第十二章遺傳重組

Chapter12GeneticRecombination重點(diǎn)與難點(diǎn)重點(diǎn)：同源重組、位點(diǎn)特異性重組和轉(zhuǎn)座的概念、特征與類型難點(diǎn)：同源重組、位點(diǎn)特異性重組轉(zhuǎn)座的分子機(jī)制基因組的可變性和穩(wěn)定性之間必須維持一個(gè)恰到好處的平衡，這樣才能使生物體得以生存并能世代相傳，繁衍不息。染色體的遺傳差異主要由兩種機(jī)制產(chǎn)生，一種是突變，一種是遺傳重組。

突變和重組是提供進(jìn)化起始物質(zhì)的兩個(gè)過程。突變引起的遺傳改變能引起蛋白質(zhì)中氨基酸序列的變化，該變化引起表型的改變，通過自然選擇發(fā)生作用。重組提供一個(gè)基因組結(jié)構(gòu)的變化，也會(huì)引起表型的變化，也通過自然選擇發(fā)揮作用。

一、遺傳重組的概念和類型二、同源重組三、位點(diǎn)特異性重組四、轉(zhuǎn)座五、異常重組主要內(nèi)容一、遺傳重組的概念和類型1、遺傳重組的概念細(xì)胞之間或DNA分子之間核苷酸片段的交換或者轉(zhuǎn)移。廣義指：任何造成基因型變化的基因交流過程，包括減數(shù)分裂中染色體的隨機(jī)組合、連鎖互換、雌雄配子結(jié)合形成的新的基因型、細(xì)菌雜交、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)座、整合等；狹義指：僅涉及到DNA分子斷裂－愈合的基因交流過程，包括連鎖互換、細(xì)菌雜交、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)座、整合等。

2、遺傳重組的類型

1）同源重組（homologousrecombination）

同源染色體間或同源序列之間某區(qū)段的交換。包括真核生生物同源區(qū)段的交換，細(xì)菌同源區(qū)段的交換。

2）位點(diǎn)特異性重組（site-specificrecombination）

供體DNA僅整合在受體DNA的某一位點(diǎn)的重組。如噬菌體僅能重組在E.coli的生物素操縱子與半乳糖操縱子之間

3）轉(zhuǎn)座（transposon）

一些DNA片段或噬菌體DNA能在大腸桿菌的質(zhì)粒間、DNA間來回轉(zhuǎn)移的重組。

4）異常重組（illegitimaterecombination）

指一些非法交換、不對(duì)等交換現(xiàn)象.如末端連接和鏈的滑動(dòng)。

二、同源重組同源重組（homologousrecombination）:（1）發(fā)生在同源DNA序列之間一、特征

（2）負(fù)責(zé)DNA配對(duì)和重組的蛋白質(zhì)因子無堿基序列特異性

（3）產(chǎn)生兩種對(duì)應(yīng)的重組體

細(xì)線期偶線期粗線期雙線期終變期?e.g.Euk.減數(shù)分裂時(shí)的染色單體之間的交換細(xì)菌的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)，接合，噬菌體重組二、進(jìn)行同源重組的基本條件（1）發(fā)生同源性重組的兩個(gè)區(qū)域的核苷酸序列必須是相同或非常相似的。同源性重組常常只發(fā)生在兩個(gè)DNA分子中的相同部位。（2）雙鏈DNA分子之間互補(bǔ)堿基進(jìn)行配對(duì)兩個(gè)DNA分子的鏈之間互補(bǔ)的堿基配對(duì)確保重組只發(fā)生在同樣的基因座之間。在該部位兩個(gè)雙鏈DNA分子通過鏈之間互補(bǔ)的堿基配對(duì)被維系在一起稱為聯(lián)會(huì)。（3）重組酶參與重組反應(yīng)的酶保證重組的順利進(jìn)行。重組過程中，每個(gè)分子的鏈?zhǔn)紫葦嗔?，然后進(jìn)行修復(fù)和連接，兩個(gè)DNA分子之間發(fā)生交換;重組完成后，重組分子的解離和釋放等過程均是在酶催化下進(jìn)行的。（4）異源雙鏈區(qū)的形成同源性重組時(shí)，在兩個(gè)DNA分子之間互補(bǔ)堿基配對(duì)的區(qū)域稱為異源雙鏈區(qū)（heteroduplexregion）。三、同源重組的分子機(jī)制1、

斷裂復(fù)合及Holliday中間體的形成?

Holliday結(jié)構(gòu)同源重組中連接兩個(gè)DNA雙鏈的交換中間物含有4股DNA鏈，在連接處為了轉(zhuǎn)換配對(duì)所形成交叉鏈的連接點(diǎn)為…?同源重組都涉及到DNA分子內(nèi)的－－斷裂—復(fù)合1964年Holliday提出，又叫Holliday模型第一步聯(lián)會(huì)同源的非姊妹染色單體間聯(lián)會(huì)形成聯(lián)會(huì)復(fù)合體第二步酶切內(nèi)切酶分別在DNA分子上各切開一條單鏈第三步交換重接第四步形成交聯(lián)橋結(jié)構(gòu)第五步分支遷移，形成Holliday結(jié)構(gòu)第六步分支構(gòu)型變化第七步分支繞交聯(lián)橋旋轉(zhuǎn)1800

第八步Holliday中間體拆分

2、遺傳重組的酶學(xué)機(jī)制在遺傳重組過程中，尤其在同源重組中需要recA蛋白和recBC蛋白.recA蛋白又叫重組酶、重組蛋白、X蛋白、依賴于ATP的酶。

recA蛋白由E.coli的recA基因編碼，分子量約38000Da，由353個(gè)氨基酸組成，其主要作用是促進(jìn)同源DNA聯(lián)會(huì)，促進(jìn)DNA分子間單鏈交換形成交聯(lián)橋和Chi結(jié)構(gòu)，此酶有多種特性。

1）單鏈DNA結(jié)合活性，保護(hù)單鏈并促進(jìn)recA與單鏈結(jié)合

2）依賴于單鏈DNA的ATP酶活性

3）DNA解旋活性，解開雙螺旋

4）NTP酶活性，能水解ATP、GTP、UTP、CTP促進(jìn)聯(lián)會(huì)發(fā)生

5）促進(jìn)互補(bǔ)單鏈復(fù)性

6）蛋白酶活性和外切酶活性

RecA入侵單鏈被置換連RecA引發(fā)鏈侵入模型RecApromotestheassimilationofinvadingsinglestrandsintoduplexDNAsolongasoneofthereactingstrandshasafreeend.

RecA啟動(dòng)的單鏈入侵RecA引起的鏈交換和Holliday結(jié)構(gòu)的生成

recBC蛋白：recB和recC基因的產(chǎn)物，分子量約為300300Da。在同源重組中具有核酸酶的作用、切斷Holliday中中間體完成重組。此酶又叫外切核酸酶Ⅴ。在同源重組過程中例如在細(xì)菌的接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中都有此酶起作用。3‘?

RecBCD的識(shí)別和切割位點(diǎn)a、RecBCD結(jié)合在DNA的平頭末端（產(chǎn)生機(jī)制不清楚）b、外切、解鏈、移動(dòng)（ATP）c、兔耳狀loop結(jié)構(gòu)產(chǎn)生（再旋酶活性低于解旋酶活性）d、RecBCD在loop單鏈區(qū)的

chi位點(diǎn)3‘方4～6NT處切斷單鏈（單鏈內(nèi)切酶）?

chi位點(diǎn)：GCTGGTGG

目前發(fā)現(xiàn)的重組熱點(diǎn)

E.coli

含1000個(gè)、Euk.Ruv酶：即ruvA、ruvB和ruvC編碼的一組酶。a、RuvA識(shí)別Holliday結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn)b、RuvB為分枝遷移提供動(dòng)力（ATPase10～20bp/s）c、RuvC核酸內(nèi)切酶專一性識(shí)別Holliday結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn)體外切段連接點(diǎn)以拆分重組體3、分枝遷移和Holliday結(jié)構(gòu)的拆分?分枝遷移（branchmigaration）－－雙螺旋形成的交叉連接以拉鏈?zhǔn)叫?yīng)擴(kuò)散Holliday的異構(gòu)化產(chǎn)生重組體的拆分Holliday結(jié)構(gòu)一經(jīng)生成即可不斷地處于異構(gòu)化－－異源雙鏈

heteroduplexDNA重組結(jié)果取決于拆分時(shí)配對(duì)鏈上的切口位置“親本鏈”“重組體”12三、位點(diǎn)專一性重組一、位點(diǎn)特異性重組（

site-specificrecombination）1、概念：發(fā)生在專一序列而序列極少相同的DNA分子間的重組噬菌體基因組整合到細(xì)菌染色體基因組中屬此種重組2、特征：?在特定的結(jié)合序列部位，有專一的酶催化斷裂重接

產(chǎn)生精確的DNA重排?具有整合作用的兩個(gè)基本特征a、典型的保守性重組b、發(fā)生在噬菌體和細(xì)菌DNA短同源序列的專一性核苷酸上二、λphage的整合與切除1、實(shí)現(xiàn)機(jī)制：均是通過細(xì)菌DNA和λDNA上特定位點(diǎn)之間的重組2、特定位點(diǎn)附著位點(diǎn)（attachmentsiteatt）?E.coliattB

含BOB’三序列25bp?λphage

attP

含POP’三序列

240bp?核心序列“O”完全一致

（同源部分）

位點(diǎn)特異性重組發(fā)生的地方?B,B’,P,P’臂3、整合過程?整合后的附著位點(diǎn)為

attL（BOP’）

attR（POB’）?整合位點(diǎn)attB、attP

切除位點(diǎn)attL、attR?整合過程需要λ整合酶

（integraseInt）（λ編碼）和寄主的整合宿主因子IHF

（integrationhostfactor）共同作用4、噬菌體整合的分子機(jī)制

1）聯(lián)會(huì)噬菌體進(jìn)入E.coli中自動(dòng)成為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，以此環(huán)狀結(jié)構(gòu)參自身的attP區(qū)與E.coli的attB區(qū)互補(bǔ)聯(lián)會(huì)

2)酶的結(jié)合整合酶：(Int)噬菌體的int基因編碼一種DNA結(jié)合蛋白，此酶對(duì)POP’有強(qiáng)的親和力，對(duì)BOB’也有合力，具有拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的活性，即可以DNA切斷再連起來。整合寄主因子：(IHF)由E.coli編碼的一種結(jié)合蛋白，對(duì)attP位點(diǎn)有強(qiáng)的親和力。Int.IHF二者結(jié)合在供體和受體DNA的互補(bǔ)處

3）酶切整合酶在一條鏈的+4位，另一條鏈的-2位切開attB和attP，形成參差不齊的5’單鏈末端，5’-OH3’-P4)重接切開后瞬間DNA分子發(fā)生旋轉(zhuǎn)，又在整合酶作用下使斷口處連接起來。重新連接時(shí)斷頭與斷頭之間發(fā)生錯(cuò)接導(dǎo)致噬菌體整合到E.coli的基因組中?Int蛋白能切斷DNA，并使它重新連接，近而使holliday結(jié)構(gòu)拆分?重組時(shí)attP和attB部位交叉斷裂，互補(bǔ)單鏈末端進(jìn)行交叉雜交λ-DNA從E.coli的切離：λ-DNA對(duì)E.coli的整合：BOP’—POB’（原噬菌體）BOB’（細(xì)菌）+POP’

（噬菌體）IntIHFBOP’—POB’（原噬菌體）BOB’（細(xì)菌）+POP’

（噬菌體）Int，XisIHF溶源性細(xì)菌(lysogen)溶菌周期（lysis）原噬菌體四、轉(zhuǎn)座重組一、轉(zhuǎn)座成分概述1、轉(zhuǎn)座子(元)或轉(zhuǎn)座元件(transposonortransposableelement):

基因組上不必借助于同源序列就可以移動(dòng)的DNA片段，它們可以直接從基因組的一個(gè)位點(diǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)（供體和受體）轉(zhuǎn)座（transposition）：轉(zhuǎn)座元的轉(zhuǎn)移過程（不十分確切）2、發(fā)現(xiàn)和發(fā)展?1914A.Emerson1936Marcus.M.Rhoabes

玉米果皮、糊粉層花斑突變

玉米籽粒糊粉層色素不穩(wěn)定遺傳機(jī)理

跳躍基因（jumpinggene）?1947冷泉港實(shí)驗(yàn)室（美）BarbaraMcClintocka)不依賴供體序列與靶位點(diǎn)間序列的同源性b)轉(zhuǎn)座不是簡單的轉(zhuǎn)移，涉及轉(zhuǎn)座子的復(fù)制Hotspots(熱點(diǎn))Regionalpreference(在3kb區(qū)域內(nèi)的隨機(jī)插入)d)某些轉(zhuǎn)座因子（Tn3）對(duì)同類轉(zhuǎn)座因子的插入具有排他性（免疫性）e)靶序列在轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)會(huì)形成正向重復(fù)f)轉(zhuǎn)座因子的切除與轉(zhuǎn)座將產(chǎn)生復(fù)雜的遺傳學(xué)效應(yīng)3、轉(zhuǎn)座重組的特點(diǎn)c)轉(zhuǎn)座插入的靶位點(diǎn)并非完全隨機(jī)（插入專一型）二、原核生物轉(zhuǎn)座子種類簡單轉(zhuǎn)座子（插入序列，insertionsequence，IS）復(fù)合轉(zhuǎn)座子共同特征：a）兩端有20～40bp的反向重復(fù)序列（IR）

b）具有編碼轉(zhuǎn)座酶（transposase）的基因1、插入序列最簡單，是細(xì)菌染色體、質(zhì)粒和某些噬菌體的正常組分命名：IS＋編號(hào)（鑒定類型）長度700～2000bp兩端IR為轉(zhuǎn)座酶的識(shí)別位點(diǎn)特點(diǎn)：插入靶位點(diǎn)后會(huì)出現(xiàn)靶位點(diǎn)的正向重復(fù)（3～9bp）Tn/TnAfamily

l具有IR、轉(zhuǎn)座酶基因、調(diào)節(jié)基因（解離酶）、抗抗生素基因

l

Tn1(AmpR)Tn2(AmpR)Tn3(AmpR)Tn4(AmpRStrR)Tn5(KanR)Tn6(kanR)Tn7(StrRTmpR)Tn9(CamR)Tn10(TetR)

2kb25kb

Tn3IRTnpAResTnpRAmpRIR38bp38bp

轉(zhuǎn)座酶

regulatorβ-內(nèi)酰胺酶

2、復(fù)合轉(zhuǎn)座子（Compositetransposon,Tn）

大小復(fù)合轉(zhuǎn)座子的兩端常常含有IS或IS的一部分，表明復(fù)合轉(zhuǎn)座子可能是在細(xì)胞基因的兩端分別裝上一個(gè)IS，整個(gè)裝置像IS一樣移動(dòng)，Tn兩側(cè)的IS原件具有以下特征：（1）兩側(cè)的IS元件有的相同，有的不同，如Tn10兩端的IS（右側(cè)IS10R，左側(cè)為IS10L）；

（2）兩側(cè)的IS元件有的方向相同，如Tn9（兩個(gè)IS1通向），有的方向相反，如Tn903（兩個(gè)IS903反向）；

（3）兩側(cè)的IS元件均有功能，或僅部分有功能，如Tn5右端的IS50R具有轉(zhuǎn)位作用，左端的IS50L無功能，但這一對(duì)方向重復(fù)之間的差異僅為一個(gè)堿基對(duì)；

（4）兩個(gè)IS元件可使位于中間的任何序列轉(zhuǎn)座，也可制造出新的轉(zhuǎn)座子。1.玉米的AC-DS系統(tǒng)Activator-DissociatorsystemAc：全長4500bp，末端有11bp的IR，有轉(zhuǎn)座酶基因和阻遏物基因，可以自主轉(zhuǎn)座。Ds：是Ac的缺失類型，缺失范圍0.4kb－4kb，轉(zhuǎn)座有賴于Ac的存在。玉米轉(zhuǎn)座子現(xiàn)象三、真核生物的轉(zhuǎn)座子TheAcelementhastwoopenreadingframes;Dselementshaveinternaldeletions.玉米轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)Ac轉(zhuǎn)座酶活性沒有被激活，無轉(zhuǎn)座發(fā)生Ac轉(zhuǎn)座酶活性被激活，轉(zhuǎn)座發(fā)生

性狀發(fā)生改變2.果蠅中的P因子P品系M品系M（♂）×P（♀），后代可育M（♀）×P（♂），后代不育P品系的細(xì)胞中有導(dǎo)致雜種劣育的遺傳因子，稱為P因子。Hybriddysgenesisisasymmetrical;itisinducedbyPmalexMfemalecrosses,butnotbyMmalexPfemalecrosses.果蠅P因子的結(jié)構(gòu)四、轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制及模式?三種類型：復(fù)制型、非復(fù)制型和保守型1、復(fù)制型轉(zhuǎn)座模式?實(shí)質(zhì)：轉(zhuǎn)座子元件被復(fù)制并被移動(dòng)到受體位點(diǎn)，最終轉(zhuǎn)座過程擴(kuò)增了轉(zhuǎn)座子的拷貝（供、受點(diǎn)）?需兩種酶：轉(zhuǎn)座酶（作用于原拷貝兩末端）解離酶（作用于復(fù)制后的拷貝）?模式：2、非復(fù)制型轉(zhuǎn)座模式?供體上最終產(chǎn)生雙鏈斷裂?供體位點(diǎn)如不能被修復(fù)則有致死效應(yīng)3、保守型轉(zhuǎn)座模式?另一種非復(fù)制型?與λ整合機(jī)制相似其轉(zhuǎn)座酶與λ整合酶家族有關(guān)五、轉(zhuǎn)座的遺傳效應(yīng)

A、引起插入突變，如果在操縱子上游則引起極性突變

B、插入位上出現(xiàn)新基因

C、增加同源序列的整合

D、準(zhǔn)確切離引起回復(fù)突變

E、不準(zhǔn)確切離引起染色體畸變

F、改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)座后促使染色體缺失、倒位

G、調(diào)節(jié)某一基因的活動(dòng)

H、轉(zhuǎn)座子可帶入新的基因引起變異，利于進(jìn)化

四、異常重組

不需要DNA同源序列或彼此同源性很小，不需要重組蛋白、轉(zhuǎn)座酶的重組，是最原始的重組途徑，也是基因組進(jìn)化的重要途徑。這種途徑可能和癌癥發(fā)生、遺傳性疾病、基因組進(jìn)化有關(guān)，重組的結(jié)果導(dǎo)致移碼、缺失、倒位、融合、DNA的擴(kuò)增。

1、末端連接指染色體斷裂--融合--橋的循環(huán)的過程。有斷裂末端的兩條染色單體能夠復(fù)制、并且，兩個(gè)斷端可以融合一個(gè)雙著絲粒的染色單體，該染色單體在減數(shù)分裂中斷裂又產(chǎn)生斷端，斷端又可以融合，產(chǎn)生新的雙著絲粒染色單體，下次減數(shù)分裂時(shí)又?jǐn)嗔选?、鏈的滑動(dòng)在含有正向重復(fù)序列較多的DNA分子或染色體之間發(fā)生的模版鏈與新合成鏈間的錯(cuò)配。異常重組的分子機(jī)制1.末端連接(End-joining)+游離末端連接修復(fù)缺口任意兩個(gè)末端相連(兩末端極性不同)5’3’3’5’5’3’3’5’同源性小片段配對(duì)修復(fù)缺口在連接前有氫鍵配對(duì)(兩末端極性相同)5’3’3’5’5’3’3’5’