探討松材線蟲侵染植株后對寄主光合作用的影響,植物學(xué)論文松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus是國際上公認(rèn)的重要檢疫性有害生物。它能引起松材線蟲病〔PineWiltDisease或稱PineWoodNematode〕〔柴希民等，2003;楊寶君，2003〕,使感病植株迅速枯死，且傳播蔓延極快，一旦感病將造成極為嚴(yán)重的損失，不管是幼齡小樹，還是幾十年生的參天大樹都可被害致死，松樹感病后一般1-3個月內(nèi)即可全株枯死〔秦復(fù)牛等，2003〕.該病最早于1905年在日本九州島的長崎發(fā)生。我們國家于1982年在南京中山陵的黑松Pinusthunbergii上發(fā)現(xiàn)松材線蟲，現(xiàn)已迅速蔓延。盡管松材線蟲病的發(fā)現(xiàn)已有近百年的歷史〔Yano,1913〕,但松材線蟲的致病性卻在1971年最先由清原和德重在接種試驗(yàn)中才得到證實(shí)〔清原友也，1971〕,后續(xù)的研究進(jìn)一步明確了松材線蟲是引起松樹死亡的病原。人們只是在近四十年內(nèi)，才對松材線蟲病進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，主要牽涉不同寄主松樹品種的抗病性、病原線蟲的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)、線蟲的傳播媒介、病害的發(fā)生和擴(kuò)散規(guī)律以及防治和控制等〔張星耀等，2003;李蘭英等，2006;胡霞等，2007;劉洪劍等，2007;謝立群等，2007〕.由于松材線蟲病是以病原線蟲為主導(dǎo)，綜合有人為介入、媒介天牛傳播、寄主松樹以及環(huán)境因素互作的一種復(fù)雜病害系統(tǒng)，因而隨著研究的深切進(jìn)入，人們發(fā)現(xiàn)該病與通常認(rèn)識的松材線蟲有很多不同，尤其是其致病機(jī)理尚不明確，致使對該病的防治和控制工作進(jìn)展緩慢〔朱克恭，1992;趙博光等，2000〕.綠色植物光合作用是森林生態(tài)系統(tǒng)能量流動和物質(zhì)循環(huán)的基礎(chǔ)，也是生物固碳的最主要方式，因而，以光合作用為基礎(chǔ)，研究植被生產(chǎn)力構(gòu)成經(jīng)過及其對將來氣候變化的響應(yīng)，一直是植物生理學(xué)及陸地碳循環(huán)研究領(lǐng)域的熱門。當(dāng)前，國內(nèi)外對植物光合作用的研究大多集中在農(nóng)作物、草木或樹苗等易觀測對象上〔于強(qiáng)等，1999〕,而對高大喬木的研究則相對較少，尤其是在受病蟲害危害后對植物光合生理的影響方面，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。部分學(xué)者討論了感染松材線蟲病后，松樹光合作用與致病性的互相關(guān)系。Melakeberhan等用松材線蟲接種歐洲赤松幼苗，發(fā)現(xiàn)接種后24-36h葉綠素?zé)晒饧搬樔~水勢會降低；研究后指出，對光合作用的影響可能亦是導(dǎo)致松樹死亡的重要因素〔Melakebaranetal.,1990,1991〕.但另有研究表示清楚，在病害發(fā)展早期，當(dāng)葉部水勢高時(shí)松苗光合特性不受影響，到后期松苗光合作用降低是由于葉部水分虧缺引起的〔Fukudaetal.,1992〕.但對野外自然條件下感染松材線蟲病后松樹進(jìn)行光合生理研究的報(bào)道尚未見到。本實(shí)驗(yàn)以黑松、馬尾松為研究對象，研究討論了松材線蟲在自然侵染植株后，對寄主光合作用和針葉部分生理生化指標(biāo)的影響，為進(jìn)一步研究松材線蟲的致病機(jī)理和早期診斷提供理論根據(jù)。1材料與方式方法1.1供試材料試驗(yàn)樣地分別選在浙江省平湖市平湖林場和余姚市牟山鎮(zhèn)，兩地均屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候區(qū)，四季分明、氣候溫和、日照充足、雨量充沛。分別選取自然感病狀態(tài)下的黑松和馬尾松。根據(jù)樹勢生長狀況、松針顏色及松脂流量變化，結(jié)合線蟲分離，將不同受害程度的松樹分為三個階段，同時(shí)選擇健康的一類〔無線蟲分離到〕作為對照，詳細(xì)標(biāo)準(zhǔn)如下：健康期〔HW〕:外觀健康，松脂分泌正常，沒有能分離到松材線蟲；感病初期〔IP〕:外觀健康，松脂分泌明顯減少，天牛取食點(diǎn)附近有少量松針褪色、萎蔫；感病中期〔MP〕:頂梢及其它嫩枝僅基部偶見黃色針葉，其余枝條上出現(xiàn)部分黃色針葉，其它針葉失去光澤；感病重期〔TP〕:頂梢及1a生嫩枝成灰綠色、萎蔫，部分針葉黃綠色，多年生枝條大多無綠色針葉。1.2采樣方式方法選取處于不同感病階段的平湖黑松、余姚馬尾松各3棵，采用離體測定，每株分上中下東西南北共測定12次，枝條采樣后立即水培同時(shí)進(jìn)行光合作用的測定；測定葉綠素含量和含水量指標(biāo)的樣品選取兩種松樹針葉部分，于低溫保鮮箱中保存至室內(nèi)測定；測量抗氧化酶活性的針葉樣品則于液氮罐中冷凍保存至室內(nèi)進(jìn)行測定。1.3氣體交換和葉綠素?zé)晒鉁y定采用美國LI-COR公司生產(chǎn)的便攜式光合系統(tǒng)〔LiCor-6400,USA〕測定光響應(yīng)曲線和熒光葉室〔6400-09〕測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，重復(fù)12次；光響應(yīng)曲線測定按Kitao等〔2003〕的方式方法進(jìn)行，光量子通量密度〔PARI〕設(shè)置為0,100,200,400,600,900,1500〔單位mol/m2/s〕.其他的葉綠素?zé)晒鈪?shù)按Genty等〔1989〕的公式計(jì)算。因針葉狹小，無法填滿葉室，故采用一束針葉平鋪葉室，將整個葉室外表填滿，每束平均18根針葉。1.4生化分析采用直接浸提法〔李得孝等，2005〕測定針葉色素含量；烘干法〔鄭炳松，2006〕測定針葉含水量〔鮮重的〕;滴定法〔鄭炳松，2006〕測定過氧化氫酶活性；分光光度法〔鄭炳松，2006〕測定超氧化物歧化酶活性；愈創(chuàng)木酚法〔王學(xué)，2006〕測定過氧化物酶活性。1.5數(shù)據(jù)處理用Sigmaplot軟件作不同感病階段凈光合作用速率圖和葉綠素?zé)晒鈪?shù)響應(yīng)曲線；利用PhotosynAsisstant軟件計(jì)算光補(bǔ)償點(diǎn)和光飽和點(diǎn)；用SPSS軟件作差異分析。2結(jié)果與分析結(jié)果顯示，兩種松樹各個感病階段凈光合速率差異性顯著。由圖1可看出，自然感病黑松和馬尾松各感病階段凈光合作用速率〔Pn〕大小依次為，感病初期健康階段感病中期感病重期，即在感病初期Pn最高，華而不實(shí)馬尾松的Pn上升愈加明顯，但到感病中期后Pn迅速下降，馬尾松光合速率數(shù)值在感病中期已為負(fù)值。黑松的氣孔導(dǎo)度〔Gs〕隨著感病程度的遞增，出現(xiàn)明顯的下降，馬尾松的Gs在感病初期略有上升，隨后迅速下降。但二者的胞間CO2濃度〔Ci〕數(shù)值未出現(xiàn)明顯下降，反而略有上升趨勢。黑松、馬尾松的蒸騰速率〔Tr〕隨著病程的加重出現(xiàn)下降趨勢，其變化趨勢同Gs非常類似。【圖1】由圖2能夠看出，黑松和馬尾松的ФPSⅡ在感病初期并沒有下降，馬尾松的ФPSⅡ反而略有上升，但隨著感病程度的增加，兩者的ФPSⅡ均迅速下降，在任何光強(qiáng)下，兩者的ФPSⅡ均顯著低于感病初期和健康木。Fv/Fm和qP隨著感病進(jìn)程的增加，數(shù)值也不斷下降，變化規(guī)律與ФPSⅡ基本類似。不同感病階段的NPQ數(shù)值也出現(xiàn)變化，黑松的NPQ在感病初期明顯上升，而感病中期只在低光強(qiáng)下高于健康木，在高光強(qiáng)下與健康木基本一致，在感病重期NPQ則迅速下降。馬尾松的NPQ在感病初期與健康木基本一致，在感病中后期迅速下降?！緢D2】從表1可見黑松和馬尾松感病初期，針葉葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量會先上升，隨后會持續(xù)呈現(xiàn)下降的趨勢。從圖3能夠看出松材線蟲侵染后，馬尾松感病初期針葉含水量較健康階段略有上升，隨后逐步下降，而黑松的針葉含水量則隨感病程度持續(xù)下降，且下降速度略快于馬尾松。黑松和馬尾松受松材線蟲感染后，導(dǎo)致了兩種松樹的抗氧化酶系統(tǒng)活性發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示清楚，黑松和馬尾松針葉CAT活性出現(xiàn)持續(xù)下降，但馬尾松下降速度愈加迅速。兩種松樹的POD活性則在感病初期略有升高，隨后持續(xù)下降，兩種松樹的SOD活性在感病初期也略有升高，但隨后基本保持不變。【表1.圖3】3結(jié)論與討論研究結(jié)果表示清楚，松材線蟲侵染黑松和馬尾松后，在感病初期，馬尾松的Pn先出現(xiàn)上升現(xiàn)象，與健康階段的差異性較大，為什么引起這一現(xiàn)象有待于進(jìn)一步研究。由分析結(jié)果可看出，兩種試驗(yàn)樹隨著病程的加重，兩者的Pn均明顯下降。只是在感病中期馬尾松的Pn已出現(xiàn)負(fù)值，下降明顯，講明馬尾松對線蟲病可能比黑松更敏感，而楊寶君等人〔1987,1993〕則表示清楚馬尾松抗性更強(qiáng)，這與本試驗(yàn)結(jié)果不一致，可能與試驗(yàn)地環(huán)境因子有關(guān)，詳細(xì)原因還有待進(jìn)一步研究。葉片含水量是引起Pn下降的重要因素，有研究表示清楚松材線蟲侵入植株后會逐步導(dǎo)致松樹體內(nèi)水分輸導(dǎo)被中斷造成的，進(jìn)而導(dǎo)致水分虧缺〔談家金等，2001〕,本研究中松樹表現(xiàn)出萎蔫的異常感覺和狀態(tài)，針葉含水量也下降，這與Melakeberhan和Fukuda〔Melakebaranetal.1990;1991;Fukudaetal.,1992〕研究結(jié)果類似，進(jìn)一步證明了松樹感染松材線蟲后水分傳導(dǎo)受阻的結(jié)論。由于含水量的下降引起了針葉Pn、蒸騰作用和Gs的下降，但胞間CO2濃度數(shù)值未下降，因而光合作用速率的下降與氣孔因素?zé)o關(guān)。PhiPS2數(shù)值隨著松材線蟲的脅迫加深逐步下降，表示清楚電子傳遞速率下降，而ФPSⅡ則受Fv/Fm和qP兩者的影響。感病初期和健康階段Fv/Fm無明顯差異，隨著線蟲的大量繁衍出現(xiàn)持續(xù)下降，而qP在感病中期下降明顯，但隨后基本不變，表示清楚在感病中期電子傳遞的下降主要是Fv/Fm和qP兩者下降的結(jié)果，而在重期則是Fv/Fm下降的原因。葉綠素含量和類胡蘿卜素含量隨著病程的加重，也呈下降趨勢，間接導(dǎo)致Pn下降，但兩者在感病初期均有所升高，這可能是植物的防御反響〔鄒春靜等，2018〕.電子傳遞速率下降明顯，還會引起多余電子，植物在吸收的光能超過所利用的能量時(shí)，會啟動非輻射能量的耗散途徑來耗散過剩的激發(fā)能以保衛(wèi)光合機(jī)構(gòu)免受傷害，通過抗氧化酶系統(tǒng)清理過氧化氫酶能夠?qū)2O2分解為H2O和O2.過氧化物酶是植物體內(nèi)去除H2O2的重要保衛(wèi)酶，廣泛存在于植物的各個組織器官中，與植物抗性代謝關(guān)系很大。超氧化物歧化酶的活性與植物抗性密切相關(guān)，它能夠防御活性氧或其他過氧化物自由基對細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，普遍存在于植物的所有組織中。隨著松材線蟲侵染時(shí)間的延長，CAT活性下降表示清楚，受松材線蟲感染松樹體內(nèi)去除氧自由基的能力下降，細(xì)胞膜損傷加重〔陳玉惠等，2002〕.而受松材線蟲感染后，POD活性和SOD的活性升高則講明松樹本身通過水水循環(huán)的作用發(fā)起了一定的防御措施，但這種抗逆性隨著線蟲的大量繁衍而減弱至消失。同時(shí)，隨著非光化學(xué)淬滅系數(shù)〔NPQ〕數(shù)值的降低，寄主吸收的多余光能不能被耗散，構(gòu)成自由基，進(jìn)一步毀壞抗氧化酶系統(tǒng)，引起Pn下降。以下為參考文獻(xiàn)〔References〕ChaiXM,JiangP.OccurrenceandControlofPineWiltDisease[M].Beijing:ChinaAgriculture.2003.[柴希民，蔣平。松材線蟲病的發(fā)生與防治[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003]ChenYH,YeJR,WeiCJ,etal.EffectsofpinewoodnematodeinfectiononmetabolismofactiveoxygeninJapaneseBlackPineandSlashPineSeedlings[J].JournalofNanjingForestryUnversity.2002,26〔4〕:21-22.[陳玉惠，葉建仁，魏初獎，等.松材線蟲143對黑松、濕地松幼苗活性氧代謝的影響[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002,26〔4〕:21-22]FukudaK,HogetsuT,SuzukiK.Photosynthesisandwaterstatusofpine-woodnematodeinfectedpineseedings[J].J.Jpn