QPCR原理的課件資料第1頁/共65頁20YearsofPCRKaryMullis

PCR只是一個概念，所發(fā)生的奇跡是：PCR概念變成了可操作的實驗系統(tǒng)，變成了一項成熟的技術(shù)，后者又上升成為新的概念?！?/p>

它最大的特點就是能不斷推出新形式。

——摘自[MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow]第2頁/共65頁TTTTTAAACCCCCAAAATTTCCCCCCTAAGGGGGGGGGGGDenaturation94°CAnnealing55°CElongation72°CPolPolPCR5‘3‘5‘3‘SeparationofstrandsAnnealingofprimerElongationbypolymerase第3頁/共65頁PCR后分析結(jié)果PCRproductsindifferentsizes3kb500bp300bp第4頁/共65頁為什么終點法定量不準確?CtEndpoints同一樣品盡管平臺期DNA拷貝數(shù)波動很大，CT值卻是相對固定的。第5頁/共65頁典型的PCR四階段半對數(shù)圖譜線性圖譜第6頁/共65頁平臺期典型的PCR四階段線性增長期基線期指數(shù)增長期第7頁/共65頁PCR理論方程lg[DNA]循環(huán)數(shù)線性期平臺期y=x(1+e)n指數(shù)期N=N0x(1+e)nN: 產(chǎn)物分子數(shù)N0: 起始分子數(shù)e： 擴增效率n: 循環(huán)次數(shù)

PCR理論方程只在指數(shù)期成立第8頁/共65頁PCR指數(shù)增長期的規(guī)律

PCR擴增為指數(shù)擴增，每一擴增周期后產(chǎn)物的量可以下式表達：

Yn=X·(1+E)n

0≤E≤1

其中E表示擴增效率，Yn表示在n個周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量，X為n-1個周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量。等式僅在限定的擴增周期數(shù)（通常為20或30）內(nèi)成立。超過此周期數(shù)，擴增過程即由指數(shù)擴增降低至穩(wěn)定的擴增速率，最終達到平臺，不再擴增.定量PCR測定的測定點為PCR擴增的指數(shù)擴增期;而定性PCR測定的測定點則多為PCR擴增的平臺期第9頁/共65頁為什么終點法定量不準確?CtEndpoints同一樣品盡管平臺期DNA拷貝數(shù)波動很大，CT值卻是相對固定的。第10頁/共65頁Ct(ThresholdCycle)-Thecyclenumberwherethereaction fluorescenceexceedsbackgroundfluorescence.Cycle#FluorescenceCtCtCtThresholdThreshold-Thepeakofbackgroundfluorescence,asdefinedbytheplatformortheuser.BackgroundFluorescenceAmplificationPlot定量分析原理Yct=X·(1+E)n=2nXEct=1CT值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。CT值與起始模板濃度成負相關(guān)關(guān)系,不同CT值的模板起始濃度相差2n倍,n為CT間差值第11頁/共65頁為什么CT值起始DNA濃度?當(dāng)循環(huán)次數(shù)n=CT值時：RCT=RB+X0(1+e)CTRs

lg(RCT-RB)=lgX0+CTlg(1+e)+lgRsCTlg(1+e)=-lgX0+lg(RCT-RB)–lgRs即

CT=-klgX0+b

（線性方程）Rn=RB+X0(1+e)nRs第12頁/共65頁定量PCR的實質(zhì)模板定量找到PCR的指數(shù)增長期定量數(shù)據(jù)歸一化第13頁/共65頁real-timePCR應(yīng)用范圍科研的主要工具mRNA與基因表達的研究DNA拷貝數(shù)的檢測單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的測定DNA芯片結(jié)果認證醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用前景更是令人鼓舞極微量的基因表達定量病原體檢測第14頁/共65頁絕對定量Unknown通常用標(biāo)準品作為外參照制作標(biāo)準曲線.注意保持與目的基因的同源性第15頁/共65頁標(biāo)準曲線的制作第16頁/共65頁什么是閾值基線閾值標(biāo)準偏差基線信號的標(biāo)準偏差x10第17頁/共65頁CT值基線閾值基線閾值CT值第18頁/共65頁????????????I3,125I6,250I12,500I25,000I50,000I100,000Absoluteamount.(copies)EXACTscale20-19-18-17-16-15-CTABCCT161819Absoluteamount50,000copies12,500copies6,250copiesSampleASampleBSampleC標(biāo)準曲線方法通過CT值測定起始DNA量第19頁/共65頁濃度增加1倍，CT值減小1個單位濃度增加10倍，CT值減小3.3個單位第20頁/共65頁第21頁/共65頁相對定量?CtSample?CtNontreatedsampleHousekeepingGene?Ct?Ct??

Ct2-??

Ct

=ChangeinExpressionLevelGeneofInterest第22頁/共65頁相對定量DCt=9.70DCt=-1.7DCt=target-refDCt=target-refDifference=DCt-DCt=DDCt=9.70-(-1.7)=11.40IL1-bconRPLP0conav=19.93av=29.63controlIL1-bvitRPLP0vitav=19.80av=18.03experiment-2-Ct=-2[(Ctarget-Ccalibrator)]-[(Ctarget-Ccalibrator)]第23頁/共65頁DNA芯片結(jié)果復(fù)證第24頁/共65頁DNA甲基化檢測

BeforeBisulfiteTreatment:

Wild-TypeDNA

5’...GCGGACCGCG..

AfterBisulfiteTreatment:

UnmethylatedDNA

5’...GUGGAUUGUG..

MethylatedDNA

5’...GCGGAUCGCG..第25頁/共65頁高通量SNP篩查Amplifluor?Primer(UniPrimer?)QuencherPCRSNP第26頁/共65頁RealTimePCR技術(shù)的誕生1992年，HiguchiR等第一個報導(dǎo)了實時定量PCR技術(shù)

HiguchiR,FocklerC,etal.KineticPCRanalysis:real-timemonitoringofDNAamplificationreactions.Biotechnology,1993,11(9):1026-1030.

所謂實時定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因,利用熒光信號累積實時監(jiān)控整個PCR進程,最后通過標(biāo)準曲線對未知模板進行定量分析的方法.實時定量PCR技術(shù)是PCR技術(shù)和熒光檢測技術(shù)的結(jié)合第27頁/共65頁FluorescentDyes

熒光分子或熒光染料

ExitationpeakEmissionpeak第28頁/共65頁ReactionAmplificationPlotTime(Cycle#)Fluorescence熒光信號累積與擴增曲線第29頁/共65頁熒光分子或染料的檢測方法熒光分子內(nèi)參式檢測（DNASpecificDyes）

SYBRGreenI

熒光標(biāo)記的特異探針?biāo)馓结?Taqman

雜交探針:FRET（DualProbes）分子信標(biāo):MolecularBeacons熒光標(biāo)記引物:Scorpion和Amplifuor其它類:BD

QZyme第30頁/共65頁DNAspecificDyese.g.SYBRGreenIExcitation494nmSYBRGreenI

的檢測原理Emission521nm第31頁/共65頁熔解曲線分析引物二聚體PrimerdimersProductofInterest第32頁/共65頁UNG預(yù)防污染

52°C2:00UNGtreatment95°C10:00enzymeactivation60°C1:00annealing/extension95°C0:15denat.UNG酶的作用原理是降解含有dU的雙鏈或單鏈DNA。它在50°C激活，95°C滅活.用于預(yù)防非特異性PCR擴增和污染。在定量PCR開始前增加50°C的保溫步驟，UNG酶即可將已有的PCR產(chǎn)物降解破壞，防止可能造成的污染第33頁/共65頁儀器熱啟動

Innovativetechnicalfeaturefordevice-supportedHotStartPCRPerfectcombination:MastercyclerepSandHotMasterEnhancesthePCRtonearlythemaximum脈沖PCR=超快的升溫速度+極大縮短初始升溫所需時間Blocktemperature[°C]Time100806040206°C/sec8°C/sec第34頁/共65頁TaqMan探針法的核心:利用Taq酶的5→3′外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號

FRET

熒光共振能量轉(zhuǎn)移

FluorescenceResonanceEnergyTransferTaqMan探針原理TAGCCTGCAGAGRQReporterQuencher第35頁/共65頁Real-TimeQPCR常用染料Alx350FAMTETHEXJOEROXCy5Cy3TAMTxRd第36頁/共65頁TTTTTAAACCCCCAGGGGGGTTTTTAAACCCCCAGGGGGGTTTAACCCCGGGTAGCCTGCAGAGRQTaqMan探針原理當(dāng)探針完整的時候，報告基團所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5′→3′外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號AGCCACCTTTTTTTGGGCCCCAAAAGCCGATR第37頁/共65頁多探針的反應(yīng)體系TwoormoreProbesandDyesinoneTubeTAGCCTGCAGAGR1QTAGCCTGCAGAGR2QTarget1Target2第38頁/共65頁微衛(wèi)星系統(tǒng)第39頁/共65頁Mastercyclerep-新一代PCR儀的代表超快的升/降溫速度脈沖PCR獨立直觀的控制面板ESP電子樣品保護熱蓋第40頁/共65頁Mastercyclerep系列-多種模塊選擇鋁塊鋁塊銀塊第41頁/共65頁Eppendorf在定量PCR領(lǐng)域厚積薄發(fā)Mastercyclereprealplex實時定量PCR儀的開發(fā)秉承了Eppendorf既往的經(jīng)驗.是將經(jīng)驗融入最新技術(shù)的精品之作回顧Eppendorf60年的發(fā)展歷史，當(dāng)之無愧為高品質(zhì)實驗室儀器的供應(yīng)商。Eppendorf擁有55年生產(chǎn)光學(xué)儀器的經(jīng)驗，近10年來，熱循環(huán)儀已成為Eppendorf產(chǎn)品家族中的重要組成。。第42頁/共65頁real-timePCR儀器構(gòu)造Exitationlightsource

FilterDetector

熱循環(huán)儀

光學(xué)元件軟件分析第43頁/共65頁MastercyclereprealplexA4-colourdetectionunitinaspacesavingdesignThermalModuleSlidingOpticsModule第44頁/共65頁Mastercyclerep升級為定量PCR儀epGradient/S兩通道epRealPlex2四通道epRealPlex4六通道epRealPlex6COMINGSOON!在Mastercyclerep梯度PCR的基礎(chǔ)上，整合一個可靠而高度靈敏的光學(xué)檢測系統(tǒng)，就構(gòu)成了最新的Mastercyclereprealplex實時熒光定量PCR系統(tǒng)。第45頁/共65頁Mastercyclereprealplex-模塊化設(shè)計A.Mastercyclereprealplex296LEDArrayexcitationat470nm1channelphotomultiplier(CPM)2detectionwavelenghts:520nmand550nm

B.Mastercyclereprealplex496LEDArrayexcitationat470nm2channelphotomultipliers(CPM)4detectionwavelengths:520nm,550nm,580nm,605nmTwoThermomodules

Aluminumblock(epgradient):4°C/sheating,3°C/scoolingSilverblock(epgradientS):6°C/sheating,4.5°C/scooling, impulsePCR第46頁/共65頁Mastercyclereprealplex2：光路特征96LEDArrayCPMDetector每個CPM上帶兩個濾光片第47頁/共65頁96孔激發(fā)模式由96個LED（光電二級管）組成的光陣列，依一種一一對應(yīng)的關(guān)系將每個反應(yīng)管中的熒光染料激發(fā)，SYBR?Green,FAM,VIC,TET,HEX,ROX,JOEandTAMRA優(yōu)點:設(shè)計緊湊，無可移動部件低能耗,無光密度損失相對于傳統(tǒng)的鹵素?zé)簦瑝勖L第48頁/共65頁檢測器-通道式光電倍增管相對于傳統(tǒng)的光電倍增管，新穎的通道光電倍增管（CPM）結(jié)構(gòu)更堅固，更不易被磁場所干擾快速數(shù)據(jù)獲取:15秒檢測4種染料RTCCDiCyclerCooledCCDABI7000,ABI7900,7300PMTRotoGeneSensitivityCPMrealplexep敏感性第49頁/共65頁-Photoncascadecreatesexponentialsignalamplification-“Gain”ofPMTadjustsstrengthofamplificationhvhve-e-CCDMirrorCCDvsPMT檢測性能對比CCD無法克服檢測的邊緣效應(yīng)第50頁/共65頁快速qPCR新理念非?？焖俚臏囟瓤刂扑俣?，配合快速的檢測、直觀的編程與軟件分析，縮短了實時定量PCR的整體時間。兼顧速度與可靠性,優(yōu)化參數(shù)實現(xiàn)快速PCR試劑與耗材均為開放第51頁/共65頁快速Q(mào)PCR的實現(xiàn)主要因素:快速升/降溫Heatingrate:6oC/sCoolingrate:4.5oC/sonaverage,atimesavingof15-20min.減少holding時間快速數(shù)據(jù)獲取減少反應(yīng)體積第52頁/共65頁MasterCyclerepRealPlexSoftware第53頁/共65頁MastercyclereprealplexSoftwareThesoftwareofferthefollowingpossibilitiesforevaluatingorviewingtherecordeddata:RawdataAbsoluteQuantificationRelativequantificationMeltingpointdeterminationEndpointdetermination+/-assaysgeneidentificationfluorimeterOnlineanalysisofrawdataastheyappear第54頁/共65頁Software-AbsoluteQuantification

SoftwareModules:PlateLayoutforAbsoluteQuantificationRedboxes-standardsBlueboxes-unknownsYellowboxes-“-”controlChooseadye第55頁/共65頁AutoSeriesfunctionCreatingdilutionseriesforabsolutequantificationiseasilydoneusingthe“AutoSeries”function第56頁/共65頁Mastercyclereprealplex-SoftwareUsercancreatesubassaystoperformdifferentexperimentsinthesameplate,provi