SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE測定蛋白質(zhì)分子量第1頁/共20頁一.實驗目的學習SDS測定蛋白質(zhì)分子量的原理。掌握垂直板電泳的操作方法。運用SDS測定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。第2頁/共20頁

二.實驗原理帶電質(zhì)點在電場中向帶有異相電荷的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。電泳分類：移動界面電泳、區(qū)帶電泳、穩(wěn)態(tài)電泳。區(qū)帶電泳是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個點或一薄層樣品溶液，然后加電場，分子在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)中遷移。支持介質(zhì)的作用主要是為了防止機械干擾和由于溫度變化以及大分子溶液的高密度而產(chǎn)生的對流。區(qū)帶電泳使用不同的支持介質(zhì)，早期有濾紙、玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯乙烯樹脂；以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現(xiàn)在則多用聚丙烯酰胺（PAGE）和瓊脂糖凝膠。第3頁/共20頁二.實驗原理PAGE根據(jù)其有無濃縮效應，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。第4頁/共20頁二.實驗原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS（十二烷基磺酸鈉），SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質(zhì)復合物，這種復合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。第5頁/共20頁二.實驗原理

SDS電泳的成功關(guān)鍵之一是電泳過程中，待別是樣品制備過程中蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合程度。影響它們結(jié)合的因素主要有三個：溶液中SDS單體的濃度，當單體濃度大于1mmol/L時大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1:1.4，如果單休濃度降到0.5mmol/L以下時，兩者的結(jié)合比僅為1:0.4這樣就不能消除蛋白質(zhì)原有的電荷差別，為保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合，它們的重量比應該為1:4或1:3樣品緩沖液的離子強度。SDS電泳的樣品緩沖液離子強度較低，通常是10～100mmol/L二硫鍵是否完全被還原第6頁/共20頁二.實驗原理采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測蛋白質(zhì)分子量時，只有完全打開二硫鍵，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，SDS才能定量地結(jié)合到亞基上而給出相對遷移率和分子量對數(shù)的線性關(guān)系。因此在用SDS處理樣品同時往往用巰基乙醇處理，巰基乙醇是一種強還原劑，它使被還原的二硫鍵不易再氧化，從而使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與SDS定量結(jié)合。有許多蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在SDS和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)，測定時只是它們的亞基或單條肽鏈的MW。已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用SDS測定分子量。如電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。第7頁/共20頁二.實驗原理采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測蛋白質(zhì)分子量時，往往采取2種以上測定方法結(jié)合使用。目前其他常用測定相對分子量的方法有：聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的相對分子量（有濃縮樣品特點，可分次加樣；不需解離亞基，適宜測定球蛋白，而對纖維蛋白有誤差。電泳需2000伏特小時）凝膠層析法測定蛋白質(zhì)相對分子量（特點方法簡單，樣品用量少，而且有時不需純物質(zhì)，一般不引起生物活性物質(zhì)的變化。局限性是pH6-8的范圍內(nèi)，線性關(guān)系比較好，但在極端pH時，蛋白質(zhì)有可能因變性而偏離。）第8頁/共20頁三.實驗試劑和器材

1.材料：

低分子量標準蛋白試劑盒:

低分子量標準蛋白：兔磷酸化酶BMW=97,400

牛血清白蛋白MW=66,200

兔肌動蛋白MW=43,000

牛碳酸酐酶MW=31,000

胰蛋白酶抑制劑MW=20,100

雞蛋清溶菌酶MW=14,400

開封后溶于200μl蒸餾水，置-20℃保存，使用前室溫融化，沸水浴中加熱3-5分鐘后上樣。

樣品1：稱3mg樣品1，加2ml蒸餾水溶解。第9頁/共20頁2.實驗試劑

(1)30%丙烯酰胺（Acr）：稱Acr30g，甲叉雙丙烯酰胺

（Bis）0.8g，加蒸餾水至100ml，過濾后置棕色瓶中，

4℃貯存可用1-2月。

（2）10%SDS（十二烷基磺酸鈉）

（3）1.5mol/LpH8.8Tris-HCl緩沖液：稱取Tris18.2g，

加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.8，最后用蒸餾

水定容至100ml。

（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液：稱取Tris12.1g，加

入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8，最后用蒸餾水

定容至100ml。

（5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl緩沖液：稱取Tris0.6g，加

入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.0，最后用蒸餾水定

容至100ml。

第10頁/共20頁（7）10%過硫酸銨(AP)

（8）TEMED（四甲基乙二胺）

（9）樣品溶解液：SDS（100mg）+巰基乙醇（0.1ml）+

溴酚藍（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/LpH8.0Tris-

HCl（2ml），最后定容至10ml。

（10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻。

（11）染色液：稱取考馬斯亮藍R2500.125g，加上述固定液

250ml，過濾后備用。

（12）脫色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1000ml。

（13）電極緩沖液（內(nèi)含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸緩沖液pH8.3）：稱Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml。

2.實驗試劑第11頁/共20頁3.實驗器材垂直板電泳裝置直流穩(wěn)壓電源移液管濾紙微量注射器大培養(yǎng)皿第12頁/共20頁各部分凝膠配制第13頁/共20頁四.實驗過程

1.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干,準備2個干凈的錐形瓶.

2.把玻璃板在灌膠支架上固定好.

※固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板.

3.按比例配好分離膠,用移液管快速加入,大約5厘米左右,之后加少許蒸餾水,靜置40分鐘.

※凝膠配制過程要迅速,催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結(jié)無法注膠.注膠過程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡.

第14頁/共20頁四.實驗過程.

※水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡

※凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面.

4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干,按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入樣梳,靜置40分鐘.

※樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平.

第15頁/共20頁四.實驗過程5.拔出樣梳后,在上槽內(nèi)加入緩沖液,沒過鋸齒時可拆去

底端的瓊脂糖.

※要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出,否則會影響加樣效果.

6、加樣三個。（1）取10μl標準蛋白溶解液于EP管內(nèi)，再加入10μl2倍樣品緩沖液，上樣量為20μl。

（2）取10μl樣品1溶液，再加入10μl2倍樣品緩沖液，上樣量分別為5μl和10μl。

7.用微量注射器距槽底三分之一處進樣,加樣前,樣品在

沸水中加熱3分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。

※注射器不可過低,以防刺破膠體,也不可過高,在樣下

沉時會發(fā)生擴散.

※為避免邊緣效應,最好選用中部的孔注樣.

第16頁/共20頁四.實驗過程8.電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進行電泳，開始電流恒定在10mA，當進入分離膠后改為20mA，溴酚藍距凝膠邊緣約5mm時，停止電泳。

9.凝膠板剝離與染色：電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，染色1小時左右。

10.脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。

※剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分.

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11.實驗結(jié)果分析。第17頁/共20頁五.分析計算繪制標準曲線：

按下式計算相對遷移率：

以每個蛋白標準的分子量對數(shù)對它的相對遷