實驗一植物病原細菌常用培養(yǎng)基

的制作與滅菌

第1頁/共94頁第一頁，共95頁。1.了解細菌培養(yǎng)基的種類；2.掌握常用細菌培養(yǎng)基的配方和制作方法；3.掌握培養(yǎng)基的滅菌方法。一、實驗目的

第2頁/共94頁第二頁，共95頁。二、實驗內容和操作方法

（1）配方：牛肉膏3ｇ，蛋白胨10ｇ，NaCl5ｇ，瓊脂20ｇ，蒸餾水1000ｍL。1.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)：分離和培養(yǎng)最常用（2）配制過程：將牛肉膏、蛋白胨、NaCl溶于蒸餾水后，調節(jié)pH7.2，加入瓊脂溶化后分裝于三角瓶和試管。（一）培養(yǎng)基的配制第3頁/共94頁第三頁，共95頁。2.Hugh和Leifson（HL）培養(yǎng)基：細菌的好氧性和厭氧性測定蛋白胨2.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鉀0.2g瓊脂3.0g蒸餾水1000.0mlpH7.4~7.8溴百里酚蘭（1.6％酒精溶液1.5ml）待培養(yǎng)基融化，并調pH后，裝于試管中，每支試管裝9ml

滅菌。培養(yǎng)基凝固后，用接種針蘸細菌懸浮液針刺接種，一直刺到管底。分別在培養(yǎng)2、4和7d后觀察記錄。好氧性細菌，只在開管的上部生長；兼性厭氧性細菌，則在開管的上下部都能生長；厭氧性細菌，則只能在開管的下部和閉管中生長。第4頁/共94頁第四頁，共95頁。（1）配方：NH4H2PO41.0ｇ，氯化鉀0.2ｇ，MgSO4.7H2O0.2ｇ，蒸餾水1000ｍL，溴百里酚蘭（1.6%酒精溶液）1.5mL;1%碳素化合物。3.Ayers培養(yǎng)基：碳素化合物產酸試驗

單糖（葡萄糖、半乳糖）；雙糖（麥芽糖、乳糖）；多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。有的細菌不產酸和氣，有的只產酸不產氣，少數(shù)植物病原細菌既產酸又產氣第5頁/共94頁第五頁，共95頁。（3）分裝：將上述培養(yǎng)基分裝于試管中，每管10mL左右。如果測定氣體產生，加上杜氏發(fā)酵小玻管后滅菌。產酸時培養(yǎng)液變黃，產堿時變藍，產氣則小玻管內培養(yǎng)液被部分排出，出現(xiàn)空隙。（2）配制過程：將NH4H2PO4、氯化鉀、MgSO4.7H2O溶于蒸餾水，調節(jié)pH7.0后加入溴百里酚蘭，最后加入碳素化合物（也可分別滅菌后加入）第6頁/共94頁第六頁，共95頁。4.MR和VP試驗：對葡萄糖的分解能力

（1）配方：蛋白胨5ｇ，葡萄糖5ｇ，磷酸氫二鉀5ｇ，蒸餾水1000ｍL。（2）配制過程：將蛋白胨、葡萄糖、磷酸氫二鉀溶于蒸餾水，調節(jié)pH7.0-7.2，每管分裝5mL即可。第7頁/共94頁第七頁，共95頁。5.硝酸鹽還原（1）配方：硝酸鉀1.0ｇ，蛋白胨5.0ｇ，酵母膏3.0ｇ，蒸餾水1000ｍL，pH7.0-7.2（2）配制過程：將硝酸鉀、蛋白胨、酵母膏稱好后，溶解于蒸餾水后，調節(jié)pH。第8頁/共94頁第八頁，共95頁。6.半胱氨酸培養(yǎng)液：測定產H2S能力（1）配方：蛋白胨10ｇ，硫酸鈉0.1g，半胱氨酸0.1g，蒸餾水1000ｍL。（2）配制過程：將半胱氨酸、蛋白胨、硫酸鈉稱好后，溶解于水中，調節(jié)pH7.0-7.3即可。第9頁/共94頁第九頁，共95頁。7.吲哚試驗（1）配方：蛋白胨20.0ｇ，磷酸氫二鈉2.0g，葡萄糖10.0g，蒸餾水1000ｍL。（2）配制過程：將蛋白胨等稱好后，溶解于蒸餾水，調節(jié)pH7.0-7.2即可。第10頁/共94頁第十頁，共95頁。8.明膠液化（1）配方：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0ｇ，明膠10-12%，蒸餾水1000ｍL。（2）配制過程：將牛肉浸膏、蛋白胨溶解于蒸餾水中，調節(jié)pH7.0-7.2后，將明膠溶解于此溶液中，即可分裝于試管中。第11頁/共94頁第十一頁，共95頁。9.淀粉水解試驗（1）配方：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨17.5ｇ，淀粉1.5g，瓊脂15-20g，蒸餾水1000ｍL。（2）配制過程：將牛肉浸膏、蛋白胨、淀粉稱好后，溶解于蒸餾水中，加入稱好的瓊脂，待融化后調節(jié)pH7.0-7.2。第12頁/共94頁第十二頁，共95頁。10.石蕊牛乳反應

（1）配方：脫脂牛乳1000ｍL，石蕊液（4%）15-20mL。（2）配制過程：提前配制石蕊液第13頁/共94頁第十三頁，共95頁。（二）培養(yǎng)基的滅菌上述培養(yǎng)基應按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時進行滅菌。普通培養(yǎng)基為121℃20~30min，以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。培養(yǎng)基經滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面，斜面長度一般以不超過試管長度的1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。第14頁/共94頁第十四頁，共95頁。明膠培養(yǎng)基滅菌12-15分鐘。石蕊牛乳培養(yǎng)基間歇滅菌3次，每次通蒸汽20-30分鐘。滅菌方法

滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學滅菌法兩大類。本實驗主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。

第15頁/共94頁第十五頁，共95頁。加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。通過加熱使菌體內蛋白質凝固變性，從而達到殺菌目的。高壓蒸汽滅菌法

高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是基于水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設計的。第16頁/共94頁第十六頁，共95頁。當蒸汽壓力達到1.05kg/cm2時，水蒸氣的溫度升高到121℃，經20～30min，可全部殺死鍋內物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標本和工作服等都可應用此法滅菌。操作方法和注意事項如下:

加水

打開滅菌鍋蓋，向鍋內加水到水位線。注意水要加夠，防止滅菌過程中干鍋。

第17頁/共94頁第十七頁，共95頁。裝料、加蓋

滅菌材料放好后，關閉滅菌器蓋，采用對角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。

排氣打開放氣閥。用電爐加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當有大量蒸汽排出時，維持5min，使鍋內冷空氣完全排凈。

第18頁/共94頁第十八頁，共95頁。升壓、保壓和降壓

當鍋內冷空氣排凈時，即可關閉排氣閥，壓力開始上升。當壓力上升至所需壓力時，控制電壓以維持恒溫，并開始計算滅菌時間，待時間達到要求（一般培養(yǎng)基和器皿滅菌控制在121℃，20min）后，停止加熱，待壓力降至接近“0”時，打開放氣閥。注意不能過早過急地排氣，否則會由于瓶內壓力下降的速度比鍋內慢而造成瓶內液體沖出容器之外。

第19頁/共94頁第十九頁，共95頁。干熱滅菌法

通過使用干熱空氣殺滅微生物的方法叫干熱滅菌。一般是把待滅菌的物品包裝就緒后，放入電烘箱中烘烤，即加熱至160～170℃維持1～2h。

干熱滅菌法常用于空玻璃器皿、金屬器具的滅菌。凡帶有膠皮的物品，液體及固體培養(yǎng)基等都不能用此法滅菌。

第20頁/共94頁第二十頁，共95頁。1細菌（NA）和真菌(PDA)常用培養(yǎng)基的配方和制作過程有何異同點？2試述高壓蒸汽滅菌的操作方法和注意事項。三、作業(yè)第21頁/共94頁第二十一頁，共95頁。實驗二植物病原細菌的分離

和致病性測定第22頁/共94頁第二十二頁，共95頁。二、實驗內容和操作方法

（1）首先要選擇典型、新鮮病組織;（2）以滅菌剪將病斑剪下，略帶健康組織，大小約0.5～1公分左右，放在滅菌載玻片中央，加無菌水1d。加上滅菌蓋玻片，靜置約10min左右，觀察是否有云霧狀自破口處涌出（一）細菌溢現(xiàn)象觀察

第23頁/共94頁第二十三頁，共95頁。（1）斑點型：如棉花角斑病。A.剪取新鮮的典型病斑，約1cm見方。（二）植物病原細菌的分離1.細菌懸浮液的配制（不同癥狀類型分離材料的選擇和表面消毒）第24頁/共94頁第二十四頁，共95頁。B.表面消毒：將切取的組織塊在70％乙醇中浸一下立即取出，然后用表面消毒劑進行表面消毒，可以采用0.1％升汞，15″－2min或0.5％的次亞氯酸鹽如漂白粉（1：9稀釋液）2minC.消毒后用滅菌水洗滌3次，將病組織放在另一個培養(yǎng)皿的滅菌水中，剪破中心或以滅菌玻璃棒研碎病組織靜置20－30分鐘，等細菌游出。第25頁/共94頁第二十五頁，共95頁。（2）萎蔫型如茄青枯病將莖部剪成1－2寸長，表面用70％酒精輕拭，在火焰上表面消毒，以滅菌刀縱剖，選擇輕微變色病部，以滅菌刀切出薄片或以解剖針挑出病健交界處組織（可以不再消毒），加滅菌水浸泡20-30分鐘。如果莖部較粗，也可以在表面消毒后用解剖刀橫斷莖部，用夾子或手緊壓莖部橫斷面，擠出溢膿或汁液。第26頁/共94頁第二十六頁，共95頁。（3）腫瘤組織

軟瘤比較容易分離；木質瘤可以磨碎后接種在向日葵、番茄等幼株上長出瘤后再分離。由于細菌位于表皮細胞和木質部之間，因此應用酒精棉花擦拭表面，在火焰上表面消毒，再在滅菌皿中實行解剖后以滅菌玻棒將其搗碎，靜置浸泡24h。第27頁/共94頁第二十七頁，共95頁。（4）腐爛組織較簡單，選擇近病部交界處以接種環(huán)挑取少量腐爛組織，稀釋。（5）種子帶菌的分離

選擇病種子，以0.1％升汞液表面消毒1－2min，滅菌水洗滌，再將此種子在70％酒精中浸幾分鐘，洗滌2－3次，取出放在研缽中磨碎，離心取上清液。第28頁/共94頁第二十八頁，共95頁。2.分離方法A.倒平板：注意培養(yǎng)基的溫度不能太高，否則冷凝水太多，細菌在水中游動而影響單個分散菌落的形成。（1）平板劃線分離法：被普遍采用第29頁/共94頁第二十九頁，共95頁。B.用接種環(huán)蘸取上述配制好的菌懸液，在已凝固的平板培養(yǎng)基表面劃線如果菌液濃度大，培養(yǎng)皿轉動角度減小，增加劃線的次數(shù)劃4條線后，將接種環(huán)滅菌，培養(yǎng)皿轉動90°，從第2條線開始劃4－5條線第30頁/共94頁第三十頁，共95頁。（2）培養(yǎng)皿稀釋分離法0原液1取1環(huán)菌液0.5ｍL滅菌水2混勻后取1環(huán)3混勻后取1環(huán)4混勻后取1環(huán)5混勻后取1環(huán)第31頁/共94頁第三十一頁，共95頁。3.培養(yǎng)

一般放置在28－30℃溫箱中倒置培養(yǎng)，時間2～3d。將冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基倒入裝有稀釋菌液的培養(yǎng)皿中，輕輕轉動培養(yǎng)皿，使菌液和培養(yǎng)基混勻，待其凝固后培養(yǎng)。第32頁/共94頁第三十二頁，共95頁。4.細菌的純化

挑取分離出的典型單菌落平板劃線培養(yǎng)（2皿），如此重復1－2次，最后，在均勻一致的平板中，挑取典型菌落移植在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，長成后在4℃環(huán)境中保存菌種。第33頁/共94頁第三十三頁，共95頁。1.配制107-108CFU/mL的細菌懸浮液，菌齡48小時左右；（二）致病性測定

2.指示植物的選擇：一般用煙草，在假單胞和黃單胞菌屬上較適用。第34頁/共94頁第三十四頁，共95頁。3.接種方法：用注射器將細菌液從煙草下表皮注入葉肉細胞間。用滅菌水作陰性對照，同屬HR陽性的菌株作陽性對照。4.培養(yǎng)條件：接種后的植物應保持在25℃，相對濕度較高（85%）的條件下。5.結果觀察：在24～48h表現(xiàn)枯斑為陽性反應，3d左右出現(xiàn)黃斑為陰性反應。第35頁/共94頁第三十五頁，共95頁。三作業(yè)：1.簡述本實驗中植物病原細菌的分離步驟及其操作注意事項2.煙草過敏性反應試驗能夠確定細菌的致病性嗎？為什么？第36頁/共94頁第三十六頁，共95頁。實驗三植物病原細菌的形態(tài)觀察

1.了解革蘭氏染色鑒定的快速鑒定方法；2.掌握革蘭氏染色和鞭毛染色的方法；3.掌握細菌培養(yǎng)性狀的描述特征。

一、實驗目的

第37頁/共94頁第三十七頁，共95頁。二、實驗內容和操作方法

1.結晶紫草酸銨染色（一）革蘭氏染色

（1）試劑A.結晶紫草酸銨染劑：溶液Ⅰ：結晶紫2.0g，酒精（95%）20mL混合溶液Ⅰ和Ⅱ，過濾，貯藏于試劑瓶中，24h后使用。溶液Ⅱ：草酸銨0.8g，蒸餾水80mL第38頁/共94頁第三十八頁，共95頁。C.復染劑原液：番紅O2.5g，95%酒精100mL復染劑：原液10mL，蒸餾水90mLB.魯戈爾碘液：碘1.0g，碘化鉀2g蒸餾水300mL。將碘和碘化鉀在研缽中研和，慢慢加水并繼續(xù)研和直至碘和碘化鉀溶解，然后加水稀釋到300mL，盛入棕色試劑瓶，放暗處備用。第39頁/共94頁第三十九頁，共95頁。（2）染色程序A.配制細菌懸浮液：菌齡16hB.在干凈的載玻片上涂片、風干，不要加熱，然后在火焰上通過2次，固定玻片。C.結晶紫染色1分鐘，水洗數(shù)秒鐘，吸干。D.碘液處理1分鐘，水洗，吸干。E.用95%酒精褪色約30秒。水洗，吸干F.番紅O復染10秒，水洗，吸干G.加1滴香柏油，在油鏡下鏡檢，紅色為革蘭氏陰性菌，紫色為革蘭氏陽性菌。第40頁/共94頁第四十頁，共95頁。2.氫氧化鉀溶解試驗（1）試劑：3％氫氧化鉀（2）方法：取1－2滴3％氫氧化鉀溶液置于干凈的玻片上，用牙簽取新鮮細菌培養(yǎng)物與氫氧化鉀混合，充分攪拌10－20秒，如果液滴變粘稠并可拉出絲狀物體，表示測試菌為革蘭氏陰性菌，反之則為革蘭氏陽性菌。第41頁/共94頁第四十一頁，共95頁。1.試劑（二）鞭毛染色（西薩－基爾法）

（1）媒染劑：單寧酸10g，ALCL3.6H2O18g，ZnCL210g，堿性品紅1.5g，60%酒精40mL在研缽中加入酒精和上述各種成分，充分研磨后，再加入其余的酒精。使用前用蒸餾水稀釋2倍，染色時過濾，濾液直接滴在涂片上。第42頁/共94頁第四十二頁，共95頁。溶液Ⅰ：堿性品紅0.3g，酒精（95%）10mL溶液Ⅰ和Ⅱ分別配制后混合。溶液Ⅱ：苯酚（結晶）5g，蒸餾水95mL（2）染液：2.染色步驟（1）載玻片準備：選用新的或沒有傷痕的，先用洗潔精浸泡洗滌，用清水洗凈后，再放入酸酒精（硫酸與酒精等量混合）中浸泡24-48h，取出后用清水洗凈，再用蒸餾水洗，瀝干水后，浸泡在95%酒精中備用。第43頁/共94頁第四十三頁，共95頁。（2）配制細菌懸浮液，菌齡很重要，一般適溫培養(yǎng)16-24h。用吸管沿試管壁緩緩加入無菌水5mL，，靜置30分鐘左右，配成菌懸液。（3）涂片：取浸在酒精中的載玻片，在火焰上燒去酒精，平放，用吸管吸取細菌懸浮液（以上層為好）在載玻片的一端滴一滴，然后將載玻片稍稍傾斜，使菌懸液從一端緩緩流向另一端，使涂片自然風干。第44頁/共94頁第四十四頁，共95頁。（4）媒染劑過濾后，直接將濾液滴在涂片上，處理5-7分鐘（5）用水輕輕洗去染媒劑，甩去載玻片上剩余的水，在空氣中干燥后，再加苯酚品紅染劑染色5分鐘。（6）水洗，在空氣中干燥后，加1滴香柏油，在油鏡下觀察鞭毛的數(shù)量和著生位置。第45頁/共94頁第四十五頁，共95頁。1.革蘭氏染色反應和鞭毛染色在植物病原細菌鑒定中有何作用？為什么？2.細菌鞭毛染色對菌齡的要求比較嚴格，在操作過程中也要注意動作的輕柔，為什么？3觀察和記錄NA平板上的細菌菌落性狀、菌體形狀、運動性和革蘭氏染色結果。三作業(yè)第46頁/共94頁第四十六頁，共95頁。實驗四

植物病原細菌生理生化測定

1.掌握無菌操作技術；2.了解各種生理生化性狀測定常用試劑的配制方法；3.掌握各種生理生化性狀的觀察方法。一、實驗目的

第47頁/共94頁第四十七頁，共95頁。二、實驗內容和方法

1.產酸和產氣試驗（一）碳素化合物的利用1）接菌培養(yǎng)：一般每5mL培養(yǎng)液接種0.1mL108CFU/ml菌懸液，適溫下培養(yǎng)3-4周。2）結果觀察：產酸：培養(yǎng)液變?yōu)辄S色產堿：培養(yǎng)液變?yōu)樗{色CK：培養(yǎng)液為草綠色變色產氣：杜氏發(fā)酵小玻管出現(xiàn)空隙CK：杜氏發(fā)酵小玻管不出現(xiàn)空隙產氣第48頁/共94頁第四十八頁，共95頁。（1）配方：NH4H2PO41.0ｇ，氯化鉀0.2ｇ，MgSO4.7H2O0.2ｇ，蒸餾水1000ｍL，溴百里酚蘭（1.6%酒精溶液）1.5mL;1%碳素化合物。Ayers培養(yǎng)基：碳素化合物產酸試驗

單糖（葡萄糖、半乳糖）；雙糖（麥芽糖、乳糖）；多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。

有的細菌不產酸和氣，有的只產酸不產氣，少數(shù)植物病原細菌既產酸又產氣第49頁/共94頁第四十九頁，共95頁。（3）分裝：將上述培養(yǎng)基分裝于試管中，每管10mL左右。測定氣體產生時，加上杜氏發(fā)酵小玻管后滅菌。（2）配制過程：將NH4H2PO4、氯化鉀、MgSO4.7H2O溶于蒸餾水，調節(jié)pH7.0后加入溴百里酚蘭，最后加入碳素化合物（也可分別滅菌后加入）第50頁/共94頁第五十頁，共95頁。

3）MR試驗結果觀察：取上述培養(yǎng)液5ml，加甲基紅試劑2~3滴，呈明顯紅色為陽性，呈黃色為陰性。2.甲基紅(MR)和VP(產3-羥基丁酮)試驗1）接菌培養(yǎng)：一般每5mL培養(yǎng)液接種0.1mL108CFU菌懸液，適溫下培養(yǎng)1周。2）甲基紅試劑配制：甲基紅0.1g溶解于300ml的95%酒精中，然后用蒸餾水稀釋至500ml。

4）VP試驗結果觀察：每毫升加0.1mL40%KOH溶液,置48-50℃水浴處理2h，充分搖動后觀察結果。在4h內出現(xiàn)紅色者為陽性反應。第51頁/共94頁第五十一頁，共95頁。測定亞硝酸，每試管加試劑A和試劑B各1ml如呈紅色，表示有亞硝酸根。1）接菌：在培養(yǎng)液中接菌后培養(yǎng)1周（二）氮素化合物的分解2）Griess-Llosvary試劑測定法試劑A：對氨基苯磺酸8.0g，5mol/L醋酸（286.0ml冰醋酸加715.0ml水）1000ml試劑B：二甲基-α-萘胺6ml，5mol/L醋酸1000ml1.硝酸鹽還原第52頁/共94頁第五十二頁，共95頁。1）醋酸鉛濾紙條的制備：將濾紙剪成5mm×50mm的小條浸在5%醋酸鉛溶液中，空氣中干燥后，在120℃烘箱中滅菌1h。2）接菌：將細菌接種于試管中的培養(yǎng)液中后，用上述制備的濾紙條夾在棉花塞和試管壁之間，使紙條懸在培養(yǎng)液面上，但不要碰到培養(yǎng)液，25℃培養(yǎng)2周。3）結果觀察：紙條變黑表示有硫化氫產生，為陽性反應。2.硫化氫產生第53頁/共94頁第五十三頁，共95頁。1）草酸濾紙條的制備：將濾紙剪成5mm×50mm的小條浸在飽和草酸溶液中，空氣中干燥后，在120℃烘箱中滅菌1h。2）接菌：將細菌接種于試管中的培養(yǎng)液中后，用上述制備的濾紙條夾在棉花塞和試管壁之間，使紙條懸在培養(yǎng)液面上，但不要碰到培養(yǎng)液，適溫培養(yǎng)1周。3）結果觀察：紙條變淡紅色表示有吲哚產生，為陽性反應。3.吲哚產生第54頁/共94頁第五十四頁，共95頁。1）接菌：采用穿刺法接菌后，放在適溫中培養(yǎng)1-3周。以不接菌試管為對照。（三）大分子化合物的利用2）結果觀察：將經過培養(yǎng)的接菌試管取出后，放在4℃冰箱中，看其是否凝固，如不凝固，則說明明膠分解而導致液化，為陽性反應。1.明膠液化第55頁/共94頁第五十五頁，共95頁。A.酸的產生：石蕊牛乳變成粉紅色，表示從乳糖產酸1）接菌：將培養(yǎng)基接種細菌于28℃培養(yǎng)1-3周，以不接種的石蕊牛乳做對照。2）結果觀察：2.石蕊牛乳反應B.凝固：產酸達到pH4.7發(fā)生凝塊，如產氣凝塊斷裂；凝乳酶的作用而凝固，凝塊收縮與乳清分離。C.胨化：牛乳變清，往往從表層開始D.堿的產生：石蕊牛乳變藍色，胨化時常呈堿性E.石蕊還原：石蕊變?yōu)闊o色第56頁/共94頁第五十六頁，共95頁。

在平板上加碘液后，培養(yǎng)基為深蘭色，菌落周圍有無色透明圈者為陽性。1）接菌：將細菌接種于淀粉瓊脂平板上，適溫下培養(yǎng)24-48小時。2）結果觀察：3.淀粉水解試驗第57頁/共94頁第五十七頁，共95頁。四、細菌的好氧性和厭氧性測定蛋白胨2.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鉀0.2g瓊脂3.0g蒸餾水1000.0mlpH7.4~7.8溴百里酚蘭（1.6％酒精溶液1.5ml）待培養(yǎng)基融化，并調pH后，裝于試管中，每支試管裝9ml

滅菌。培養(yǎng)基凝固后，用接種針蘸細菌懸浮液針刺接種，一直刺到管底。分別在培養(yǎng)2、4和7d后觀察記錄。

好氧性細菌，只在開管的上部生長；兼性厭氧性細菌，則在開管的上下部都能生長；厭氧性細菌，則只能在開管的下部和閉管中生長。第58頁/共94頁第五十八頁，共95頁。1）試劑：1%二甲基對苯二胺鹽酸鹽或1%四甲基對苯二胺鹽酸鹽。（五）其他生理生化試驗2）測定方法：1.氧化酶試驗A.Kovacs：在培養(yǎng)皿內放一張濾紙，濾紙上加3-4滴試劑使其濕潤，用牙簽挑取24h菌苔涂在濾紙上，60秒內變成紫色為陽性反應，60秒后或不便色為陰性。B.濾紙條法：用濾紙條蘸少許菌苔，加1d試劑，立即呈粉紅色為陽性第59頁/共94頁第五十九頁，共95頁。1）試劑：3%過氧化氫2）測定方法：挑取固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24-48h的菌苔，置于干凈玻片上，滴加過氧化氫。2.過氧化氫酶（接觸酶）試驗3）結果觀察：在半分鐘內有大量氣泡產生的為陽性，不產生氣泡的為陰性。第60頁/共94頁第六十頁，共95頁。三作業(yè)：1若有吲哚和硫化氫產生，其實驗的試管口上的濾紙條會發(fā)生什么樣的顏色變化，為什么？2在石蕊牛乳不能和其他細菌培養(yǎng)基一起滅菌，為什么？反應中會出現(xiàn)多種不同的反應，試分析其發(fā)生的原因？3觀察和記錄細菌氧化發(fā)酵試驗、MR試驗以及接觸酶試驗結果。第61頁/共94頁第六十一頁，共95頁。實驗五

植物病原細菌的PCR分子鑒定

1了解PCR反應的原理；掌握PCR反應的操作方法。一、實驗目的

第62頁/共94頁第六十二頁，共95頁。二、PCR擴增聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，簡稱PCR）第63頁/共94頁第六十三頁，共95頁。1、PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與目標序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈（以便它與引物結合，為下輪反應作準備）；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；第64頁/共94頁第六十四頁，共95頁。③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。第65頁/共94頁第六十五頁，共95頁。2TheprocedureofPCR5’5’3’3’d.NTPsTaqPrimers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’componentdenaturation5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’(94℃)

第66頁/共94頁第六十六頁，共95頁。extension5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’3’TaqTaq5’5’repeatedanneal(72℃)

(50℃)

第67頁/共94頁第六十七頁，共95頁。5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’2cycles4copies3cycles8copies5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’第68頁/共94頁第六十八頁，共95頁。10×反應緩沖液（含Mg2＋）5.0ldNTP混合物，10mmol/L1.0l上游引物，20mol/L1.0l下游引物，20mol/L1.0l模板DNA1.0lTaq

plusDNA聚合酶，5U/l0.5l加雙蒸水至終體積為50l

3反應體系取一0.5mlPCR薄壁管，依次加入以下試劑：

第69頁/共94頁第六十九頁，共95頁。第70頁/共94頁第七十頁，共95頁。第71頁/共94頁第七十一頁，共95頁。第72頁/共94頁第七十二頁，共95頁。第73頁/共94頁第七十三頁，共95頁。第74頁/共94頁第七十四頁，共95頁。第75頁/共94頁第七十五頁，共95頁。第76頁/共94頁第七十六頁，共95頁。第77頁/共94頁第七十七頁，共95頁。第78頁/共94頁第七十八頁，共95頁。第79頁/共94頁第七十九頁，共95頁。第80頁/共94頁第八十頁，共95頁。

M1234

3kb2kb0.8%agrosegelelectrophoresisoffulllengthPCRproductfromY160M:DNAmarker;1:Y160;2:positivecontrol;34:CK-2.7kb第81頁/共94頁第八十一頁，共95頁。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

酶及其濃度：目前有兩種TaqDNA聚合酶供應，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。4PCR反應操作注意事項：第82頁/共94頁第八十二頁，共95頁。dNTP的質量與濃度

dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris。HCL的緩沖液將其PH調節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。第83頁/共94頁第八十三頁，共95頁。模板(靶基因)核酸模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一。Mg2+濃度

Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應產物減少。第84頁/共94頁第八十四頁，共95頁。

PCR反應條件的選擇

PCR反應條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時間的設置：基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。第85頁/共94頁第八十五頁，共95頁。②退火(復性)溫度與時間：重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結合。由于模板DNA比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。③延伸溫度與時間：PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。第86頁/共94頁第八十六頁，共95頁。PCR延伸反應的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定P