～10

?！?0

。

PCR

1 范圍本文件規(guī)定了馬駑巴貝斯蟲(chóng)PCR法和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法。本文件適用于馬屬動(dòng)物馬駑巴貝斯蟲(chóng)病的分子生物學(xué)診斷。2 規(guī)范性引用文件文件。GB/T

6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T

27403 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范

食品分子生物學(xué)檢測(cè)3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。馬駑巴貝斯蟲(chóng)

caballi內(nèi)的血液原蟲(chóng)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

chain

reaction；用于擴(kuò)增位于已知序列之間DNA（deoxyribonucleic

acid，脫氧核糖核酸）的方法。模板DNA經(jīng)過(guò)DNADNA兩條鏈上的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火，接著在DNA聚合酶的催化下以4種dNTP（deoxyribo

nucleosidetriphosphate，脫氧核苷酸三磷酸）為底物，使退火引物得以延伸，如此反復(fù)變性、退火和DNA合成這6實(shí)時(shí)熒光 PCR

real-time

PCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),

利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR擴(kuò)增過(guò)程。Ct

值cycle

thresholdDB15/T

2835—2022每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。4 縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。bp:

堿基對(duì)(base

pair)CTAB：十六烷基三甲基溴化銨(cetyl

trithyl

ammonium

bromide)DNA:脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic

acid）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylene

acid)FAM:6-羧基熒光素PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（

chain

reaction）TAMRA:

羧基四甲基羅丹明(carboxy-tetramethyl-rhodamine)Tris：三（羥甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]5 試劑與材料水：符合

GB/T

6682

的要求。DNA

提取試劑盒。CTAB。Tris-HCl

8.0)。NaCl。EDTA。蛋白酶

K

溶液

。三氯甲烷。異丙醇。75%乙醇。Taq

dNTP（2.5

mmol/LPCR

buffer。DNA

分子量標(biāo)準(zhǔn)（

50

bp～500

bp實(shí)時(shí)熒光

預(yù)混液。陽(yáng)性對(duì)照樣品：采用已知含有馬駑巴貝斯蟲(chóng)的

DNA，或經(jīng)測(cè)序確認(rèn)的陽(yáng)性質(zhì)粒。見(jiàn)附錄

B。陰性對(duì)照樣品：采用已知不含有馬駑巴貝斯蟲(chóng)的

。空白對(duì)照：ddH2O。引物及探針:

1。-3PCR-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3200bp-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3PCR-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3200bp-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3-TGAGGCTAAGTACCAACCGCTG--3DB15/T

2835—2022表1馬駑巴貝斯蟲(chóng)檢測(cè)引物及探針6 儀器與設(shè)備PCR

凝膠成像儀。實(shí)時(shí)熒光

高速臺(tái)式離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速

12000

旋渦振蕩器（最高轉(zhuǎn)速

rpm）。核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。恒溫水浴鍋。天平（感量

0.01

g）。單孔道微量移液器：0.5

L～10

L、10

L～

L、20

L～

L、

L～1000

L。7樣品采集使用添加EDTA抗凝劑的采樣管無(wú)菌采集血樣。8 檢測(cè)方法PCR

法8.1.1樣品的總

參照附錄A中提取樣品DNA的方法提取，也可采用等效商品化的血液提取試劑盒進(jìn)行。當(dāng)濃度吸光度值A(chǔ)260/A280在～1.9PCR及空白提取對(duì)照。8.1.2PCR

反應(yīng)體系為50

L，體系組成見(jiàn)表2。10

0.25dNTP2.5

10

10

ddH2

50DB15/T

2835—2022表2PCR

擴(kuò)增反應(yīng)體系組成檢測(cè)過(guò)程分別設(shè)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白提取對(duì)照。8.1.3PCR

反應(yīng)條件預(yù)變性：95

℃，3

min；變性：

95

30

s；延伸退火：58

℃，1

min，個(gè)循環(huán)；

℃延伸5

min；4

℃保存。8.1.4PCR

擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)用TBE電泳緩沖液配制成瓊脂凝膠。將瓊脂凝膠放入電泳槽中，加入1×電泳緩沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠。將5

L～8

L

擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合點(diǎn)樣。9

V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠中部。利用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并記錄。8.1.5 結(jié)果判定與表述8.1.5.1 質(zhì)量控制質(zhì)控對(duì)照應(yīng)滿(mǎn)足以下條件，否則應(yīng)重新實(shí)驗(yàn)：a)

陽(yáng)性對(duì)照:

200

bp

的特異性條帶；b)

陰性對(duì)照：不出現(xiàn)

的特異性條帶；c)

空白對(duì)照：不出現(xiàn)

的特異性條帶。8.1.5.2 結(jié)果判定8.1.5.2.1質(zhì)控對(duì)照成立條件下，兩個(gè)平行樣品均出現(xiàn)

的特異性條帶為陽(yáng)性。8.1.5.2.2 質(zhì)控對(duì)照成立條件下，兩個(gè)平行樣品均不出現(xiàn)

200

bp

的特異性條帶為陰性。8.1.5.3結(jié)果表述8.1.5.3.1 PCR

產(chǎn)物為陽(yáng)性者，表述為“檢出馬駑巴貝斯蟲(chóng)”。8.1.5.3.2 PCR

產(chǎn)物為陰性者，表述為“未檢出馬駑巴貝斯蟲(chóng)”。實(shí)時(shí)熒光

8.2.1 樣品的總

同7.1.1操作。8.2.2 熒光定量

mol/L

12.5101010ddH2O

25DB15/T

2835—2022反應(yīng)體系體積為25

L，見(jiàn)表3。表3 熒光定量

擴(kuò)增反應(yīng)體系組成檢測(cè)過(guò)程分別設(shè)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白提取對(duì)照。8.2.3反應(yīng)條件預(yù)變性：95

℃，3

min；變性：

95

15

s；延伸退火：58

℃，1

min，個(gè)循環(huán)。在58

收集熒光信號(hào)值。8.2.4結(jié)果判定與表述8.2.4.1 質(zhì)量控制質(zhì)控對(duì)照應(yīng)滿(mǎn)足以下條件，否則應(yīng)重新實(shí)驗(yàn)：a)

空白對(duì)照：無(wú)熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，相應(yīng)的

Ct

值大于等于

40.0；b)

陰性對(duì)照：無(wú)熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，相應(yīng)的

Ct

值大于等于

40.0；c)

陽(yáng)性對(duì)照：有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線(xiàn)，相應(yīng)的

Ct

值小于等于

35.0。8.2.4.2結(jié)果判定8.2.4.2.1 質(zhì)控對(duì)照成立條件下，2

個(gè)平行樣檢測(cè)結(jié)果

40.0，可判定被檢樣品為陰性。8.2.4.2.2 質(zhì)控對(duì)照成立條件下，2

個(gè)平行樣檢測(cè)結(jié)果

35.0，可判定被檢樣品為陽(yáng)性。8.2.4.2.3 質(zhì)控對(duì)照成立條件下，至少

1

個(gè)平行樣檢測(cè)結(jié)果

值

35.0～40.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲

DNA

模板量重做實(shí)時(shí)熒光

PCR

值小于

40.0型的擴(kuò)增曲線(xiàn)，可判定被檢樣品為陽(yáng)性；再次檢測(cè)結(jié)果

Ct

值大于等于

40.0，可判定被檢樣品為陰性。8.2.4.3 結(jié)果表述8.2.4.3.1 檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性者，表述為“檢出馬駑巴貝斯蟲(chóng)”。8.2.4.3.2 檢測(cè)結(jié)果為陰性者，表述為“未檢出馬駑巴貝斯蟲(chóng)”。9 防止交叉污染措施檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施按照GB/T

27403中的規(guī)定執(zhí)行。DB15/T

2835—2022

附 錄 A（資料性）溶液配制及提取方法A.1 CTAB-提取緩沖液將5

g

CTAB，20.45

g

，3.03

g

Tris，1.86

g

Na2-EDTA

mL水中，用鹽酸調(diào)

pH

后，定容至250

mL，115

℃高壓15

。A.2 CTAB-沉淀液稱(chēng)0.2

g

CTAB,0.234

g

，定容至100

mL，115

℃高壓15

。A.3 1.2

mol/L

NaCl

溶液：稱(chēng)取28

g

NaCl，定容至

mL，115

℃高壓15

min。A.4 DNA

提取方法：A.4.1 稱(chēng)取樣品

g～1

g加入

mL～3.5

mL

CTAB12

L～20

L蛋白酶K（根據(jù)CTAB265

℃至少1

h(過(guò)夜孵育最好)樣品膨脹，則可再多加每次多1

mL，最多10

。A.4.2 4000

～5000

離心

。A.4.3將上清（約1

mL）加入無(wú)菌EP2

mL

L氯仿，渦旋30

s12000

10

min。A.4.4 取上清600

L～

L加入無(wú)菌EP2倍體積的CTAB1min。A.4.512000

rpm離心

L的1.2

mol/L

NaCl溶液。（2管合并共用350L溶液）。A.4.6 加入

L氯仿，渦旋30

min，

12000

10

min。A.4.7取上清液至無(wú)菌EP0.8倍體積的異丙醇，手搖混勻，室溫孵化至少20

min，12000

rpm離心

，去上清，沉淀用

L

75%的乙醇洗滌，再12000

rpm10

min。A.4.8 去上清后，干燥沉淀，60

℃下15

s～20

sA.4.9 將沉淀溶于100

L滅菌水或TE

或DEPC水中。DB15/T

2835—2022

附 錄 B（規(guī)范性）馬駑巴貝斯蟲(chóng)的目標(biāo)擴(kuò)增序列CTCTCCAAAGT