呼吸道苛養(yǎng)菌耐藥機制及檢測第1頁/共42頁社區(qū)獲得性呼吸道感染的重要病原菌肺炎鏈球菌流感嗜血桿菌卡他莫拉菌第2頁/共42頁肺炎鏈球菌耐藥機制

PRSPMDRSP第3頁/共42頁1967年首次報道對青霉素耐藥的肺炎鏈球菌。20世紀80年代，在西班牙、匈牙利和南非等幾個國家出現對青霉素高水平耐藥的肺炎鏈球菌。根據ANSORP監(jiān)測的結果，在韓國、日本、香港、越南和泰國等亞洲國家，肺炎鏈球菌對青霉素、大環(huán)內酯類、氟喹諾酮類抗生素的多重耐藥性的出現已引起世界上高度關注。越南、香港和韓國引起侵襲性感染的肺炎鏈球菌對青霉素的耐藥率在70%以上。

第4頁/共42頁肺炎鏈球菌

青霉素中介和耐藥菌株的百分率pen-I(penicillinMIC0.12–1μg/ml)pen-R(penicillinMIC2μg/ml)SWUSA9%

18%NEUSA10%

32%Brazil13%

3%Mexico36%

18%SouthAfrica36%

15%SaudiArabia31%

25%HongKong4%

71%TheAlexanderProject2000,Jolobaetal.ICAAC2001,AbstractC2-699第5頁/共42頁肺炎鏈球菌

對青霉素的耐藥情況（亞洲）第6頁/共42頁肺炎鏈球菌

對青霉素的耐藥情況（亞洲）第7頁/共42頁第8頁/共42頁肺炎鏈球菌

大環(huán)內酯類耐藥菌株的百分率Macrolideresistancedefinedas

erythromycinMIC1μg/mlTheAlexanderProject2000,Felminghametal.ECCMID2002SWUSA26%NEUSA34%Brazil3%Mexico29%SouthAfrica19%SaudiArabia16%HongKong81%第9頁/共42頁

肺炎鏈球菌

對大環(huán)內酯類的耐藥情況（歐洲）Mean17.2%Germany7.8%Spain35.2%-AlexanderProject1999,Europe第10頁/共42頁肺炎鏈球菌

對大環(huán)內酯類的耐藥情況（亞洲）ERYMIC90＞128μg/mLSpnVietnam92%Taiwan86%Korea81%Hongkong77%China72%-ANSORP第11頁/共42頁常用抗生素對肺鏈的敏感性（2001年）————68.012.020.0復方磺胺甲基異惡唑*————72.010.018.0四環(huán)素*————34.0066.0氯霉素*25625628.70.064~25680.0020.0紅霉素0.0320.380.060.016~3.03.03.094.0頭孢曲松0.0941.50.130.016~32.07.08.085.0頭孢克洛0.0470.750.060.002~4.06.049.045.0青霉素MIC值（mg/L)MIC50MC90MIC均值范圍敏感率（%）R△I△S△藥物注：*僅用K-B法檢測的抗生素△R耐藥、I中介、S敏感-陸權等中國抗生素雜志.2003:28(4):212-14第12頁/共42頁上海瑞金醫(yī)院結果79株肺炎鏈球菌有35株對青霉素不敏感(MIC≥0.12μg/ml),占44.3%,其中高水平耐藥(MIC≥2μg/ml,PRSP)的菌株占17.7%(14/79)；低水平度耐藥(MIC0.12~1μg/ml,PISP)的菌株占26.6%(21/79)青霉素耐藥的發(fā)生率高于北京地區(qū)的14%，與我國臺灣南部、泰國等相近，但低于韓國、日本、我國香港地區(qū)等。第13頁/共42頁79株肺炎鏈球菌對9種抗生素敏感性

及MIC50、MIC90值(μg/ml)0.50.51000.00.0萬古霉素3849616.411.472.2復方新諾明161616.53.879.7四環(huán)素2196.23.80.0氧氟沙星2127.815.257.0紅霉素4291.10.08.9氯霉素0.50.0392.41.36.3頭孢曲松10.03287.46.36.3頭孢噻肟40.03255.726.617.7青霉素MIC90MIC50%S%I%R藥物注：%R：耐藥百分率%I：中介百分率%S：敏感百分率第14頁/共42頁肺炎鏈球菌青霉素不敏感組與敏感組對其他8種抗生素的耐藥情況（79株）0.014.39.50.03.30.00.00.0%I0.081.081.00.061.94.84.84.8%RPISP1000.014.385.77.178.664.335.7%S0.07.17.114.30.00.07.135.7%IPSSPPRSP1000.00.01000.0萬古霉素27.311.461.44.892.9復方新諾明20.50.079.59.578.6四環(huán)素97.32.30.01000.0氧氟沙星45.511.443.24.892.9紅霉素93.20.06.895.221.4氯霉素1000.00.095.228.6頭孢曲松1000.00.095.228.6頭孢噻肟%S%I%R%S%R藥物注：%R：耐藥百分率%I：中介百分率%S：敏感百分率第15頁/共42頁小結在許多亞洲國家，大環(huán)內酯類耐藥性的上升比青霉素耐藥性的上升更明顯。亞洲國家大環(huán)內酯類耐藥以erm-gene介導的高水平耐藥為主，使紅霉素的MIC90≥128mg/L在多數亞洲國家，2000-2001氟喹諾酮耐藥性的增加并不明顯，但香港侵襲性肺炎球菌分離株對levof的耐藥率為8~12%第16頁/共42頁PRSP的耐藥機制肺炎鏈球菌對青霉素耐藥與青霉素酶無關，而是由于PBPs1a、2a、2b和2x質量和數量的改變引起。這些改變是由于染色體突變及鼻咽部共棲菌釋放的DNA轉化、基因重組產生。變異的基因呈鑲嵌結構,是由編碼敏感的PBPs的結構基因與外源基因片段重組產生,重組基因可發(fā)生在不同位點呈多位點,而且外源基因可能來源于鏈球菌屬的其他細菌。第17頁/共42頁第18頁/共42頁第19頁/共42頁青霉素高耐株均是PBP1a、PBP2b和PBP2x同時變異,其中PBP2x和PBP2b的改變同細菌的低水平青霉素耐藥有關。PBP2b除了在造成高水平耐藥中起關鍵作用之外,還可能同青霉素溶菌活性有關。第三代頭孢菌素類不與細菌的PBP2b互相作用,溶菌作用很小,因此肺炎鏈球菌對廣譜頭孢菌素類比對青霉素G更耐藥,這種耐藥性是同PBP2X和PBP1的改變有關。β－內酰胺酶（獲得TEM基因）？第20頁/共42頁MLSK-R1.ermB核糖體甲基化酶23SrRNA甲基化靶位修飾MLSB

表型大環(huán)內酯交叉耐藥林可霉素鏈陽霉素B2.mefE/AM表型僅對大環(huán)內酯R3.核糖體突變核糖體蛋白L4、L22和23SrRNA變異導致大環(huán)內酯耐藥第21頁/共42頁酮內酯類（泰利霉素）是大環(huán)內酯衍生物，是一種3-位L－紅霉糖被酮基替代的14元內酯環(huán)結構。酮內酯通過與rRNA的反向結合抑制蛋白質合成。L－紅霉糖的缺失使酮內酯誘導耐藥性的可能性降低。由于酮內酯顯示出對肺炎鏈球菌強大的抗菌活性（無論大環(huán)內酯敏感或耐藥），其被視為大環(huán)內酯可能的替代藥物。第22頁/共42頁突變和喹諾酮耐藥的關系TopⅣ（parCandparE）DNAgyrase（gyrAandgyrB）±efflux#1parCorgyrAmutationFQsusceptibility↓#2additionmutation：gyrA，parCfullyresistance第23頁/共42頁新型喹諾酮藥物，如加替沙星、吉米沙星和莫西沙星，對DNA促旋酶和拓樸異構酶Ⅳ具有很高活性，ParC亞單位發(fā)生變異的細菌仍對該類藥物保持敏感。在新一代喹諾酮藥物中，吉米沙星顯示了對肺炎鏈球菌最強的抗菌活性。第24頁/共42頁復方磺胺、四環(huán)素及氯霉素肺炎鏈球菌對磺胺的耐藥是由編碼二氫葉酸合成酶的染色體基因sulA突變引起，對甲氧芐啶耐藥則是由于染色體上編碼二氫葉酸還原酶的基因一個點突變引起.由tetM、tetO基因介導的核糖體保護作用導致了肺炎鏈球菌對四環(huán)素的耐藥。結合轉座子Tn5253攜帶的耐藥基因cat編碼氯霉素乙酰轉移酶使氯霉素乙酰化而失去抗菌活性。第25頁/共42頁肺炎鏈球菌對三種以上不同種類的抗生素耐藥即稱為多重耐藥肺炎鏈球菌同時形成對幾種不同種類抗生素耐藥的原因尚不清楚，但多種耐藥基因可整合在一個移動元件上,如轉座子Tn1545攜帶有大環(huán)內酯耐藥基因ermB、四環(huán)素類耐藥基因tetM、和卡那霉素耐藥基因aphA－3。第26頁/共42頁耐藥性傳播機制:1.水平傳播:耐藥基因經轉化、轉導或接合轉座子接合轉移給敏感菌．耐藥基因可來自其它類細菌或耐藥性肺炎鏈球菌,所產生的新耐藥株與原耐藥株耐藥基因相同,但總體基因型可以不同。2.克隆傳播:通過旅游、接觸等途徑造成流行，總體基因型和結構變異基因均完全一致。高耐藥克隆株（如血清型6B、19F、23F）3.可能通過基因突變,呈單獨個別發(fā)生,發(fā)生率小、蔓延程度小。頻繁使用及預防性使用抗生素是耐藥菌產生和擴散的危險因素。第27頁/共42頁肺炎鏈球菌藥敏試驗紙片擴散法微量稀釋法NCCLS推薦的參考方法E－Test商品藥敏試劑盒法第28頁/共42頁紙片擴散法M-H瓊脂+5%羊血直接菌落懸液,0.5麥氏濁度35℃,5%CO2中培養(yǎng)20～24h質控菌株:肺炎球菌ATCC49619第29頁/共42頁1μg苯唑西林紙片可用來篩選青霉素耐藥,但須認識到,當苯唑西林的抑菌環(huán)＞20mm時表明肺炎鏈球菌對青霉素敏感，這些菌往往也對其它β－內酰胺類(包括阿莫西林和多數頭孢菌素)抗生素敏感；如果苯唑西林的抑菌環(huán)＜20mm，則需要重新檢測青霉素、頭孢菌素MIC，以確認該菌株是否耐藥。許多藥物還沒有藥敏試驗的解釋標準，不能夠提供準確的、令人滿意的一些重要抗生素(如超廣譜頭孢菌素、碳青霉烯)的藥敏試驗結果。

第30頁/共42頁肉湯稀釋法離子校正的M-H肉湯加入2%～5%溶解馬血直接菌落懸液，濁度為0.5麥氏標準在35℃,空氣環(huán)境孵育20～24h質控菌株：肺炎鏈球菌ATCC49619第31頁/共42頁從腦膜炎分離的肺炎鏈球菌,應測青霉素、頭孢他啶、頭孢曲松、美羅培南和萬古霉素的MIC若發(fā)現對萬古霉素、氟喹喏酮耐藥，應排除實驗誤差或送參考實驗室。中樞神經系統(tǒng)以外分離的肺炎鏈球菌,實驗室首先用苯唑西林篩選β－內酰胺類藥物是否耐藥，但不推薦用苯唑西林紙片檢測肺炎鏈球菌以外的鏈球菌對青霉素的敏感性。紅霉素可代表對阿奇霉素、克拉霉素和地紅霉素的敏感性；對大環(huán)內酯－林可霉素－鏈陽菌素B（MLBs）的耐藥，可用D－試驗檢測。第32頁/共42頁“DTest”

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陽性反應E15CC2常規(guī)血平板:第一區(qū)要畫1/3,長出一層菌克林和紅霉素貼后之間距為15毫米可誘導的克林霉素耐藥(erm-介導)第33頁/共42頁

臨床實驗室可采用NCCLS提供的紙片擴散法，做肺炎鏈球菌和某些鏈球菌大多數抗生素(不是全部)的藥敏試驗?？蓪—試驗和紙片擴散法結合使用，在一個大的M－H羊血瓊脂平板上做青霉素、頭孢噻肟或頭孢三嗪的E－試驗