Tinge五哼ve:CfllSPR-^Tinge五哼ve:CfllSPR-^tLJarm?IktirlkbCRISPR-U?基因敲入iPSC細胞系：通過核轉(zhuǎn)染法將gRNA、Cas9和Donor共轉(zhuǎn)入iPSC細胞中，進行藥篩，藥篩完成后挑選單克隆培養(yǎng)。選擇不同的克隆分別進行靶位點擴增及測序，篩選出敲入純合的陽性克隆。敲入熒光報告基因的也可以通過觀察熒光進行初步篩選。敲入方案:特定位點融合蛋白：gRNA和Cas9復合物造成靶位點DNA雙鏈斷裂后，PSC細胞以外源攜帶敲入片段的Donor作為模板進行同源重組修復（HDR），將敲入片段重組到基因組靶位點。Wtld-t>pe&Jldo{ehranwEcmoX)

基因定點過表達:人類iPSC在hROSA26和AAVS1位點定點敲入感興趣的基因，即可以避免片段在基因組隨機插入，又可實現(xiàn)目標基因過表達。HDRdonor匚曰sScutting5iit巳PPP1R12Clocus(AAV51site)PGAPURO匸*G”區(qū)13護HDRdonor匚曰sScutting5iit巳PPP1R12Clocus(AAV51site)PGAPURO匸*G”區(qū)13護11皀GFPHA-LI4A.-R]HomclogousReccMnbinalkm*??■"-??R3源井生物的細胞系基因編輯專家使用CRISPR-U?技術(shù)設計您的安全港基因敲入iPSC模型，生成滿足您特定研究需要的細胞系模型。應用案例：通過構(gòu)建以AAVS1位點為靶點的AAVS1-Cas9-sgRNA質(zhì)粒和AAVS1-EF1a-F9cDNA嘌呤霉素donor載體，并將其導入iPSC。將F9cDNA成功插入AAVS1位點的iPSCs分化為肝細胞，在培養(yǎng)上清中成功檢測到人因子1X(hFIX)抗原和活性。最后，通過脾臟注射將肝細胞移植到非肥胖糖尿病/嚴重聯(lián)合免疫缺陷病(NOD/SCID)小鼠體內(nèi)。F2 RJbid 斗』，oCRr5P^Cas9?BEffiiea b護訊誇. F2 RJbid 斗』，oCRr5P^Cas9?BEffiiea b護訊誇. si*Sei- IPVCa.-iPBC■- ^6Cv- iP3Ci-lr**rtBHi nwnifin ^*4*40* LnwitM ■aurifaut 用fi—A電?Sf■燉Jii聲JsoionytM^ovp5tyfcry?AMI.| |訊超樂|purarr^Qn| |IAAV51EF1w|聘tDIMA|pmamyri松 j |iPSC轉(zhuǎn)染48小時后，用嘌呤霉素進行藥物篩選。大多數(shù)iPSCs在藥物選擇后死亡，但少數(shù)存活下來。大約7天后，每個存活的iPSC的克隆都長得足夠大，可以在兩組（圖a，b）中進行進一步的插入檢測。從中挑選出6個克隆。如圖c所示，用引物可在所有iPSC克隆中檢測到1.3kb的片段；用另外一對引物可在iPSC克隆1、2、3、4和6中檢測到468bp和4.9kb的片段，表明F9cDNA雜合插入；在iPSC克隆5中只能檢測到4.9kb的片段，表明F9cDNA純合插入。參考文獻:Lyu,Cuicui,etal."TargetedgenomeengineeringinhumaninducedpluripotentstemcellsfrompatientswithhemophiliaBusingtheCRISPR-Cas9system."Stemcellresearch&therapy9.1(2018):92.iPSC誘導分化由于人胚胎干細胞來源于早期胚胎而使其研究備受倫理爭議，而且人胚胎干細胞來源的分化細胞進行異體移植時存在排斥反應，在一定程度上限制了其臨床應用。iPSC來源于多種體細胞，可以誘導分化為不同種類的細胞用于科學研究。源井生物的iPSC技術(shù)平臺集中在分化的開發(fā)上，提高了從患者組織（如成纖維細胞）或現(xiàn)有的iPSC中產(chǎn)生具有功能的、成熟的肝細胞、神經(jīng)細胞、T細胞、心肌細胞、造血干細胞和胰島細胞。實驗流程iPSC西鷲程吋科使弓踴斗比優(yōu)的范垢程方法將客戶提供的組祝iP￡C誘導并化枉iPH培弄