基因工程操作流程第1頁/共27頁終止子第2頁/共27頁能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū):非編碼區(qū):原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)有調(diào)控作用，含啟動子、終止子等。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子第3頁/共27頁（二）真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ))編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子

能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：

外顯子：

第4頁/共27頁原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼第5頁/共27頁1.2基因工程的基本操作程序①從細(xì)胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分離大腸桿菌中的質(zhì)粒④DNA重組⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因第6頁/共27頁基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定第7頁/共27頁目的基因——主要指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。取出DNA用限制酶切斷DNA

目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。1.目的基因的獲取第8頁/共27頁基因文庫的種類：

基因組文庫：含有一種生物所有的基因部分基因文庫：含有一種生物的一部分基因（如：cDNA文庫）獲取目的基因的方法一：從基因文庫中獲取目的基因基因文庫（genelibrary）的概念：將含有某種生物的不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。第9頁/共27頁組織或細(xì)胞染色體DNA限制性核酸內(nèi)切酶DNA片段重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌載體受體菌基因組文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)，由載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。第10頁/共27頁mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA雙鏈cDNA重組DNA分子載體含重組分子的轉(zhuǎn)化菌受體菌用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA制備雙鏈的cDNA后，建立的基因文庫。cDNA文庫第11頁/共27頁文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動子（具有啟動作用的DNA片段）無有基因中內(nèi)含子（位于編碼蛋白質(zhì)序列內(nèi)的非編碼DNA片段）無有基因多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因物種間的基因交流可以部分基因可以第12頁/共27頁P(yáng)CR(polymerasechainreaction)

——多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。

獲取目的基因方法二：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

PCR擴(kuò)增儀第13頁/共27頁原理：DNA雙鏈復(fù)制反應(yīng)過程：1.變性：將反應(yīng)系統(tǒng)加熱至90℃-95℃，使模板DNA完全變性成為單鏈；2.退火：將溫度下降至55℃-60℃左右，使引物與模板DNA退火結(jié)合；3.延伸：將溫度升至70℃-75℃，DNA聚合酶以dNTP為底物催化DNA的合成反應(yīng)。

上述三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，經(jīng)25～30次循環(huán)后，可將模板DNA擴(kuò)增達(dá)百萬倍。反應(yīng)體系：模板DNA、特異性引物、 耐熱DNA聚合酶、dNTP及緩沖液第14頁/共27頁

利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第15頁/共27頁DNA合成儀過程：

適用范圍：已知核苷酸序列，基因的核苷酸數(shù)量較少。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成

獲取目的基因方法三：化學(xué)合成法

第16頁/共27頁小結(jié):目的基因的獲?。喝N方法(1)從基因文庫中獲取適用于目的基因序列為未知的情況(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增適用于目的基因的序列為已知的情況(3)人工合成適用于目的基因不是很大且其序列是已知的第17頁/共27頁基因表達(dá)載體的組成目的基因啟動子終止子標(biāo)記基因等標(biāo)記基因：鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建第18頁/共27頁常用的受體細(xì)胞

動物、植物、微生物轉(zhuǎn)化：

目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。3、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第19頁/共27頁1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法轉(zhuǎn)化方法2）將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞顯微注射技術(shù)3）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞常用CaCl2第20頁/共27頁1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用方法：---農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

適用范圍：雙子葉植物和裸子植物轉(zhuǎn)化過程：第21頁/共27頁1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞——基因槍法基因槍法又稱微彈轟擊法，是籍高速度運(yùn)動的金屬微粒將附著于其表面的核酸分子引入到受體細(xì)胞中的一種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化技術(shù)。這是單子葉植物中常用的一種基因轉(zhuǎn)化方法，但是成本較高此技術(shù)最早由我國學(xué)者周光宇提出的，植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞——花粉管通道法第22頁/共27頁2）將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞顯微注射技術(shù)第23頁/共27頁3）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞大腸桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法：用Ca+（常用CaCl2）處理細(xì)菌細(xì)胞，以增大細(xì)胞壁的通透性，使細(xì)胞處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)——感受態(tài)細(xì)胞。將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化。第24頁/共27頁1)分子水平的檢測檢測目的基因是否插入了轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測方法：DNA分子雜交技術(shù)檢測方法：分子雜交技術(shù)檢測方法：抗原-抗體雜交4、目的基因的檢測和鑒定第25頁/