(xì)胞的代謝、分泌、生長(zhǎng)、增殖等幾乎所有的基本生命過(guò)程。脂蛋白脂酶G蛋白123MRT-PCR獲得LPL片段

M：2000bpLadder，1-3：PCR擴(kuò)增結(jié)果

0.543kb3.2.1LPL和Gqa基因的克隆M1RT-PCR獲得Gqa片段（約0.533kb）M：2000bp，Ladder；1：引物3.2利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜LPL和Gqa基因3.2.2LPL和Gqa基因序列分析GenBank：XM-0019507372→86.79%GenBank：XM-001944358.2→75.37%GenBank：FF314537→78.86%LPL基因序列分析3.2利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜LPL和Gqa基因麥長(zhǎng)管蚜（GenBank：EF638906）序列同源性達(dá)到98.1%。Gqa基因序列分析結(jié)果3.2利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜LPL和Gqa基因3.2.3麥長(zhǎng)管蚜LPL和Gqa基因表達(dá)量分析2齡→7.4%，3齡→0.6%，4齡→14.6%，成蟲→5.7%LPL基因2齡→12.5%，3齡→0.01%，4齡→21.5%，成蟲→10.1%Gqa基因3.2利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜LPL和Gqa基因3.2.4轉(zhuǎn)基因株系對(duì)LPL和Gqa表達(dá)量的影響dsLPL-1→5天→達(dá)27.6%dsLPL-4→5天→11.4%1天→6.8%3天→11.4%7天→12.8%。3.2利用RNAi干擾麥長(zhǎng)管蚜LPL和Gqa基因3.2.5轉(zhuǎn)基因株系對(duì)麥長(zhǎng)管蚜繁殖率的影響天/蚜蟲（頭）3天6天10天13天17天CK10153562.5175dsLPL-41059.457