**********開題報告學院：動物醫(yī)學院學生姓名學號年級專業(yè)及班級指導教師及職稱畢業(yè)論文題目鉤吻素子對小鼠巨噬細胞凋亡的影響文獻綜述（選題研究意義、國內外研究現狀、主要參考文獻等，不少于1000字）（一）選題研究意義中國鉤吻是歷史悠久的藥用植物，盛產于我國浙江、福建、云南、廣西等地，民間用于治療神經痛、風濕性關節(jié)炎和癌癥痛等疾病。生物堿為中國鉤吻的主要活性成分，其中鉤吻素子（koumine，KM）是鉤吻生物堿單體中含量最高且毒性相對較低的一種有效成分，具有重大的開發(fā)應用前景。在免疫學研究方面，周利元等用昆明鼠進行整體免疫功能實驗，觀察到鉤吻堿對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能有促進作用；雷林生等采用體外細胞培養(yǎng)模型觀察了鉤吻堿類提取物對不同因素誘發(fā)的Balb/c、CoBL/6j小鼠脾細胞增殖反應的影響。結果鉤吻堿1.25μg/ml以上對混合淋巴細胞培養(yǎng)反應(MLR)均有不同程度的抑制作用：具有統計學意義(p0<.05)的最低抑制濃度為2.5μg/ml，抑制率為18.3%。這種體內和體外作用不一致的現象提示鉤吻堿在整體情況下對免疫功能的影響屬于間接影響而非直接作用[1]。為了進一步認識鉤吻堿對免疫功能的影響，本實驗研究探討了鉤吻素子對小鼠巨噬細胞凋亡的影響，以期為闡明鉤吻素子的作用機制提供一些線索，為更好地開發(fā)利用鉤吻素子提供理論依據。（二）國內外研究現狀國內對鉤吻的活性研究歷史悠久，發(fā)現鉤吻具有抗腫瘤[2－3]、免疫調節(jié)[4]、鎮(zhèn)痛抗炎[5]、抗應激[6]等活性。但是，由于鉤吻總堿的中毒劑量與有效治療劑量相接近，導致其應用受到限制，故近年來，鉤吻堿單體的藥理作用越來越受到人們的重視[7]。2.1抗腫瘤高明雅等[7]用鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己生物堿單體對肝癌細胞HepG2增殖的抑制作用，并探討其相關機制，研究結果發(fā)現，3種鉤吻生物堿單體中鉤吻素己能顯著抑制HepG2細胞體外增殖且細胞毒性較小，并通過影響細胞周期分布和激活Capspase－8、Capspase－9進而活化Capspase－3發(fā)揮抗腫瘤作用。2.2抗炎鎮(zhèn)痛鉤吻素子對類風濕關節(jié)炎可能具有顯著的治療作用，該作用與其上調脾臟Treg細胞量可能有關[8]。李蘇平等[9]研究發(fā)現鉤吻素子抗神經病理性疼痛(NPP)作用可能與上調脊髓3α－HSD酶表達有關。2.3抗焦慮黃慧慧等[10]以大鼠高架十字迷宮實驗為動物模型，評價鉤吻素子單次皮下注射給藥和連續(xù)皮下注射給藥的抗焦慮活性及特點，鉤吻素子能顯著增加大鼠進入高架十字迷宮開臂次數和在開臂的停留時間百分率，鉤吻素子在實驗劑量下對大鼠自主運動活性無影響，鉤吻素子可能具有抗焦慮作用。2.4其他陳超杰等[11]研究發(fā)現鉤吻素子在治療范圍的較高劑量下能引起小鼠中樞神經系統的抑制作用，超過治療劑量范圍的一定時間內則產生興奮作用。許盈等[12]采用離體豚鼠回腸藥物依賴模型、小鼠藥物依賴催促戒斷模型和自然戒斷模型，分析鉤吻素子誘導嗎啡樣身體依賴性的潛力，實驗結果提示，鉤吻素子可能無產生嗎啡樣身體依賴性的潛力。（三）主要參考文獻[1]蔡晶,王萬山,雷林生,etal.鉤吻素子對小鼠抗應激作用的實驗研究[J].廣州中醫(yī)藥大學學報,2007,24(4):317-319.[2]王寅，云峰，林文，等．鉤吻總堿對肝癌細胞HepG－2的體外抑制作用[J]．中藥材，2001，24(8):579－580．[3]梁維君，飛云，曾明，等．鉤吻提取液對HL60細胞生長增殖和細胞周期的影響[J]．湖南師范大學學報(醫(yī)學版)，2004，1(1):39－43．[4]周利元，王坤，黃蘭青，等．鉤吻對小鼠免疫功能的影響[J]．中華實驗臨床免疫學雜志，1992，4(4):14－16．[5]周名璐，黃聰，楊小平．鉤吻總堿的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及安全性[J]．中成藥，1998，20(1):35－36．[6]王友順．鹽酸鉤吻及其化合物對小鼠免疫功能的影響[J]．海軍醫(yī)專學報，1989，11(1):22[7]高明雅，沈偉哉，吳顏暉，等．鉤吻生物堿單體對肝癌細胞體外抑制作用機制的初步研究[J]．中藥材，2012，03:438－442．[8]廖婉婷．鉤吻素子對C57BL/6小鼠類風濕關節(jié)炎的治療作用[D]．福州:福建醫(yī)科大學，2014．[9]邱宏強，許盈，楊漸，等．鉤吻素子對坐骨神經慢性束縛損傷模型大鼠脊髓3α－羥化類固醇脫氫酶表達的影響[J]．中國藥理學與毒理學雜志，2012，03:443．[10]黃慧慧，劉銘，陳超杰，等．鉤吻素子對大鼠焦慮行為的影響[J]．西北藥學雜志，2014，06:593－595．[11]陳超杰，辛志明，林菁，等．鉤吻素子對小鼠自主行為、協調平衡和巴比妥閾下催眠作用的影響[J]．福建醫(yī)科大學學報，2014，02:83－85．[12]許盈，丘宏強，沈潔，等．鉤吻素子無嗎啡樣藥物依賴性[J]．福建醫(yī)科大學學報，2013，04:210－213．注：此表如不夠填寫，可另加頁。研究方案（研究目的、內容、方法、預期成果、條件保障等）（一）研究目的探討鉤吻素子對小鼠巨噬細胞凋亡的影響，以期為闡明鉤吻素子的作用機制提供一些線索，為更好地開發(fā)利用鉤吻素子提供理論依據。（二）內容1前言2實驗材料3實驗方法4實驗結果5討論6結論（三）方法3.1巨噬細胞培養(yǎng)無菌取小鼠腹腔巨噬細胞，調整濃度為106-107cells/ml，接種于35mm改良Pietr培養(yǎng)皿或多孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時。以PBs或HePes沖洗兩次，洗掉未貼壁細胞，加入完全RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至所需時間。經此方法處理，可獲得95%以上的腹腔巨噬細胞，細胞濃度可保持在105-106cells/ml。實驗組加測試藥物與處理因素，對照組以或緩沖液替代。3.2巨噬細胞內活性氧自由基的測定(l)染液配制:將DCHF溶于無水乙醇，配成1mM儲備液，分裝凍存于-20℃至-80℃條件下，染色前用不含血清RPMI-1640培養(yǎng)基的配成濃度為5pM。(2)熒光探針標記:吸取Petri培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用Hepes緩沖液沖洗3次；滴加5pMDCHF200μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育30分鐘，用Heeps緩沖液沖洗3次，再加入0.5mlHePes緩沖液待測。(3)ACAS570檢測活性氧自由基：使用美國ACAs570型激光掃描共聚焦顯微鏡測定。（四）預期成果鉤吻素子促進增加小鼠腹腔巨噬細胞內活性氧(ROS)，促進小鼠腹腔巨噬細胞凋亡。（五）條件保障實驗室具有完備的實驗材料和設備。進程計劃（各研究環(huán)節(jié)的時間安排、實施進度、完成程度等）1、選題：2018年11月15日――2018年11月20日，作收集畢業(yè)論文相關資料并進行選題；2、上交選題：2018年11月25日――2018年11月30日，上交選題給指導教師；3、確定論文提綱：2018年12月5日――2018年12月13日，與指導老師討論提綱并確定寫作大綱；4、開題答辯：2018年12月20日――2018年12月30日，完成開題報告并進行答辯；5、撰寫初稿：2018年12月26日——2019年1月5日，完成初稿并交給指導老師修改；6、修稿：2019年1月6日――2019年2月28日，根據老師意見修改初稿。7、定稿：2019年3月1日――2019年4月1日，將論文交給指導老師審閱；8、論文答辯：2019年4月16日——2019年4月30日，系畢業(yè)論文工作領導小組審核通過后參加答辯；論