培養(yǎng)細(xì)胞傳代與計(jì)數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念

傳代：細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。

原代培養(yǎng)取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。

接觸抑制（Contactinhibition）細(xì)胞相互接觸時(shí)，將停止增長(zhǎng)；細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的G0期；轉(zhuǎn)化的細(xì)胞卻可以繼續(xù)生長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞重疊堆積生長(zhǎng)。體外培養(yǎng)的細(xì)胞增殖能力不是無(wú)限的，傳代次數(shù)有一定的界限，稱為“Hayflick極限”。傳代次數(shù)與物種壽命有關(guān)：小鼠壽命3年，傳代12次；龜壽命200年，傳代140次。傳代次數(shù)與個(gè)體年齡成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病兒童，2-10代。

細(xì)胞傳代次數(shù)（PassageNumber）

原代培養(yǎng)

（primary

culture）從動(dòng)物機(jī)體取出的進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。生長(zhǎng)緩慢，繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以內(nèi)）停止生長(zhǎng)。

克隆（clone）亦稱無(wú)性繁殖系或無(wú)性系。對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，克隆是指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。

細(xì)胞系（cell

line）從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在培養(yǎng)條件下可無(wú)限繁殖

細(xì)胞株（cell

strain）從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群，能夠繁殖50代左右，在培養(yǎng)過(guò)程中其特征始終保持。原代培養(yǎng)與細(xì)胞系

TheAmericanTypeCultureCollection(ATCC)TheEuropeanCollectionofAnimalCellCulture(ECACC)NationalInstituteofHealth(NIH),USANationalCancerInstitute(NCI),USA細(xì)胞系資源有限細(xì)胞系，無(wú)限細(xì)胞系

細(xì)胞系

細(xì)胞株

培養(yǎng)細(xì)胞的特性

培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式貼附生長(zhǎng)：必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。見于各種實(shí)體瘤細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)：于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞

每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止期（平臺(tái)期）游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘——4小時(shí)貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時(shí)貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）潛伏期此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)話動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時(shí)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞周期研究：細(xì)胞周期同步化停止期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性培養(yǎng)細(xì)胞的計(jì)數(shù)的意義在細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，往往要進(jìn)行細(xì)胞的計(jì)數(shù)、調(diào)整細(xì)胞的密度，才可進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作（如：細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)染、流式細(xì)胞術(shù)等），因此是必不可少的一種基本技能。血球計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)圖示細(xì)胞計(jì)數(shù)①將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上；②將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片與計(jì)數(shù)板之間；③靜置3分鐘；④鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)算左側(cè)和上方的。然后按如下公式計(jì)算：

細(xì)胞數(shù)/mL=（4大格細(xì)胞總數(shù)/4）×10000（/4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)；×104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：1.0mm×1.0mm×0.1mm＝0.1mm3

而1ml＝1000mm3

）細(xì)胞計(jì)數(shù)圖示實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)與要點(diǎn)1.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；

2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。3.取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；4.數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)右線，不計(jì)左線。5.操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。

實(shí)驗(yàn)步驟①取一瓶傳代的細(xì)胞，待長(zhǎng)成單層后以被使用。用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測(cè)細(xì)胞懸液。②取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上.③吸取10μL細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：將待測(cè)細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡