上課課題血紅蛋白的提取和分離第1頁/共31頁血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細(xì)胞的主要成分，負(fù)責(zé)運輸O2和CO2第2頁/共31頁課題3血紅蛋白的提取和分離第3頁/共31頁一、基礎(chǔ)知識（一）蛋白質(zhì)提取和分離的原理

（二）蛋白質(zhì)提取和分離的方法

1、凝膠色譜法（分配色譜法）

2、電泳法（三）緩沖溶液二、實驗操作——蛋白質(zhì)的提取和分離第4頁/共31頁

根據(jù)蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)差異：

1.分子的形狀、大小

2.電荷性質(zhì)和多少

3.溶解度

4.吸附性質(zhì)

5.對其他分子親和力

（一）思考：蛋白質(zhì)的種類多種多樣，進行蛋白質(zhì)提取與分離的原理是什么？第5頁/共31頁1、凝膠色譜法（分配色譜法）小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動慢；大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快。

凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。根據(jù)

分離蛋白質(zhì)的方法。（1）概念：（2）材料：（3）原理：（二）蛋白質(zhì)提取和分離的方法相對分子質(zhì)量的大小第6頁/共31頁第7頁/共31頁洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動?；旌衔锷现疵摯蠓肿恿鲃涌煨》肿恿鲃勇占蠓肿邮占》肿?/p>

第8頁/共31頁2、電泳法（2）原理：

帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。（1）電泳：①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團會帶上正電或負(fù)電。②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。（二）蛋白質(zhì)提取和分離的方法第9頁/共31頁

電泳原理示意圖第10頁/共31頁思考：影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素

決定運動方向電場作用力形成阻力決定運動速率電荷性質(zhì)電荷量分子形狀分子大小√√√√√√√第11頁/共31頁（3）常見電泳方法有哪些？瓊脂糖凝膠電泳和聚丙稀酰胺凝膠電泳（4）實例

通常使用：十二烷基磺酸鈉（SDS）—聚丙稀酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量。①應(yīng)用第12頁/共31頁（三）緩沖溶液抵制外界酸堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。

通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成，如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。1、作用：

2、配制：第13頁/共31頁二、實驗操作－－實驗步驟1.洗滌紅細(xì)胞

2.釋放血紅蛋白

3.分離血紅蛋白

透析樣品處理純化純度鑒定粗分離

凝膠色譜法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳譜法第14頁/共31頁血液第15頁/共31頁血液血漿水分固體物質(zhì)血漿蛋白無機鹽磷脂葡萄糖血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個a－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵紅素基團血液的組成第16頁/共31頁二、實驗操作－－實驗步驟1.洗滌紅細(xì)胞

2.釋放血紅蛋白

3.分離血紅蛋白

樣品處理第17頁/共31頁1.洗滌

紅細(xì)胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌的方法是什么？洗滌干凈的標(biāo)志是什么？血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細(xì)胞血漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色？第18頁/共31頁2.釋放血紅蛋白閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？作用是什么？攪拌的目的是什么？分析：蒸餾水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀___________________________。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂第19頁/共31頁濾紙過濾脂類物質(zhì)3.分離血紅蛋白紅細(xì)胞混合液高速離心10min燒杯有機溶劑血紅蛋白分液漏斗第20頁/共31頁20mmol/L磷酸緩沖液4.透析透析的目的是什么？1mL1mL1mL

去除樣品中的分子較小的雜質(zhì)。第21頁/共31頁第22頁/共31頁純化－－凝膠色譜法1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：3.樣品的加入和洗脫教材P68圖5-19第23頁/共31頁注意：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。

思考：你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻，無氣泡？擾亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。第24頁/共31頁3.樣品的加入和洗脫

1.調(diào)液面2.加樣3.再調(diào)液面

4.洗脫5.收集緩沖液凝膠第25頁/共31頁正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。第26頁/共31頁討論：答：除去相對分子量較大的蛋白質(zhì)。1、純化的目的是什么？答：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能。2、在血紅蛋白的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？第27頁/共31頁知識總結(jié)血紅蛋白的提取和分離蛋白質(zhì)分子的差異性凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定第28頁/共31頁例題:

紅細(xì)胞含有大量的血紅蛋白，紅細(xì)胞的機能主要是血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶氧氣或二氧化碳。我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進行實驗，來提取和分離血紅蛋白，請回答下列有關(guān)問題：（1）血紅蛋白提取和分離的程序可分為四步：

、

、

和

。（2）實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進行離心，收集血紅蛋白溶液。①加入檸檬酸鈉的目的是

。②以上所述的過程即是樣品處理，它包括

、

、收集血紅蛋白溶液。第29頁/共31頁（3）收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過透析，這就是樣品的粗分離。

①透析的目的是

。

②透析的原理是

。