實(shí)驗(yàn)九、DNA的PCR擴(kuò)增及其檢測一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饩酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的原理掌握PCR實(shí)驗(yàn)的方法PCR結(jié)果的檢測二、實(shí)驗(yàn)原理(一)PCR的原理

PCR是以單鏈DNA為模板，四種dNTP為底物，利用寡核苷酸引物與模板3’端的特異性結(jié)合，在DNA聚合酶的催化下合成模板的互補(bǔ)鏈

PCR反應(yīng)通常包括25-30個循環(huán)，每個循環(huán)由變性、退火、延伸三個步驟組成。假定擴(kuò)增效率為1，經(jīng)過30個循環(huán)后，目標(biāo)DNA分子數(shù)將提高到起始時的1073741824倍（即230倍）時間(min)557294溫度(℃)第n個循環(huán)變性退火延伸延伸變性Y=X(1+E)NY:擴(kuò)增后目標(biāo)DNA分子數(shù)；X:起始時目標(biāo)DNA分子數(shù)；E:擴(kuò)增效率(0≤E≤1)；N:擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（在理想條件下）PCR的技術(shù)關(guān)鍵引物設(shè)計、引物保存、防止污染、反應(yīng)條件優(yōu)化、……PCR的衍生技術(shù)反轉(zhuǎn)錄PCR、反向PCR、巢式PCR、原位PCR、多重PCR、多重等位基因PCR、不對稱PCR、錨定PCR、熒光定量PCR、……PCR的應(yīng)用基因克隆、DNA測序、定點(diǎn)突變、基因分型、疾病診斷、親子鑒定、嫌犯驗(yàn)證、轉(zhuǎn)基因檢測、基因表達(dá)水平分析、……PCR產(chǎn)物電泳(照片）酶切產(chǎn)物電泳（示意圖）(三)PCR產(chǎn)物檢測的方法三、實(shí)驗(yàn)材料和試劑(一)PCR擴(kuò)增

1.模板：番茄(Solanumlycopersicum)基因組DNA

2.引物：

3番茄PCR反應(yīng)體系（10μL）成分含量F-primer0.1μMR-primer0.1μMDNA模板20ngdNTPs0.2mMMgCl25mMTaq聚合酶0.5U10×Buffer1μLddH2O補(bǔ)充至10μL(一)PCR擴(kuò)增試劑盒：

ddwater

2μl

PremixTaq

5μl模板DNA1μl引物2μl

總體積10μl←番茄DNA←正、反引物已預(yù)混注意：(1)冰上操作(2)混勻(3)在管上做好標(biāo)記（統(tǒng)一編號）PCR邊緣效應(yīng)：PCR儀邊緣各孔的擴(kuò)增效果稍差111213121222323132333414243451525356162636717273781828389192939102030402.PCR反應(yīng)條件

（由教師設(shè)置）94℃4分鐘94℃45秒55℃45秒72℃60秒72℃7分鐘4℃30分鐘循環(huán)35次預(yù)變性變性退火(模板～引物)延伸(0.8-1min/kb)延伸降溫(暫時保存)Ty-1酶切反應(yīng)體系（10μL）2023/2/7成分含量TaqⅠ(Taq酶)0.5μL0.1%BSA1μL10×Buffer1μLPCR產(chǎn)物7.5μL65℃酶切時間為2小時瓊脂糖凝膠電泳制膠：稱取1.2g瓊脂糖，溶于100mL1×TAE溶液中（微波加熱至完全融化）；加入10μL的核酸染料；將混合均勻的液態(tài)膠倒入膠板，插好梳子待其凝固（約40分鐘）上樣：一般第一個點(diǎn)樣孔加入5μL的2000bp的Marker，往其它點(diǎn)樣孔中滴入5μL的PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物電泳：調(diào)節(jié)電泳儀電壓為180V，電泳30-40min保存：利用凝膠成相系統(tǒng)對膠板進(jìn)行拍照并保存。