雙鏈DNA的復(fù)制:(±)DNA→(±)DNA單鏈DNA的復(fù)制:+DNA→-DNA→±DNA→+DNA雙鏈RNA的復(fù)制:

±RNA→+RNA→-RNA→±RNA+RNA復(fù)制:+RNA→-RNA→±RNA→+RNA-RNA復(fù)制:-RNA→+RNA(mRNA)→Pr(RNA復(fù)制酶)逆轉(zhuǎn)錄病毒單鏈RNA的復(fù)制:+RNA→(-)DNA→(±)DNA→+RNA腫瘤病毒

病毒核酸的復(fù)制噬菌體的成熟(maturity)過程實(shí)際上是其已合成的各部件的裝配(assembly)過程。在T4噬菌體的裝配過程中，約有30個(gè)不同的蛋白和至少47個(gè)基因參與。具體過程可見圖。主要步驟有：DNA分子的縮合→通過衣殼包裹DNA而形成頭部→尾絲和尾部的其他部件獨(dú)立裝配完成→頭部與尾部相結(jié)合→最后裝上尾絲。至此，一個(gè)個(gè)成熟的、大小相等的噬菌體粒子就裝配完成了。(4)成熟(裝配)

當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)的大量子代噬菌體已成熟后，由于水解細(xì)胞膜的脂肪酶和水解細(xì)胞壁的溶菌酶的作用，從細(xì)胞內(nèi)部促進(jìn)了細(xì)胞的裂解，從而實(shí)現(xiàn)了噬菌體的釋放(release)。（大量噬菌體吸附在同一宿主細(xì)胞表面并釋放大量的溶菌酶，最終因外在原因?qū)е录?xì)胞裂解的現(xiàn)象為自外裂解）每一個(gè)宿主細(xì)胞裂解后所產(chǎn)生的子代噬菌體量稱裂解量（burstsize)。不同的噬菌體有不同的裂解量，例如，T2為150左右，T4約100，?X174約1000，而f2則可高達(dá)10000左右。(5)裂解(釋放)

一種噬菌體感染大腸桿菌在菌苔上逐步形成的噬菌體群體，由于其侵蝕宿主細(xì)胞的結(jié)果，會(huì)使菌苔上出現(xiàn)一個(gè)個(gè)噬菌斑。因每種噬菌體的噬菌斑有一定的形狀、大小、邊緣和透明度，故可用作鑒定的指標(biāo)，也可利用噬菌斑進(jìn)行純種分離和計(jì)數(shù)。這種情況甚像利用菌落可進(jìn)行有關(guān)微生物的分離、計(jì)數(shù)和鑒定那樣。所不同的是噬菌體只形成“負(fù)菌落”。據(jù)測(cè)定，一個(gè)直徑僅為2mm的噬菌斑，其中噬菌體粒子的數(shù)目即高達(dá)107~109個(gè)。.

效價(jià)(titre，titer)這一名詞在不同的場(chǎng)合有其不同的含義。在這里，效價(jià)表示每毫升試樣中所含有的侵染性的噬菌體粒子數(shù)，也即噬菌斑形成單位(pfu，plaque-formingunit)數(shù)或感染中心(infectivecentre)數(shù)。2.噬菌體效價(jià)的測(cè)定由于試祥中一般噬菌體粒子含量較高，故應(yīng)先對(duì)試樣進(jìn)行梯級(jí)稀釋，然后再選用合適的方法（見以下表解)測(cè)定其效價(jià)。雙層平板法是一種被普遍采用并能精確測(cè)定效價(jià)的方法。預(yù)先分別配制含2%和1%瓊脂的底層培養(yǎng)基和上層培養(yǎng)基。先用前者在培養(yǎng)皿上澆一層平板，再在后者(須先融化并冷卻到45℃以下)中加入較濃的對(duì)數(shù)期敏感菌和一定體積的待測(cè)噬菌體樣品，于試管中充分混勻后，立即倒在底層平板上鋪平待凝，然后保溫。一般經(jīng)十余小時(shí)后即可進(jìn)行噬菌斑計(jì)數(shù)?，F(xiàn)把雙層平板法簡(jiǎn)括如下:雙層平板法主要有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)；①加了底層培養(yǎng)基后，可使原來(lái)底面不平的玻璃皿的缺陷得到了彌補(bǔ)；②所形成全部噬菌體斑都接近處于同一平面上，因此不僅每一噬菌斑的大小接近、邊緣清晰，而且不致發(fā)生上下噬菌斑的重疊現(xiàn)象(下圖)；③因上層培養(yǎng)基中瓊脂較稀，故形成的噬菌斑較大，更有利于計(jì)數(shù)。一步生長(zhǎng)曲線：定量描述烈性噬菌體生長(zhǎng)規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲線稱為一步生長(zhǎng)曲線。潛伏期，裂解期，平穩(wěn)期。效價(jià)3.一步生長(zhǎng)曲線指噬菌體的核酸侵入宿主細(xì)胞后至第一個(gè)噬菌體粒子裝配前的一段時(shí)間，故整段潛伏期中沒有一個(gè)成熟的噬菌體粒子從細(xì)胞中釋放出來(lái)。潛伏期又可分兩段：①隱晦期(eclipsephase），指在潛伏期前期人為地(用氯仿)裂解細(xì)胞，裂解液仍無(wú)侵染性的一段時(shí)間。②胞內(nèi)累積期(intracellularaccumulationphase)，又稱潛伏后期。指在隱晦期后，如人為地裂解細(xì)胞，其裂解液已出現(xiàn)侵染性的一段時(shí)間。這是菌體開始裝配的時(shí)期，在電鏡下可觀察到己初步裝配好的噬菌體粒子。(1)、潛伏期緊接在潛伏期后的一段宿主細(xì)胞迅速裂解、溶液中噬菌體粒子急劇增多的一段時(shí)間。噬菌體或其他病毒因沒有個(gè)體生長(zhǎng)，只有個(gè)體裝配再加上其宿主細(xì)胞裂解的突發(fā)性，因此，從理論上來(lái)分析，裂解期應(yīng)是瞬時(shí)的。但事實(shí)上因?yàn)榧?xì)菌群體中各個(gè)細(xì)胞的裂解不可能是同步的，故實(shí)際上的裂解期還是較長(zhǎng)的（見圖）。(2)裂解期

指感染后的宿主已全部裂解，溶液中噬菌體效價(jià)達(dá)到最高點(diǎn)后的時(shí)期。(3)平穩(wěn)期(plateau)一步生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)最早由Ellis和Delbruck(1939)所設(shè)計(jì)。其基本步驟是：用噬菌體的稀懸液去感染高濃度的宿主細(xì)胞，以保證每個(gè)細(xì)胞至多不超過一個(gè)噬菌體吸附。經(jīng)數(shù)分鐘吸附后，混合液中加入一定量的該噬菌體的抗血清，借以中和尚未吸附的噬菌體。然后用保溫的培養(yǎng)液稀釋此混合液，同時(shí)可中止抗血清的作用。隨即置于該細(xì)菌最適生長(zhǎng)溫度下培養(yǎng)。在一定的時(shí)間內(nèi)，每隔數(shù)分鐘從混合懸液中取出一份試樣，并作效價(jià)測(cè)定。（1）溫和噬菌體吸附并侵入宿主細(xì)胞后，噬菌體的DNA只整合在宿主的基因組上，并可長(zhǎng)期隨宿主DNA的復(fù)制而進(jìn)行同步復(fù)制，因而在一般情況下不進(jìn)行增殖和引起宿主細(xì)胞裂解的噬菌體，稱溫和噬菌體(temperatephage)或溶源噬菌體（lysogenicphage)。這種溫和噬菌體侵入宿主細(xì)胞而不引起宿主細(xì)胞裂解，即稱溶源性或溶源現(xiàn)象。其宿主細(xì)胞稱為溶原菌。4.溶源性概括地說，溫和噬菌體的特點(diǎn)為：①、具有整合能力，當(dāng)溫和噬菌體侵入其敏感宿主的細(xì)胞后，前者的核酸可整合到后者的核基因組(genome，即核染色體)上，這種處于整合態(tài)的噬菌體核酸，稱作前噬菌體(prophage）；②、具有同步復(fù)制能力，前噬菌體在一般情況下不進(jìn)行復(fù)制和增殖，而是隨宿主細(xì)胞的核基因組的復(fù)制而同步復(fù)制，并平均分布到兩個(gè)子代細(xì)胞中去，如此代代相傳。③、免疫性由此可見，溫和噬菌體的存在形式有三種：①、游離態(tài)：指已成熟釋放并有侵染性的游離噬菌體粒子；②、整合態(tài)：指整合在宿主核染色體上處于前噬菌體的狀態(tài)（一種潛伏的形式）③、營(yíng)養(yǎng)態(tài)：指前噬菌體經(jīng)外界理化因子誘導(dǎo)后，脫離宿主核基因組而處于積極復(fù)制和裝配的狀態(tài)。溫和噬菌體的種類很多，常見的有E.coli的λMu-1、P-1和P-2噬菌體等。其中，λ噬菌體是研究最為透徹的一種溫和噬菌體。E.coliK12(λ):表示一株帶有λ前噬菌體的大腸桿菌的K12溶源菌株。（2）溶源菌(1ysogen或lysogenicbacteria)溶源菌有以下幾個(gè)特性：①自發(fā)裂解，在溶源菌的分裂過程中，會(huì)有10-2~10-5個(gè)細(xì)胞發(fā)生自發(fā)裂解(spontaneouslysis），其原因是由于少數(shù)細(xì)胞中原來(lái)處于整合態(tài)的前噬菌體轉(zhuǎn)變成營(yíng)養(yǎng)態(tài)的裂解性噬菌體(lyticphage)之故；②復(fù)愈，在溶源性細(xì)菌群體的增殖過程中，一般有10-5的個(gè)體喪失其前噬菌體，并成為非溶源性的細(xì)菌，這一過程稱為復(fù)愈或非溶源化，復(fù)愈后的細(xì)胞其免疫性也隨之喪失；③免疫性還有其他特征，以后的章節(jié)將有陸續(xù)介紹。在自然界中各種細(xì)菌、放線菌等都有溶源菌存在。檢驗(yàn)溶源菌的方法：是將少量溶源菌與大量的敏感性指示菌（遇溶源菌裂解后所釋放的溫和噬菌體會(huì)發(fā)生裂解性生活周期者）相混合，然后與瓊脂培養(yǎng)基混勻后倒一平板。過一段時(shí)間后溶源菌就長(zhǎng)成菌落。由于在溶源菌分裂過程中有極少數(shù)個(gè)體會(huì)發(fā)生自發(fā)裂解，其釋放的噬菌體可不斷侵染溶源菌菌落周圍的指示菌菌苔，所以會(huì)產(chǎn)生一個(gè)個(gè)中央有溶源菌小菌落、四周有透明圈的特殊噬菌斑。第二節(jié)亞病毒亞病毒不具有真病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)，能利用非自身編碼的酶系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)制，有侵染性，并可在宿主中引起癥狀。亞病毒主要有類病毒、擬病毒和朊病毒。1、發(fā)現(xiàn)：

馬鈴薯紡錘形塊莖病(potataspindletuberdisease，PSTD)是1922年在美國(guó)發(fā)現(xiàn)的，它可使馬鈴薯減產(chǎn)20~70%。我國(guó)于1960年時(shí)在黑龍江省發(fā)現(xiàn)，減產(chǎn)極其嚴(yán)重。一、類病毒1967~1971年，瑞士學(xué)者Diener發(fā)現(xiàn)，患PSTD的塊莖抽提物經(jīng)超離心和凝膠電泳后，出現(xiàn)一條比一般病毒分子更小的區(qū)帶，而健康的塊莖卻沒有。經(jīng)一系列試驗(yàn)后，證明它是一個(gè)沒有衣殼包裹的RNA分子，經(jīng)過電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)它是一條長(zhǎng)50nm的棒狀dsRNA分子，他稱它為馬鈴薯紡錘形塊莖病類病毒(potatospindletuberviroid，PSTV)。從此，一類新的病原體—類病毒就被廣泛承認(rèn)并進(jìn)行了深入的研究。

類病毒：只含有RNA一種化學(xué)組分，專性活細(xì)胞內(nèi)寄生的分子病原體。在1977~1988年間陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的類病毒已有18種，例如番茄散頂病、柑橘裂皮病、菊花矮化病、菊花褪綠斑駁病、黃瓜白果病、椰子死亡病和酒花矮化病等的類病毒。2、特點(diǎn)：可以認(rèn)為，類病毒是當(dāng)今所知道的最小、只含RNA一種成分、專性活細(xì)胞內(nèi)寄生的分子生物。3、結(jié)構(gòu)：

大量實(shí)驗(yàn)證明，PSTV呈棒形結(jié)構(gòu)，是一個(gè)裸露的閉合環(huán)狀ssRNA分子。整個(gè)環(huán)由2個(gè)互補(bǔ)的半體所組成，其一含179個(gè)核苷酸，另一含180個(gè)核苷酸，兩者間有70%的堿基以氫鍵方式結(jié)合，共形成122個(gè)堿基對(duì)。整個(gè)棒狀結(jié)構(gòu)中有27個(gè)內(nèi)環(huán)。1、發(fā)現(xiàn)：

1981年Randles等在絨毛煙上分離到一種直徑為30nm的二十面體病毒，稱為絨毛煙斑駁病毒(VTMov，velvettobaccomottlevirus)。當(dāng)他們?cè)阼b定該病毒時(shí)，發(fā)現(xiàn)其基因組除含一種大分子線狀ssRNA(稱RNA-1)外，還含有一種類似于類病毒的環(huán)狀ssRNA分子(稱RNA-2)及它的線狀形式(稱RNA-3)。二、擬病毒

進(jìn)一步研究表明，對(duì)VTMoV的RNA-1和RNA-2進(jìn)行單獨(dú)接種時(shí)，都不能感染和復(fù)制，只有當(dāng)RNA-1（輔助病毒）和RNA-2或RNA-3合在一起時(shí)才可以感染和復(fù)制。因此，這種環(huán)狀ssRNA分子(RNA-2)是一種類似于類病毒的新型RNA分子，于是Haseloff等(1982)將這種包被于病毒衣殼內(nèi)的環(huán)狀RNA分子稱為擬病毒。

擬病毒(virusoids）又稱類類病毒(viroic-like)或病毒衛(wèi)星，是指包裹在真病毒粒中的有缺陷的類病毒。擬病毒極其微小，一般僅由裸露的RNA或DNA組成。被擬病毒“寄生”的真病毒又稱輔助病毒，擬病毒則成為它的“衛(wèi)星”病毒。

擬病毒它是一些必須依賴輔助病毒才能復(fù)制的小分子核酸片段，它被包裝在輔助病毒的殼體中，本身對(duì)于輔助病毒的復(fù)制不是必需的，而且它與輔助病毒的基因組無(wú)明顯的同源性。擬病毒利用輔助病毒的復(fù)制酶進(jìn)行復(fù)制，猶如病毒利用宿主細(xì)胞的能量、原料及酶進(jìn)行復(fù)制一樣。故可認(rèn)為擬病毒是寄生于輔助病毒粒子中的分子寄生物。據(jù)推測(cè)，擬病毒的復(fù)制是以自身侵染性RNA分子為模板，借助宿主細(xì)胞內(nèi)依賴于RNA的RNA聚合酶進(jìn)行復(fù)制。

２、擬病毒的研究至少有以下四個(gè)方面的意義：①有助于探索核酸的結(jié)構(gòu)與功能。②有助于探索擬病毒與輔助病毒（RNA-1）間的相互關(guān)系。③利用擬病毒這類低分子RNA來(lái)組建新的弱毒疫苗。④對(duì)擬病毒的深入研究，也有助于進(jìn)一步探索病毒的本質(zhì)和生命起源等重大生物學(xué)理論問題。羊瘙癢病是綿羊和山羊的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化性紊亂疾病，具有脫毛、皮膚瘙癢、失去平衡和后肢麻痹等癥狀。其病原是經(jīng)過近兩個(gè)世紀(jì)的研究仍未解決的一個(gè)謎。自從發(fā)現(xiàn)類病毒后，有人就聯(lián)想起動(dòng)物中亦有相應(yīng)類病毒存在的可能。1982年，美國(guó)的S.B.Prusiner

終于發(fā)現(xiàn)羊瘙癢病的病原是一種蛋白質(zhì)，稱為朊病毒。這一發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)界引起震驚，因?yàn)樗c目前公認(rèn)的“中心法則”發(fā)生抵觸。

三、朊病毒朊病毒又稱“普列昂”或蛋白質(zhì)侵染因子（prion，是proteininfection的縮寫）。是一類不含核酸的傳染性蛋白質(zhì)分子，因能引起宿主體內(nèi)現(xiàn)成的蛋白質(zhì)分子發(fā)生與其相似的構(gòu)象變化，從而使宿主致病。朊病毒的三維結(jié)構(gòu)PrPscPrPc第三節(jié)病毒與實(shí)踐1、當(dāng)發(fā)酵液受噬菌體嚴(yán)重污染時(shí)，會(huì)出現(xiàn)的現(xiàn)象：①發(fā)酵周期明顯延長(zhǎng)；②碳源消耗緩慢；③發(fā)酵液變清，鏡檢時(shí)，有大量異常菌體出現(xiàn)；④發(fā)酵產(chǎn)物的形成緩慢或根本不形成；⑤用敏感菌作平板檢查時(shí)，出現(xiàn)大量噬菌斑；⑥用電子顯微鏡觀察時(shí)，可見到有無(wú)數(shù)噬菌體粒子存在。一、噬菌體與發(fā)酵工業(yè)2、預(yù)防噬菌體污染的措施：①?zèng)Q不使用可疑菌種；②嚴(yán)格保持環(huán)境衛(wèi)生；③決不排放或隨便丟棄活菌液；④注意通氣質(zhì)量；⑤加強(qiáng)管道及發(fā)酵罐的滅菌；⑥不斷篩選抗性菌種，并經(jīng)常輪換生產(chǎn)菌種；⑦嚴(yán)格執(zhí)行會(huì)客制度。3、一旦污染噬菌體，及時(shí)采取合理措施，①盡快提取產(chǎn)品，如發(fā)現(xiàn)污染時(shí)發(fā)酵液中的代謝產(chǎn)物含量已很高，應(yīng)及時(shí)提取或補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)并接種抗噬菌體菌種后再繼續(xù)發(fā)酵，以挽回?fù)p失；②使用藥物抑制，目前防治噬菌體污染的藥物還很有限，在谷氨酸發(fā)酵中，加入某些金屬螯合劑可抑制噬菌體的吸附和侵入；加入1~2μg/ml金霉素、四環(huán)素或氯霉素等抗生素或0.1%~0.2%的“吐溫60”“吐溫20”或聚氧乙烯烷基醚等表面活性劑均可抑制噬菌體的增殖或吸附；③及時(shí)改用抗噬菌體生產(chǎn)菌株。昆蟲病毒用于生物防治的優(yōu)點(diǎn)：（1）致病力強(qiáng)，使用量少；（2）專一性強(qiáng)，安全可靠；（3）抗逆性強(qiáng)，作用久長(zhǎng)；（