凝血因子Ⅻ46C/T多態(tài)性一家系報(bào)道及相關(guān)文獻(xiàn)【摘要】目的對(duì)1個(gè)表型診斷為f?缺乏的家系進(jìn)展基因診斷。方法檢測(cè)先證者及其父母的血漿f?:，以其外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取的基因組dna為模板，pr擴(kuò)增f12基因的全部外顯子及其側(cè)翼序列，pr產(chǎn)物純化后直接測(cè)序。結(jié)果先證者及其父、母f?:分別是52.5%、78.6%、89%，直接測(cè)序結(jié)果提示先證者f12基因的第1外顯子46位堿基即啟動(dòng)子上游-4位為t/t基因型，其父、母在該位點(diǎn)均為/t基因型。該基因的其它編碼序列和側(cè)翼部位未發(fā)現(xiàn)有堿基改變。結(jié)論f12基因的46t/t多態(tài)性可能是導(dǎo)致先證者f?缺乏的原因。【關(guān)鍵詞】凝血因子?;基因;多態(tài)性;家系analysisftheagulatinfatr?46/tplyrphisinapedigreeandrelatedliteraturerevie(departentfheatlgy,theaffiliateddruterhspital,nanjinguniversityedialshl,nanjing，210008,hina)keyrds：agulatinfatr?;gene;plyrphis;pedigree凝血因子?(agulatinfatr?，f?)即hagean因子，是一種絲氨酸蛋白酶，主要由肝臟合成，參與內(nèi)源性凝血途徑的接觸相激活。遺傳性f?缺陷癥是一種罕見的常染色體隱性遺傳性出血性疾病，患者常表現(xiàn)為aptt延長但在臨床上常無出血病癥。本文對(duì)1個(gè)表型診斷為f?缺乏的家系進(jìn)展了基因診斷并就f?在血栓形成中的作用進(jìn)展文獻(xiàn)復(fù)習(xí)。1資料與方法1.1家系資料先證者，男，8歲，因"皮膚瘀點(diǎn)、瘀斑1周"就診。患者無明顯誘因出現(xiàn)右上肢皮膚瘀點(diǎn)、瘀斑1周，凝血象檢查發(fā)現(xiàn)aptt67s，正常血漿混合試驗(yàn)aptt32s?；颊吒改阜墙H結(jié)婚，家族中無類似病史。先證者及其父母肝功能檢查正常。1.2血標(biāo)本的采集、處理和dna制備先證者及其父、母采集外周靜脈血，枸櫞酸鈉抗凝，4℃4000r/in離心15in后別離乏血小板血漿，分裝后-80℃保存，用于凝血指標(biāo)的測(cè)定。外周血單個(gè)核細(xì)胞按常規(guī)酚-氯仿法抽提基因組dna，用于pr擴(kuò)增。1.4引物設(shè)計(jì)根據(jù)f?基因序列(genbankaf538691)，參照文獻(xiàn)[1]，應(yīng)用prier5軟件共設(shè)計(jì)7對(duì)引物以覆蓋該基因的全部外顯子區(qū)域及其側(cè)翼序列。引物由上海申能博彩生物科技產(chǎn)品合成。1.5pr擴(kuò)增50μlpr反響體系包括：1×pr緩沖液，1.5l/lgl2，0.25l/ldntps，引物終濃度0.5μl/l，500ngdna模板，2.5utaqdna聚合酶(pr反響試劑均為上海申能博彩生物工程公司產(chǎn)品)。pr反響在abi2720dna熱循環(huán)儀上進(jìn)展，反響條件：95℃預(yù)變性5in，然后95℃變性30s，根據(jù)引物的不同分別在相應(yīng)的退火溫度退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10in。pr產(chǎn)物5μl在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，dl2000標(biāo)記pr產(chǎn)物大校1.6pr產(chǎn)物的純化和測(cè)序分析pr產(chǎn)物進(jìn)展割膠純化(申能博彩pr產(chǎn)物膠回收純化試劑盒)，以制備測(cè)序模板，采用雙脫氧鏈終止法在abi3130測(cè)序儀上進(jìn)展測(cè)序，用hras軟件將測(cè)序結(jié)果與美國nbi基因庫公布的f?基因序列(genebankaf538691)進(jìn)展比對(duì)，尋找基因突變。發(fā)現(xiàn)基因突變的序列那么反向測(cè)序予以證實(shí)。2結(jié)果2.1表型檢測(cè)先證者凝血象檢查顯示aptt、pt、tt分別為67s(參考值29～43s)、12.6s(11～14s)、20.0s(14～20s)，fbg3.2g/l(2.0～4.0g/l)，正常血漿混合試驗(yàn)aptt32s。各種凝血因子活性檢測(cè)顯示fⅷ:91%，fⅸ:94.0%，f?:70.0%，f?:52.5%，fⅴ:99.6%，fⅹ:82.1%(上述各因子活性正常參考值均為50%～150%)。其父親aptt、pt、tt、fbg、f?:分別為37.5s、11.7s、18s、3.8g/l、78.6%，其母親aptt、pt、tt、fbg、f?:分別為35.9s、11.6s、17.5s、2.2g/l、89%。2.2f?基因分析對(duì)先證者f?基因的所有14個(gè)外顯子全部區(qū)域及其側(cè)翼序列pr產(chǎn)物進(jìn)展測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)先證者在f?基因第1外顯子46位堿基即啟動(dòng)子上游-4位為t/t基因型。該基因的其它編碼序列和側(cè)翼部位未發(fā)現(xiàn)有堿基改變。其父親、母親的f12基因在該位點(diǎn)均為/t基因型。測(cè)序結(jié)果見圖1。圖1f?基因外顯子1部分測(cè)序結(jié)果3討論本文中的先證者因無誘因出現(xiàn)皮膚瘀斑，凝血象檢查發(fā)現(xiàn)aptt延長而正常混合血漿試驗(yàn)?zāi)芗m正，說明是內(nèi)源性凝血途徑的凝血因子活性缺乏;各種凝血因子活性檢查提示僅f?:52.5%為正常參考值的低值，其余凝血因子活性均在正常參考范圍，顯示是f?:降低導(dǎo)致aptt延長;基因測(cè)序提示f?基因外顯子1的第46位堿基為t/t基因型，其父、母那么為/t基因型，提示先證者的基因型為遺傳所致。研究說明，在f?基因5'端非翻譯區(qū)、atg起始密碼子的上游4個(gè)堿基處的46/t基因型為多態(tài)性位點(diǎn)。當(dāng)被t交換后，產(chǎn)生了一個(gè)新的atg起始密碼子，如圖2所示。按照kzak理論[3]，一方面由于新的起始密碼子所存在的部位不是最正確起始位點(diǎn)，基因調(diào)控使得核糖體蛋白跳過新的起始密碼子而與原起始密碼子相結(jié)合以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄;另一方面，由于從新的起始密碼子開場(chǎng)轉(zhuǎn)錄后可在其后的第7個(gè)堿基處出現(xiàn)終止密碼子(tga)而使蛋白轉(zhuǎn)錄終止，40srna可在下游重新定位后開場(chǎng)新的轉(zhuǎn)錄過程。因此，從理論上推測(cè)，被t交換后引起f?活性減低。圖2f?基因外顯子146/t改變kanaji等[1]的研究顯示46位或t對(duì)f?基因的轉(zhuǎn)錄及其rna的穩(wěn)定性無影響，但與46相比，46t時(shí)rna的翻譯顯著降低，提示t/t基因型因顯著降低f?基因的翻譯效能而減少f?蛋白的合成;對(duì)安康人群血漿f?程度的研究顯示，46/、/t、t/t基因型時(shí)的f?活性分別為170±38%、141±29%、82±19%，f?抗原分別為176±27%、123±34%、61±11%，并發(fā)現(xiàn)該部位/t多態(tài)性位點(diǎn)在東方人群中的等位基因頻率為0.27/0.73，而在高加索人中為0.8/0.2。高加索人群的f?活性較東方人為高可能就是這個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)頻率低的緣故。endler1等[4]對(duì)100例奧地利新生兒進(jìn)展了研究，發(fā)現(xiàn)f?基因46/基因型占64%，/t占29%，t/t占7%;對(duì)80例aptt延長的患者(排除凝血因子ⅷ、ⅸ和?等缺乏)進(jìn)展的研究顯示具有46/等位基因的患者其f?活性為1.17u/l、/t者為0.70u/l、t/t為0.44u/l。bah等[5]對(duì)2615例進(jìn)展冠脈血管造影的德國人進(jìn)展的46/t等位基因的檢查，發(fā)現(xiàn)/基因型占57%、/t基因型占38%,t/t基因型占5%，對(duì)f?活性及活化的f?程度的研究也證實(shí)了以上兩個(gè)研究結(jié)果。故t/t基因型f?的蛋白表達(dá)量顯著低于/基因型f?的蛋白表達(dá)量。國內(nèi)王學(xué)鋒等[6]在研究2個(gè)遺傳性凝血因子?缺陷癥家系f?基因突變時(shí)也發(fā)現(xiàn)含有t/t基因型的先證者其f?活性也較/t基因型的為低。本文中的先證者經(jīng)基因測(cè)序?yàn)?6t/t基因型，其父、母均為46/t基因型，故其f?活性較其父、母的低。盡管f?在內(nèi)源性凝血途徑的啟動(dòng)環(huán)節(jié)中可能有重要作用，但其缺乏在臨床上卻無明顯的出血，僅表現(xiàn)為aptt延長。相反，許多報(bào)道發(fā)現(xiàn)f?缺乏與血栓栓塞性疾病的發(fā)病有關(guān)，認(rèn)為f?缺乏是血栓栓塞性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之一。santaara等[7]對(duì)205例西班牙裔缺血性腦中風(fēng)患者進(jìn)展的f?基因46/t多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)46/基因型者f?活性為127.6%,/t基因型為95.2%,t/t基因型為57.9%，46t/t基因型在患者中占5.9%，正常對(duì)照占1.3%，認(rèn)為46t/t基因型是缺血性腦中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)因素;reuner等[8]對(duì)78例德國裔腦靜脈血栓形成患者的病因研究，發(fā)現(xiàn)46t/t基因型在患者中占16.7%，而正常對(duì)照僅占5.5%，提示46t/t基因型是腦靜脈血栓形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。假如單從f?缺乏的角度出發(fā)(即無論何種原因?qū)е耭?缺乏)，有許多報(bào)道已發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。halbayer等[9]報(bào)道f?缺乏與心肌梗死的發(fā)生、開展具有相關(guān)性。kuhli等[10]報(bào)道在≤45歲的視網(wǎng)膜靜脈阻塞的患者中，f?缺乏與其發(fā)病具有高度相關(guān)性。pauer等[11]報(bào)道f?缺乏與原發(fā)性習(xí)慣性流產(chǎn)具有高度相關(guān)性。f?缺乏易致血栓形成的機(jī)制可能與f?通過直接及間接途徑激活纖溶系統(tǒng)、導(dǎo)致纖維蛋白溶解有關(guān)[12]。f?活性減低，那么不能有效激活纖溶系統(tǒng)，易致血栓形成。但是，也有不支持f?易致血栓形成的報(bào)道，guhi等[13]報(bào)道ff?基因46/t多態(tài)性與冠心并靜脈血栓栓塞性疾并中風(fēng)等無相關(guān)性。renn等[14]報(bào)道在f?缺乏的小鼠模型中，動(dòng)脈血栓形成被明顯削弱，但沒有過度出血表現(xiàn);kleinshnit