生物電子顯微技術(shù)作業(yè)課后作業(yè)C簡(jiǎn)述超高壓電子顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)，以及切片與普通超薄切片的不同。答：超高壓電鏡不僅分辨率高、單色性好，并且電子穿透力強(qiáng)，對(duì)材料的損傷較小，可以觀測(cè)較厚的材料(0.5-10μm)，場(chǎng)深大，成像有立體感，并且不會(huì)影響分辨率。重要用于觀測(cè)材料、礦物、生物樣品、器件透射電子顯微象及電子衍射圖，對(duì)樣品微觀組織、結(jié)構(gòu)、缺陷等定性、定量分析。可對(duì)樣品在加熱、拉伸、電子輻照等條件下微觀組織的變化過程進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè)。一般透射電鏡觀測(cè)樣品時(shí)，電子束無法穿過0.1mm以上的切片，所以需將樣品切成50~70nm的薄片才干觀測(cè)。與光鏡觀測(cè)的3~7mm切片對(duì)比而言，常將透射電鏡的切片稱為超薄切片。用于超高壓電鏡的厚切片制備與普通超薄切片相似，只是有一些特殊規(guī)定:其切片材料的制備與普通電鏡有所不同。樣品塊要相對(duì)軟一些，以保護(hù)刀口和便于制作連續(xù)切片。覆蓋的支持膜要厚，并噴碳加固，以抗高壓電子轟擊。選用折疊式載網(wǎng)或單縫載網(wǎng)，以防切片脫落和阻擋視野。采用浸沒法染色，并適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間。包埋前可先進(jìn)行整體染色。2.比較透射電鏡與掃描電鏡在觀測(cè)效果和研究用途上的不同？它們各自的優(yōu)缺陷是什么？透射電鏡掃描電鏡觀測(cè)效果電子顯微鏡是使用電子來展示物件的內(nèi)部或表面的顯微鏡。高速的電子的波長(zhǎng)比可見光的波長(zhǎng)短（波粒二象性），而顯微鏡的分辨率受其使用的波長(zhǎng)的限制，因此電子顯微鏡的理論分辨率（約0.1納米）遠(yuǎn)高于光學(xué)顯微鏡的分辨率（約200納米）。分辨率為0.1～0.2nm，放大倍數(shù)為幾萬～幾十萬倍它可以直接觀測(cè)直徑100mm，高50mm，或更大尺寸的試樣，對(duì)試樣的形狀沒有任何限制，粗糙表面也能觀測(cè)，這便免去了制備樣品的麻煩，并且能真實(shí)觀測(cè)試樣自身物質(zhì)成分不同的襯度（背反射電子象）。分辨率可達(dá)3-10nm,放大倍數(shù)可達(dá)10萬倍研究用途用以觀測(cè)為亞顯微結(jié)構(gòu)或超微結(jié)構(gòu)。觀測(cè)樣品形貌、原位分析樣品的晶體結(jié)構(gòu)重要是用來觀測(cè)物體表面超微形態(tài),適合觀測(cè)固態(tài)的生物材料,也可以觀測(cè)生物材料斷面或剝蝕面的結(jié)構(gòu)（亞細(xì)胞形態(tài)），但是需要預(yù)先進(jìn)行切割或蝕刻解決。有時(shí)甚至也可進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記物的形態(tài)觀測(cè)。由于具有很高的分辨率，多以被廣泛用于觀測(cè)納米材料。優(yōu)點(diǎn)1.制樣過程對(duì)芯片內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響較小2.透射電子穿過樣品內(nèi)部，同樣品內(nèi)部的所有東西發(fā)生互相作用，從而直接獲得內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息，因此得到綜合的高分辨率結(jié)果3.易于調(diào)整，通過改變線圈中流過電流的強(qiáng)度，可以改變磁場(chǎng)強(qiáng)度，達(dá)成變化折射率和焦距的目的4.像差較小，且較為容易消除或校正5.對(duì)電子束流的能量損耗小1.具有很高的分辨率2.制樣方便，制樣周期短，有時(shí)可以作非破壞性的分析3.觀測(cè)范圍大，倍率變化大，立體感強(qiáng)，景深大，觀測(cè)效果好缺陷結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對(duì)制作材料的純度、元件幾何形狀尺寸的加工精密度等都要求極高制樣的技術(shù)難度大，觀測(cè)點(diǎn)的定位難，有時(shí)需借用聚焦離子束刻蝕才干完畢3.分析周期長(zhǎng)4.成本較高1.只能在樣品表面掃描，信號(hào)來自樣品表面，不能獲得樣品內(nèi)比較深的部位的情況2.顯微像一般不包含結(jié)構(gòu)信號(hào)，不能區(qū)分單晶、多晶、非晶，不能區(qū)分位錯(cuò)、層錯(cuò)、晶界等3.不適合厚度在微米以下的薄膜的分析需求3.采用低溫解決制作電鏡樣品的優(yōu)缺陷是什么？?jī)?yōu)點(diǎn)缺陷1.固定形態(tài)和結(jié)構(gòu)，且固化結(jié)構(gòu)使之易于進(jìn)一步解決2.在保存生物活性的基礎(chǔ)上儲(chǔ)存生物材料3.在制作冷凍超薄切片時(shí)，不需經(jīng)化學(xué)藥劑固定、脫水、過渡、聚合等，減少了解決過程導(dǎo)致的閻像低溫解決依舊不能解決永久活體，并且制作過程容易產(chǎn)生冷凍損傷和干燥損傷。并且切片太厚，不能做連續(xù)切片，并且容易破碎。4.為什么要采用臨界點(diǎn)干燥來解決掃描電鏡樣品？哪些材料不用臨界點(diǎn)干燥來解決也能獲得滿意的圖像？答：臨界點(diǎn)干燥就是運(yùn)用物質(zhì)在臨界狀態(tài)下，液體表面張力消除的特性，克服樣品干燥過程中所發(fā)生的變形，保持樣品原狀，達(dá)成干燥的目的。其原理是在一定的溫度和壓力下，物質(zhì)的液態(tài)和氣態(tài)界面將會(huì)消失，液態(tài)瞬間轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，形成非液非固的狀態(tài)，即達(dá)成臨界點(diǎn)（C.P）狀態(tài)。在臨界點(diǎn)時(shí)，表面張力消失，分子間的內(nèi)聚力等于零，因此，運(yùn)用臨界點(diǎn)狀態(tài)對(duì)材料進(jìn)行干燥，材料理論上不會(huì)產(chǎn)生收縮和形變，對(duì)于質(zhì)地較軟的材料這種方法是最佳的干燥方法。所以說，對(duì)于比較堅(jiān)硬的材料，及時(shí)不使用臨界點(diǎn)干燥法也可以實(shí)現(xiàn)較好的圖像觀測(cè)。查找采用了低溫制樣技術(shù)的研究文獻(xiàn)，搜集精美圖片，分析這些工作的技術(shù)難點(diǎn)和發(fā)表圖片的質(zhì)量。答：技術(shù)難點(diǎn)： 1、冰晶 冰晶是組織在冷凍固化過程中,由于冷凍緩慢,冷凍時(shí)間過長(zhǎng),使細(xì)胞質(zhì)和組織間隙內(nèi)未結(jié)合的水逐漸析出形成解決辦法:取材大小、厚薄要適宜,過大過厚影響冷凍速度。 2、組織擠壓、皺縮。常見于組織結(jié)構(gòu)軟硬不同的組織，如皮膚。解決方法：將表皮面放在標(biāo)本的上端,先切較軟的皮下組織,依次切真皮、表皮,同時(shí)用毛筆輕輕展開,或用抗卷板才干切出完整的切片 3、冷凍切片一般不會(huì)脫片,偶見于壞死組織或含水量大的組織,如子宮肌瘤黏液變性時(shí)。解決方法:一方面切片不能太厚,另一方面切片固定后用吹風(fēng)機(jī)吹干再染色。 4、甲狀腺等有腔洞的組織，組織冷凍過頭,使之發(fā)脆就會(huì)破碎形成空洞,這時(shí)可用手貼在組織上或用嘴向組織哈氣稍加溫使其軟化即可切出完整的切片。 5、組織貼附不平或者有皺褶 切片切好后用載玻片貼片時(shí)手不能顫抖,并且在貼附組織時(shí)手要有一個(gè)向下伸展的動(dòng)作。文獻(xiàn)一密方元,李鳳山,馬邦磊,錢寧.冷凍切片5min快速制片染色法.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2023，Oct25.圖SEQ圖表\*ARABIC1A進(jìn)口OCT包埋的腮腺混合瘤冷凍切片B膠片包埋的腮腺混合瘤冷凍切片圖SEQ圖表\*ARABIC2腎粗針穿刺小標(biāo)本,先制成冷凍圖SEQ圖表\*ARABIC3脂肪組織冷凍切片,脂肪細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)平后做冷凍切片,保持了組織保持完整，細(xì)胞邊界清楚，染色鮮艷圖SEQ圖表\*ARABIC4甲狀腺組織,HE染色前未經(jīng)二圖SEQ圖表\*ARABIC5甲狀腺組織,HE染色前經(jīng)二甲苯脫脂甲苯脫脂解決,胞核較模糊解決后，胞核、質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚、透明我認(rèn)為這幾張圖片比較好，清楚，甲狀腺組織切片中破碎形成空洞，染色很均勻。文獻(xiàn)二胥維勇，楊紅，李科，楊群.介紹一種FAAPT冷凍切片快速固定液.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志.2023Apr;18摘要手術(shù)中冷凍切片的病理診斷是根據(jù)冷凍切片組織學(xué)形態(tài)來進(jìn)行,以擬定病變組織的良惡性為目的。制作冷凍切片涉及制片、固定、染色三個(gè)環(huán)節(jié),在冷凍切片中固定液的選擇是不可忽視的一個(gè)因素。我們?cè)诠ぷ髦薪?jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)在眾多固定液中選擇FAA液(福爾馬林-醋酸-乙醇),經(jīng)改良配成一種