雙氫青蒿素聯(lián)合奧沙利鉑對人結(jié)腸癌HCT116細胞的增殖及凋亡的影響李霽;劉丹丹;周峰旭;李凌晨;納鑫【摘要】研究雙氫青蒿素(DHA)與奧沙利鉑(L-OHP)聯(lián)合對人結(jié)腸癌HCT116細胞的增殖及凋亡的影響初步探討凋亡的作用機制運用MTr法檢測不同濃度DHA、L-OHP及DHA與L-OHP聯(lián)合對HCT116細胞的抑制作用，計算DHA與L-OHP是否發(fā)揮協(xié)同作用.實驗結(jié)果顯示DHA與L-OHP均對HCT116細胞增殖有抑制作用,二者聯(lián)合在一定濃度下發(fā)揮協(xié)同作用.應(yīng)用AnnexinV-FITC/PI雙染檢測藥物聯(lián)用后細胞凋亡情況，結(jié)果顯示聯(lián)合組比DHA組和L-OHP組凋亡率提高(P<0.01).通過檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax含量及casepase-3、casepase-8活性發(fā)現(xiàn)，與單藥組比較DHA、L-OHP聯(lián)合組Bcl-2/Bax降低,casepase-3、casepase-8活性提高(P<0.01).研究結(jié)果表明DHA與奧沙利鉑聯(lián)合能夠顯著抑制結(jié)腸癌HCT116細胞的增殖,在一定濃度下發(fā)揮協(xié)同作用，且能誘導(dǎo)細胞凋亡，其機制可能與加重DNA損傷，下調(diào)Bcl-2/Bax,激活casepase-3、casepase-8有關(guān).【期刊名稱】《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》【年(卷)，期】2018(030)012【總頁數(shù)】6頁(P2082-2087)【關(guān)鍵詞】雙氫青蒿素澳沙利鉑;聯(lián)合用藥;凋亡;結(jié)腸癌【作者】李霽;劉丹丹;周峰旭;李凌晨;納鑫【作者單位】昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，昆明650500;昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，昆明650500;昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，昆明650500;昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，昆明650500;昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，昆明650500【正文語種】中文【中圖分類】R284;R961結(jié)腸癌的死亡率位居我國惡性腫瘤的第三位，結(jié)腸癌治療采用手術(shù)為主，化療為輔的方法進行治療。奧沙利鉑（Oxaliplatin,L-OHP）是治療結(jié)直腸癌的一線藥物，已應(yīng)用多年，但因易產(chǎn)生多藥耐藥及發(fā)生末梢神經(jīng)炎而限制了其使用［1，2］。青蒿素為我國首次從黃花蒿中提取的一種高效低毒的抗瘧藥，研究發(fā)現(xiàn)青蒿素及衍生物除具有抗瘧作用外，還具有抗病毒和抗腫瘤作用。Efferth等［3］對55個腫瘤細胞株研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌等腫瘤細胞對青蒿素類化合敏感，雙氫青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）為青蒿素類化合物在體內(nèi)的主要活性代謝產(chǎn)物，與其他青蒿素類藥物相比顯示出較強的抗腫瘤活性且毒性較低［4,5］。因此本研究將雙氫青蒿素和奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用，觀察體外兩藥聯(lián)合對結(jié)腸癌細胞株HCT116增殖和凋亡的影響，為雙氫青蒿素抗腫瘤的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。1材料與方法1.1試劑與材料雙氫青蒿素（Fluka公司，美國）；奧沙利鉑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，中國）；RPMI1640培養(yǎng)基（GIBCO公司，美國）；胎生牛血清（GIBCO公司，美國）；二甲基亞砜（Amresc。公司，美國）；二甲基四氮唑藍（Amresco公司，美國）；十二烷基硫酸鈉（北京鼎國生物技術(shù)有限公司，中國）；異丁醇（上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)，中國）；濃鹽酸（成都市欣海興化工試劑廠，中國）；AnnexinV-FITC（欣博盛公司，中國）；Bax、Bcl-2抗體（Abcom公司，英國）。1.2儀器與設(shè)備酶標儀（MolecularDevices公司，美國；型號Plus384）；倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本；型號CKX31）；流式細胞儀（Beckman公司，美國；型號CoultetFCS500）；CO2培養(yǎng)箱（Hereaus公司，德國；型號3111.REL#5）1.3細胞培養(yǎng)HCT116細胞（Hunmancolontumor-116）保存于云南省天然藥物藥理重點實驗室，于10%新生牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中，5%CO2,37°C孵育培養(yǎng)。MTT測定細胞增殖抑制率取對數(shù)期的細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔含細胞8x103個，培養(yǎng)12小時后加入DHA,L-OHP，每組樣本設(shè)3個復(fù)孔，空白對照組加入等體積的AS,溶媒對照組0.5%DMSO。48小時后，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20此于37C繼續(xù)孵育4h終止培養(yǎng)，加入三聯(lián)液100mL,過夜后比色，選擇570nm和630nm為測定波長，在酶聯(lián)檢測儀雙波長法上測定每孔吸光度（OD），記錄結(jié)果。抑制率=（1-實驗組OD/空白組OD）x100%。1.5聯(lián)合用藥藥效評價采用金正均Q值法分析兩藥聯(lián)合效應(yīng)，公式Q=Ea+b/（Ea+Eb-EaxEb）,其中Ea、Eb表示a、b兩藥單獨作用時的細胞抑制率，Ea+b表示兩藥聯(lián)合作用時的細胞抑制率，式中分母表示〃期望合并效應(yīng)”，分子表示〃實測合并效應(yīng)”，Q值為二者的比值，Q<0.85表示兩藥聯(lián)用為拮抗作用，0.85<Q<1.15為相加作用，Q>1.15為協(xié)同作用。AnnexinV-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡藥物作用48小時后，用0.5%胰酶消化細胞，各組樣本細胞用冷PBS洗滌二次，并在染色緩沖液中以1x106細胞/ml的濃度重懸。吸取100"的細胞至試管中，加入適量熒光標記的Annexin-V和PI。按照說明書提示濃度操作，混勻后避光室溫下孵育10min。孵育后加入300pL染色緩沖液，立即上流式細胞儀分析，實驗重復(fù)3次。caspase-3,caspase-8活性檢測取對數(shù)生長期HCT116細胞，用DHA(10pmol/L),L-OHP(0.02pmol/L),DHA(10pmol/L)+L-OHP(0.02pmol/L)聯(lián)合，設(shè)定空白對照組，分別誘導(dǎo)24h后，收集細胞。加入100pL裂解緩沖液，渦旋振蕩。然后置于冰上15min，每5min渦旋振蕩一次。在4^,500xg下離心5min,取上清液。對上清液用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。取10pmol/L(大約含20~50pg)蛋白的上清液，加入90pL檢測緩沖液和10pLAc-DEVD-pNA，在37°C避光反應(yīng)1~2h,出現(xiàn)黃色時檢測其活性。在酶標儀上選擇450nm波長測定吸光度。根據(jù)凋亡誘導(dǎo)的細胞的吸光度與空白對照細胞的吸光度的比值計算相對的caspase-3,caspase-8的活性程度。Westernblot分析對數(shù)生長期的細胞，按試驗要求處理后，收集細胞，PBS洗滌3次，加入細胞裂解液，100pL,14000rpm離心10min，蛋白定量，取40pg蛋白加入上樣緩沖液，95C下10min°l0%的聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%脫脂牛奶封閉后依次加入第一、二抗體，室溫下孵育2h,TBST緩沖液洗滌3次，加入化學(xué)發(fā)光劑，放人暗盒中并壓片，2~5min后顯影、定影。1.9單細胞凝膠電泳實驗(1)將處于對數(shù)生長期的HCT116細胞，接種于六孔板中，接種密度為5x105個/孔。CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。重懸于冷PBS中，并調(diào)整細胞濃度為5x103個/mL,置于冰上待用。(2)制備1%常溫熔點瓊脂糖凝膠，將凝膠涂布于載玻片上，涂布厚度約為0.5mm，并將制備好的凝膠置于4°C冰箱中冷卻凝固。同時制備1%低熔點瓊脂糖凝膠，最后再在上層涂布一層常溫熔點瓊脂糖凝膠，形成一個〃三明治凝膠”。加入0.5XTBE電泳緩沖液，30V，電泳15min。最后置于Dured染色液中染色1h，置于熒光顯微鏡下，采用CASP彗星分析軟件分析。1.10統(tǒng)計學(xué)分析實驗重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，檢驗水準(a)為0.05和0.01,數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差顯示2實驗結(jié)果2.1DHA與L-OHP聯(lián)合對HCT116人結(jié)腸癌細胞增殖的抑制作用L-OHP與DHA單獨和聯(lián)合使用對HCT116人結(jié)腸癌細胞增殖的抑制作用，單獨使用L-OHP或DHA對HCT116細胞均具有明顯的增殖抑制作用，并具有一定的量效關(guān)系。在DHA10pmol/L與L-OHP0.01、0.02、0.04、0.08、0.16pmol/L濃度對HCT116人結(jié)腸癌細胞進行聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)果顯示其抑制率分別達到49.39%、64.99%、73.48%、75.21%、77.49%，比兩藥單獨使用抑制率顯著提高，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義，(**P<0.01)(見表1)。2.2金正均Q值進行聯(lián)合用藥作用分析DHA在10pmol/L濃度下，L-OHP在0.01pmol/L、0.02pmol/L、0.04pmol/L濃度下Q>1.15，兩藥聯(lián)合應(yīng)用可表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用。而DHA在10pmol/L濃度，L-OHP在0.08pmol/L、0.16pmol/L濃度下Q值在0.85~1.15之間，兩藥聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)出相加作用(見表1)。表1DHA、L-OHP及聯(lián)合用藥對HCT116細胞的抑制率Table1InhibitoryeffectsofDHAandL-OHPandcombinationonHCT116DHA(pmol/L)L-OHP(pmol/L)抑制率Inhibitionrate(%,x±SD)Q值5013.47±2.57-10021.25±3.48-20042.56±2.19-40051.38±5.21-80065.47±3.15-00.0125.88±2.98-00.0230.08±4.37-00.0438.78±3.51-00.0854.25±5.5400.1672.92±3.41100.0149.39±4.47**##1.186100.0264.99±5.58**##1.290100.0473.48±5.96**##1.418100.0875.21±6.38**#1.175100.1677.49±5.45**#0.985注：與10pmol/LDHA組比較*P<0.05;**P<0.01。與同濃度的L-OHP組比較,#P<0.05;##P<0.01。Q<0.85表示兩藥聯(lián)用為拮抗作用，0.85<Q<1.15為相加作用，Q>1.15為協(xié)同作用°Note:Comparedwith10pmol/LDHAgroup*P<0.05;**P<0.01.ComparedwiththesameconcentrationofL-OHPgroup,#P<0.05;##P<0.01.Q<0.85indicatesthatthetwodrugsarecombinedforantagonism,0.85<Q<1.15foradditiveeffect,andQ>1.15forsynergisticeffect.DHA與L-OHP聯(lián)合應(yīng)用對HCT116細胞凋亡的影響DHA與L-OHP單獨和聯(lián)合作用于結(jié)腸癌細胞HCT11648小時后，對照組凋亡率為3.91%;DHA組在10pmol/L濃度下凋亡率為19.14%;L-OHP組在0.02pmol/L濃度下凋亡率為27.31%；兩藥聯(lián)合組凋亡率為35.52%比DHA組和L-OHP組均較高，(**P<0.01)(見圖1)。Western-blot檢測Bcl-2及Bax蛋白Western-blot檢測Bcl-2及Bax蛋白，結(jié)果顯示，DHA組、L-OHP組以及DHA、L-OHP聯(lián)合組作用HCT116細胞24h后，檢測Bcl-2/Bax蛋白變化，DHA、L-OHP聯(lián)合組與DHA組比較，Bcl-2/Bax降低，**P<0.01,DHA、L-OHP聯(lián)合組與L-OHP比較，Bcl-2/Bax降低，(##P<0.01)(見圖2)。Caspase-3,Caspase-8活性檢測對給藥后的Caspase-3,Caspase-8進行活性檢測，結(jié)果顯示，DHA組、L-OHP組以及DHA、L-OHP聯(lián)合組作用HCT116細胞24h后，DHA、L-OHP聯(lián)合組的Caspase-3活性顯著提高，與DHA組和L-OHP組比較有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.01。DHA組、L-OHP組以及DHA、L-OHP聯(lián)合組作用HCT116細胞24h后Caspase-8顯著提高，與DHA組及L-OHP組比較DHA、L-OHP聯(lián)合組caspase-8顯著提高與L-OHP組比較P<0.05，與DHA組比較P<0.01（見圖3）。圖1DHA與L-OHP聯(lián)合對HCT116細胞凋亡的影響Fig.1EffectofDHAcombinedwithL-OHPonapoptosisofHCT116cells注：與DHA組比較*P<0.05；**P<0.01，與L-OHP組比較,#P<0.05。Note:ComparedwithDHAgroup*P<0.05;**P<0.01,comparedwithL-OHPgroup,#P<0.05.圖2DHA與L-OHP聯(lián)合對HCT116細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Fig.2EffectofDHAcombinedwithL-OHPonapoptosis-relatedproteinsinHCT116cells注：與DHA組比較，**P<0.01；與L-OHP組比較，##P<0.01。Note:ComparedwithDHAgroup,**P<0.01;comparedwithL-OHPgroup,##P<0.01.2.6單細胞凝膠電泳實驗給藥后進行單細胞凝膠電泳實驗，結(jié)果顯示，DHA組、L-OHP組以及DHA、L-OHP聯(lián)合組作用HCT116細胞后，DHA、L-OHP聯(lián)合組的慧尾率顯著提高，與DHA組和L-OHP組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01和P<0.05）（見圖4）。3討論奧沙利鉑是臨床上一線的治療結(jié)直腸癌的抗腫瘤藥物，抗腫瘤作用顯著，但奧沙利鉑長時間大量使用會產(chǎn)生腎毒性、耳毒性、神經(jīng)毒性等毒副反應(yīng)，腫瘤細胞對奧沙利鉑的耐藥性產(chǎn)生降低了奧沙利鉑的療效，是目前腫瘤化療失敗的重要原因［6］。因此利用毒性較低的具備抗腫瘤活性的化合物使化療藥物增敏從而減少化療藥物用量是一種提高抗腫瘤藥物化療作用降低毒性的重要方法。青蒿素類藥物毒性小對包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤有效，有研究報道其甚至可以逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌的耐藥［7,8］,因此本研究將雙氫青蒿素與奧沙利鉑聯(lián)用觀察其對結(jié)腸癌細胞HCT116的抑制作用，計算藥物聯(lián)用是否有協(xié)同效應(yīng)，對其凋亡及相關(guān)蛋白進行研究，為青蒿素類藥物進入抗腫瘤的臨床治療提供依據(jù)。圖3DHA與L-OHP聯(lián)合用藥對HCT116細胞凋亡相關(guān)蛋白活性的影響Fig.3TheeffectsofDHAandL-OHPonactivityofapoptosis-relatedproteins注：檢測caspase-3活性，與DHA組比較，**P<0.01；與L-OHP組比較，##P<0.01；檢測caspase-8活性，與DHA組比較，**P<0.01；與L-OHP組比較，#P<0.05。Note:Detectionofcaspase-3activity,comparedwithDHAgroup嚴P<0.01;comparedwithL-OHPgroup,##P<0.01;detectionofcaspase-8activity,comparedwithDHAgroup,**P<0.01;andComparedwithL-OHPgroup,#P<0.05.圖4DHA與L-OHP聯(lián)合用藥對HCT116細胞DNA損傷的影響Fig.4TheeffectsofDNAdamageonDHAandL-OHP注：與DHA組比較，**P<0.01；與L-OHP組比較，#P<0.05。Note:ComparedwithDHAgroup,**P<0.01;comparedwithL-OHPgroup,#P<0.05.L-OHP與DHA單獨和聯(lián)合使用對HCT116人結(jié)腸癌細胞增殖均有抑制作用，聯(lián)合用藥抑制率比兩藥單獨使用抑制率提高，應(yīng)用金正均Q值法進行聯(lián)合用藥分析發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)合使用在一定濃度下發(fā)揮協(xié)同作用，而在L-OHP相對較高的濃度下只發(fā)生相加作用。DHA可誘導(dǎo)DNA氧化損傷，而L-OHP抗腫瘤的主要機制是與腫瘤細胞DNA形成鏈內(nèi)、夕卜交聯(lián)，影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄［9，10］。DHA與L-OHP二者都能通過影響腫瘤細胞的DNA來發(fā)揮抗腫瘤作用，通過DNA損傷實驗發(fā)現(xiàn)，在DHA與L-OHP聯(lián)合應(yīng)用后DNA損傷加重，影響腫瘤細胞的增殖，甚至可能進一步引起細胞凋亡。觀察DHA與L-OHP聯(lián)合應(yīng)用對HCT116細胞凋亡作用發(fā)現(xiàn)，與單藥組比較兩藥聯(lián)合應(yīng)用凋亡率顯著提高，有研究顯示DHA能促進腫瘤細胞凋亡并對多種腫瘤有殺傷作用［11，12］,研究表明DHA與順鉑聯(lián)用可提高抗腫瘤細胞的作用［13］，L-OHP也可引起多種腫瘤細胞凋亡，并且可通過Fas/FasL和caspase-8誘導(dǎo)細胞凋亡［14,15］。凋亡是多基因多因素相互之間影響和調(diào)控的結(jié)果。Bcl-2基因是重要的凋亡抑制基因,Bcl-2/Bax比值決定細胞是否進入凋亡狀態(tài)，若Bax越高，Bcl-2就被抑制，細胞凋亡被誘導(dǎo)，反過來Bax受抑，細胞得以生存［16］。研究顯示兩藥聯(lián)用Bcl-2/Bax顯著降低，誘發(fā)凋亡，Bax是Bcl-2家族成員，其可通過活化Caspases促進凋亡。Caspases是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路，其中Caspase-3是核心效應(yīng)器，負責對凋亡途徑最后執(zhí)行階段的全部或部分關(guān)鍵性蛋白的酶切，可引發(fā)瀑布式激活下游的Caspase蛋白酶家族，最終誘導(dǎo)細胞凋亡［6］,本研究結(jié)果顯示兩藥聯(lián)合應(yīng)用可顯著提高Caspase-3的活性，同時也提高Caspase-8的活性，從而誘導(dǎo)HCT116細胞的凋亡。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素及奧沙利鉑可抑制HCT116結(jié)腸癌細胞的增殖作用，二者聯(lián)用在一定濃度下可對HCT116結(jié)腸癌細胞發(fā)揮協(xié)同作用，顯著提高抑制率。同時可通過下調(diào)Bcl-2/Bax表達比值，激活Caspase-3、Caspase-8的活性，促進HCT116結(jié)腸癌細胞凋亡。兩藥聯(lián)合可促進DNA損傷加重，抑制腫瘤細胞生長，其協(xié)同作用發(fā)生的具體靶點和機制，有待進一步研究。參考文獻【相關(guān)文獻】ZhangDM（張冬梅）,ZhangYM（張雅明）.Effectsofmatrineonreversalofoxaliplatinresistanceinhumancoloncancercellline（HT-29）anditsmechanism[J].JHunanUnivChinMed（湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報）,2016,36（11）:22-26.DuZJ（杜志杰）,DongJY（董金垚）,GuoJS（郭建昇）,etal.EffectsofartesunateplusoxaliplatinonhumancoloncancercellHCT116[J].WorldJIntegrTraditChinWestMed（世界中西醫(yī)結(jié)合雜志）,2014,9:710-713.EfferthT.WillmarSchwabeAward,etal.Anti-plasmodialandantitumoractivityofartemisininfrombenchtobedside[J].PlantaMed,2007,73:299-309.EfferthT,etal.Molecularpharmacologyandpharmacogenomicsofartemisininanditsderivativesincancercells[J].CurrentDrugTargets,2006,7:407-421.LuJJ.Progessintheresearchontheanti-canceractivityofartemisinincompounds[J].ChinPharmacolBull,2010,26（6）:818-820.LiQ（李琪）,RenLQ（任立群）,WangYD（王亞帝）.EffectsofrutincombinedwithoxaliplatinonproliferationandapoptosisofhumangastriccancerSGC-7901cells[J].ChinJClinPharmTherap（中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)）,2017,22:1099-1105.TaoPY（陶鵬宇）,ShiMJ（施明杰）,XuQ（徐勤）.Reversalofdrugresistanceofhumancoloncancerdrug-resistantcellsbydihydroartemisinin[J].JGuangzhouUnivTraditChinMed（廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報）,2016,33:698-703.ZhouJY（周潔蕓）,ZhuY（朱焰）.Researchprogressonantitumoreffectsofartemisininanditsderivatives[J].NatPr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