實驗二

三.抗酸染色

一.消毒滅菌二.腸道致病菌的分離培養(yǎng)一、消毒滅菌物理因素對細菌的影響2.化學因素對細菌的影響（一）物理因素對細菌的影響高壓蒸汽滅菌法紫外線對細菌的影響高壓蒸氣滅菌器

1)構(gòu)造

高壓蒸氣滅菌器是一個雙層的金屬圓筒，兩層之間盛水，外層堅厚，其上或前方有金屬厚蓋。蓋旁附有螺栓，借以緊閉蓋門，使蒸氣不能外溢。高壓蒸氣滅菌器上裝有排氣閥、安全閥，以調(diào)節(jié)器內(nèi)壓力，裝有的溫度計及壓力表以示內(nèi)部溫度和壓力。器內(nèi)裝有帶孔的金屬擱板，用以放置欲滅菌對象。高壓蒸汽滅菌法壓力：1.05kg/㎡

或103.425KPa溫度:

121.3℃時間：15-20min完全殺滅細菌的繁殖體和芽孢用途：適用于耐高溫、高壓，不怕潮濕的物品，如敷料、手術(shù)器械、藥品、細菌培養(yǎng)基等。2)使用方法

①加水至鍋內(nèi)達規(guī)定的水平面，放入欲滅菌物品，把鍋蓋按對稱的螺旋先后對稱用力（切勿單個依次）扭緊，使鍋蓋確實均勻密閉。②用電爐加熱，同時打開排氣閥門，使器內(nèi)冷空氣逸出，待空氣全部排出后，關(guān)閉排氣閥。③繼續(xù)加熱并觀察壓力表，器內(nèi)壓力又逐漸升高，直到壓力表指在所需數(shù)字（例如15磅）即調(diào)節(jié)熱源，維持20～30min．可完全殺死細菌的繁殖體和芽胞。④滅菌時間到達后，停止加熱，待壓力自行下降至零時方可徐徐開放排氣閥，排盡余氣，打開鍋蓋，取出滅菌物品。全自動高壓蒸汽滅菌鍋臺式蒸汽滅菌器BA-30SystecD-2002D雙門高壓滅菌器電熱臥式圓形壓力蒸汽滅菌器(型號YXQ-WY21-600)

電腦全自動水浴式串聯(lián)殺菌鍋紫外線對細菌的影響原理：紫外線主要作用于DNA，使一條DNA鏈上的兩個相鄰胸腺嘧啶以共價鍵結(jié)合成二聚體，從而干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄導致細菌變異或死亡。對病毒也有破壞作用。特點：紫外線殺菌作用強，而穿透能力弱。普通玻璃、紙張、水蒸氣、塵埃等均能阻擋。紫外線中波長為240-300nm者具有殺菌能力，其中265-266nm的殺菌作用最強。用途：常用于消毒物體表面，手術(shù)室無菌實驗室，傳染病房的空氣消毒及不耐熱物品消毒。紫外線對細菌的影響

方法：取一個平皿，用密涂法將細菌涂布于培養(yǎng)皿中，然后按圖所示揭開平皿蓋，置于紫外線下照射30分鐘，然后蓋好蓋子，置37℃培養(yǎng)24h后取出觀察結(jié)果。紙片平皿蓋濾紙片用后需要用火燒掉每個實驗室4個平板1.促進菌體蛋白質(zhì)變性或凝固;2.干擾細菌酶系統(tǒng)和代謝;3.損傷細菌的細胞膜，影響細菌的化學組成，物理結(jié)構(gòu)和生理活動。有些化學藥品濃度高時能殺滅病原微生物，稱為化學消毒劑；濃度低時能抑制細菌生長，稱為防腐劑。（只能外用，對細菌的敏感性不同）（二）化學因素對細菌的影響

化學消毒劑分類

高效消毒劑：殺滅細菌芽孢在內(nèi)的所有微生物，適用于不耐熱力滅菌但要進入人體內(nèi)部的物品，如內(nèi)窺鏡等。如：次氯酸鈉、過氧化氫、甲醛、環(huán)氧乙烷等中效消毒劑：不能殺滅芽孢，但能殺滅繁殖體（包括結(jié)核桿菌），真菌和大多病毒，適用于喉鏡，麻醉器材等。如：碘酊、乙醇等低效消毒劑：能殺滅大多細菌繁殖體，但不能殺滅芽孢，結(jié)核桿菌及某些抵抗力強的真菌和病毒。如：新潔爾滅、洗必泰、高錳酸鉀等化學消毒劑對細菌的影響方法：取一普通平皿培養(yǎng)基，一部分寫上“前”，另一部分寫上“后”，然后將手指在寫有“前”的部分沾一下，再將手指用酒精、碘酒或新潔爾滅進行消毒，在寫有“后”的部分沾一下。放入37℃溫箱培養(yǎng)24小時后觀察。

（每個實驗室4個平皿）腸道桿菌的生物學性狀埃希菌屬：大腸埃希菌沙門菌屬：傷寒沙門菌甲型、乙型副傷寒沙門菌志賀菌屬：痢疾志賀菌腸桿菌科重要菌屬及代表菌種1、相似的形態(tài)染色—從形態(tài)上無法區(qū)別

中等大小的G-桿菌

多有鞭毛、菌毛腸道桿菌的生物學性狀2、活潑的生化反應(yīng)腸道桿菌的生物學性狀乳糖發(fā)酵試驗初步鑒別腸道致病菌和腸道非致病菌腸道致病菌腸道非致病菌多數(shù)不發(fā)酵乳糖

多數(shù)發(fā)酵乳糖SS培養(yǎng)基的特性

（Salmonella-ShigellaMedium）膽鹽抑制G+,枸櫞酸鈉和煌綠能部分抑制大腸桿菌,致病的沙門菌和志賀菌能大量生長。中性紅指示劑和乳糖,中性紅遇酸變粉紅。常用于培養(yǎng)腸道致病菌。牛肉浸粉蛋白胨乳糖硫代硫酸鈉枸櫞酸鈉煌綠膽鹽中性紅瓊脂Salmonella-ShigellaMedium主要成分基礎(chǔ)營養(yǎng)乳糖指示劑抑制劑分解乳糖不分解乳糖產(chǎn)酸PH下降指示劑變紅色紅色大菌落大腸桿菌等無明顯變化無色半透明小菌落志賀菌、沙門菌將糞便標本以分區(qū)劃線法接種到SS培養(yǎng)基。

(每個實驗室8個平板，接種好后，做好標記，用膠布按班綁好）

注：每個平板只可操作一次，不可重復(fù)操作放入37℃溫箱中培養(yǎng)24小時。取出放4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。腸道致病菌的分離培養(yǎng)方法【實驗?zāi)康摹?/p>

1.掌握分枝桿菌抗酸染色的操作方法和意義。

2.熟悉抗酸染色的原理。

三、抗酸染色（Acidfaststain）分枝桿菌的細胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，主要是分枝菌酸，它包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經(jīng)過加熱和延長染色時間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。齊-尼氏抗酸染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合成復(fù)合物，用3%鹽酸酒精處理也不脫色。當再加堿性美蘭復(fù)染后，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細菌及背景中的物質(zhì)為藍色。【實驗原理】

細菌：卡介苗（BacillusCalmette-Guerin，BCG）

染液：石炭酸復(fù)紅液、3%鹽酸酒精、堿性美蘭溶液

其它：接種環(huán)、酒精燈、載玻片、玻片夾等

【實驗材料】1.細菌涂片的制備

涂片干燥固定

2.染色1）初染：用玻片夾夾持涂片標本，滴加石炭酸復(fù)紅2-3滴，在火焰高處（2-10cm）徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時離開，加熱3～5min，若染液蒸發(fā)減少，應(yīng)再加染液，以免干涸，待標本冷卻后用水沖洗。2）脫色：3%鹽酸酒精脫色30s～1min；用水沖洗。3）復(fù)染：用堿性美蘭溶液復(fù)染1min；用水沖洗后用吸水紙吸干。3.用油鏡觀察【方法與步驟】（與革蘭染色的差別）【實驗結(jié)果】未染色初染后脫色后復(fù)染后初染脫色復(fù)染石炭酸復(fù)紅鹽酸酒精堿性美蘭

結(jié)核桿菌呈紅色，常堆積成團，排列無序，偶呈分枝狀生長。背景及非抗酸性細菌呈藍色。【注意事項】1.無菌操作2.染色時間要充分3.初染時掌握好加熱的溫度，勿沸騰、干涸4.初染結(jié)束