基因工程載體B第1頁(yè)/共93頁(yè)噬菌體：感染細(xì)菌的病毒病毒：一類超顯微的非細(xì)胞生物,

每一種病毒只含有一種核酸（DNA和RNA不會(huì)并存于同一病毒顆粒中）特點(diǎn)：只能在活細(xì)胞內(nèi)營(yíng)專性寄生;離體條件下,以無(wú)生命的化學(xué)大分子狀態(tài)存在對(duì)抗生素不敏感，對(duì)干擾素敏感第2頁(yè)/共93頁(yè)病毒與宿主關(guān)系來分：溫和性病毒

構(gòu)建載體的好材料烈性病毒

通過改造，也可用于構(gòu)建載體第3頁(yè)/共93頁(yè)病毒克隆載體應(yīng)用的局限性：

溫和性病毒和烈性病毒都存在嚴(yán)格的宿主專一性部分病毒的性質(zhì)第4頁(yè)/共93頁(yè)一.噬菌體T2噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖第5頁(yè)/共93頁(yè)三類典型形態(tài)的病毒：▼

廿面體對(duì)稱的結(jié)構(gòu)(球狀)▼

螺旋對(duì)稱的結(jié)構(gòu)(桿狀)▼

復(fù)合對(duì)稱的結(jié)構(gòu)(蝌蚪狀)

大腸桿菌的T4噬菌體:由橢圓形的二十面體頭部和螺旋對(duì)稱的尾部組合而成

病毒中復(fù)合對(duì)稱的代表第6頁(yè)/共93頁(yè)噬菌體的生命周期分為:溶菌周期和溶源周期烈性噬菌體:

只具有溶菌生長(zhǎng)周期的噬菌體溫和噬菌體:

既能進(jìn)入溶源生命周期又能進(jìn)入溶菌周期的噬菌體溶源周期:

感染過程中無(wú)子代噬菌體顆粒,

噬菌體DNA整合到寄主細(xì)胞染色體DNA,細(xì)菌繼續(xù)生長(zhǎng)增殖,

噬菌體的基因作為細(xì)菌染色體的一部分進(jìn)行復(fù)制第7頁(yè)/共93頁(yè)烈性噬菌體的繁殖途徑

Phagereproductivecycle吸附Phageattachestobacterialcell.注入核酸PhageinjectsDNA.合成核酸和蛋白質(zhì)PhageDNAdirectshostcelltomakemorephageDNAandproteinparts.裝配Newphagesassemble.釋放Celllysesandreleasesnewphages.透明的不長(zhǎng)菌的小圓斑典型的烈性噬菌體的生命周期20-60min第8頁(yè)/共93頁(yè)溫和噬菌體的繁殖途徑溶原化途徑溶菌途徑第9頁(yè)/共93頁(yè)λ溶源性細(xì)菌特點(diǎn)：超感染免疫性（抗御同種噬菌體再次感染的特性）溶源性細(xì)菌可誘發(fā)進(jìn)入溶菌周期(OL、OR擺脫cI阻遏蛋白后進(jìn)入該周期)?cI=阻遏基因O=操縱基因P=啟動(dòng)子L=左向R=右向第10頁(yè)/共93頁(yè)c、λ噬菌體在宿主體外與蛋白質(zhì)結(jié)合包裝成為含雙鏈線狀DNA的顆粒，分為四個(gè)區(qū)。λ噬菌體與λ噬菌體載體的特點(diǎn)：a、λ噬菌體是使用最早、研究最為詳盡的大腸桿菌雙鏈DNA噬菌體；1974年作為克隆載體使用。中等大小的溫和噬菌體；

常用于構(gòu)建基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)；b、λ噬菌體載體克隆效率遠(yuǎn)高于質(zhì)粒載體，獲得的文庫(kù)大而完整，構(gòu)建的文庫(kù)容易篩選、擴(kuò)增和保存。第11頁(yè)/共93頁(yè)線狀λ噬菌體基因組的四個(gè)區(qū)：左側(cè)區(qū)、中間區(qū)、右側(cè)區(qū)（調(diào)控成分、復(fù)制基因O和P、溶菌基因S和R）和末端結(jié)構(gòu)

（λ噬菌體的DNA在噬菌體中是線狀DNA分子，基因組是一長(zhǎng)約48502bp的雙鏈DNA）第12頁(yè)/共93頁(yè)λ噬菌體cos位點(diǎn)由位于λ噬菌體線形雙鏈DNA的兩端且完全互補(bǔ)的粘末端（12bp）結(jié)合成的雙鏈稱為Cos位點(diǎn)第13頁(yè)/共93頁(yè)att位點(diǎn)attLattR噬菌體插入大腸桿菌基因組方式Champbell模型λ噬菌體DNA環(huán)化的λ噬菌體DNAIntegrase催化鏈的交換第14頁(yè)/共93頁(yè)包裝限制：離體條件下，將重組體DNA包入噬菌體等病毒顆粒中以形成有功能的病毒載體；λ噬菌體頭部外殼蛋白質(zhì)容納DNA的能力:上限：野生型DNA總量（48kb）的5％左右低限：野生型DNA總量（48kb）的75％構(gòu)建λ噬菌體的基本策略與技術(shù)路線：(1)去除λ噬菌體非必須區(qū)方法：去除非必須片斷(復(fù)制、裂解等非必須)

同時(shí)，抹去一些酶切位點(diǎn)λ噬菌體的包裝限制:大小51-36kb之間第15頁(yè)/共93頁(yè)溶菌途徑：λ噬菌體感染Ecoli后，線形λDNA注入細(xì)胞內(nèi)，若進(jìn)入溶菌生長(zhǎng)途徑，則粘性末端連接成環(huán)狀DNA分子，指令宿主細(xì)胞合成與包裝相關(guān)的系列殼蛋白和酶，復(fù)制出新的λDNA，包裝成子代噬菌體顆粒，并在R蛋白和S蛋白的作用下，宿主細(xì)胞破裂，釋放出大量子代噬菌體顆粒，感染新的細(xì)胞。依靠cos位點(diǎn)形成環(huán)狀的λ噬菌體DNA第16頁(yè)/共93頁(yè)代表性λ噬菌體載體插入型載體(insertionvectors)：只具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)（只能承受10kb以內(nèi)的小片段外源DNA的插入，廣泛用于cDNA及小片段DNA的克?。┲脫Q型載體(replacementvectors)：具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代（可承受較大分子量的外源DNA片段的插入，適用于克隆高等真核生物的染色體DNA）第17頁(yè)/共93頁(yè)置換型插入型插入失活效應(yīng)：外源的DNA克隆進(jìn)入插入型的λ載體分子上，會(huì)使噬菌體的某種生物功能喪失效力。免疫功能失活的（inactivatiortofimmunityfunction）和大腸桿菌β-半乳糖苷酶失活的（inactlvatlonofE．coliβ-galactosidase）第18頁(yè)/共93頁(yè)置換型一類在λ噬菌體基礎(chǔ)上改建的，在其中央部分有一個(gè)可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆載體第19頁(yè)/共93頁(yè)插入型載體

置換型載體

第20頁(yè)/共93頁(yè)插入型載體的克隆能力第21頁(yè)/共93頁(yè)置換型（取代）載體的克隆能力第22頁(yè)/共93頁(yè)(2)標(biāo)記基因

噬菌斑：透明（有外源DNA插入）和混濁

α-互補(bǔ)現(xiàn)象：藍(lán)白斑、紅白斑

Spi-

：外源DNA取代red、gam基因，能在P2噬菌體溶源性細(xì)菌中生長(zhǎng)(3)建立外包裝系統(tǒng)

轉(zhuǎn)染(transfection)：裸露DNA；由寄主細(xì)胞捕獲裸露的噬菌體DNA的過程。原核生物的轉(zhuǎn)染就方法來說與轉(zhuǎn)化是一樣的；將表達(dá)載體等導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程

轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：包裝后，噬菌體顆粒介導(dǎo)第23頁(yè)/共93頁(yè)宿主細(xì)胞中λ噬菌體的包裝過程第24頁(yè)/共93頁(yè)頭部:E蛋白占72%：頭部主要組成成分

琥珀突變使λ噬菌體不能形成頭部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致尾部蛋白累積D蛋白占20%:λDNA進(jìn)入頭部前體以及頭部成熟作用

琥珀突變使得λ噬菌體DNA不能進(jìn)入頭部，頭部蛋白累積第25頁(yè)/共93頁(yè)λ噬菌體頭部和尾部的體外裝配是分開進(jìn)行的第26頁(yè)/共93頁(yè)D基因缺失突變株(D-):

溶原菌菌株BHB2690E基因缺失突變株(E-)

溶原菌菌株BHB2688

第27頁(yè)/共93頁(yè)注意：λ噬菌載體+外源DNA的大小：36kb～52kb體外包裝：λ噬菌載體

+尾部蛋白

+頭部蛋白

用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建外源目的基因的克隆λ噬菌體克隆載體的應(yīng)用第28頁(yè)/共93頁(yè)第29頁(yè)/共93頁(yè)二.粘粒(cosmid)λ噬菌體克隆外源DNA能力，最大23kbp，較為有效的克隆為15kbp在研究基因組功能時(shí)，需要更大克隆能力的載體(雞膠原蛋白基因長(zhǎng)38kb)，設(shè)計(jì)構(gòu)建了cosmid(黏粒或柯斯質(zhì)粒)第30頁(yè)/共93頁(yè)粘粒定義:包含λ噬菌體cos位點(diǎn)的質(zhì)粒，因此，質(zhì)粒DNA在體內(nèi)可以被噬菌體衣殼蛋白包裹?包含cos兩端280bp以上的序列以及包裝相關(guān)序列。剩余部分為質(zhì)粒，具有質(zhì)粒的性質(zhì)；大小約4～6kb?進(jìn)行有效包裝，插入片斷后，總大小要在36.4-51bp之間(允許克隆的外源DNA片段長(zhǎng)度為

31～45kb)第31頁(yè)/共93頁(yè)第32頁(yè)/共93頁(yè)粘粒的特點(diǎn):(1)具有部分λ噬菌體特點(diǎn)體外包裝后，高效轉(zhuǎn)導(dǎo)敏感型大腸細(xì)胞，進(jìn)入后環(huán)化(2)具有質(zhì)粒特點(diǎn)復(fù)制、抗性(3)高容量克隆能力極限可達(dá)45kbp第33頁(yè)/共93頁(yè)λ噬菌體包裝必備條件:cos位點(diǎn)末端酶(teminase)第34頁(yè)/共93頁(yè)Cosmid克隆載體

cosmid（cossite-carringplasmid）：

人工構(gòu)建的含有λDNA的cos位點(diǎn)序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體第35頁(yè)/共93頁(yè)pHC79柯斯質(zhì)粒載體pHC79的形體圖由pBR322質(zhì)粒DNA與λ噬菌體DNA的cos位點(diǎn)及其控制包裝作用的序列構(gòu)成第36頁(yè)/共93頁(yè)部分柯斯質(zhì)粒的基本特性第37頁(yè)/共93頁(yè)柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：1）具有λ噬菌體的特性（但因不含全部必需基因，因此不能通過溶菌周期，無(wú)法形成子代噬菌體顆粒）2）具有質(zhì)粒的特性（有質(zhì)粒復(fù)制子及抗菌素基因）3）具有高容量的克隆能力（本身僅5-7kb,克隆極限可達(dá)45kb左右）4）具有與同源序列質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力廣泛應(yīng)用于基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建第38頁(yè)/共93頁(yè)柯斯克?。╟osmidcloning）

理論依據(jù)：1）在線性噬菌體DNA分子的每一端，都具有一段彼此互補(bǔ)的單鏈突出序列（cos位點(diǎn))2）在λ噬菌體的正常生命周期中，會(huì)產(chǎn)生出由數(shù)百個(gè)λDNA拷貝組成的多連體分子。在此種分子中，前后兩個(gè)λDNA基因組之間都是通過cos位點(diǎn)連接起來的3）λ噬菌體具有的一種位點(diǎn)特異的切割體系(site-specificcuttingsystem),又叫Ter體系，能識(shí)別兩個(gè)相距適宜的cos位點(diǎn)(38-45kb)，將多連體分子切割成λ單位長(zhǎng)度的片段，并將它們包裝到λ噬菌體頭部中去第39頁(yè)/共93頁(yè)(如EcoRI)38kb-52kb第40頁(yè)/共93頁(yè)M13噬菌體M13單鏈DNA噬菌體的生命周期M13噬菌體是一絲狀噬菌體，內(nèi)有一個(gè)環(huán)狀單鏈DNA分子（“+”鏈DNA）,長(zhǎng)6407bp第41頁(yè)/共93頁(yè)M13噬菌體的特點(diǎn)感染Ecoli后，在宿主細(xì)胞內(nèi)形成雙鏈的復(fù)制型DNA（replicationformDNA,RFDNA），可以象質(zhì)粒DNA那樣在體外進(jìn)行純化和操作。

成熟的噬菌體顆粒僅能感染E.coli的F+細(xì)胞（噬菌體的感染位點(diǎn)在性散毛上）。但RFDNA或ssDNA都能轉(zhuǎn)染E.coli的F+或F-細(xì)胞。

噬菌體顆粒的大小是受其DNA的大小制約的（正好與λ噬菌體相反），因此它不存在包裝限制問題。第42頁(yè)/共93頁(yè)M13噬菌體6.4kb單鏈環(huán)狀正鏈DNA基因組作載體的優(yōu)點(diǎn)：

1)RFDNA和SSDNA都可轉(zhuǎn)染E.coli，產(chǎn)生噬菌斑；

2)無(wú)包裝限制問題（可6倍于M13基因組）；

3)

復(fù)制以雙鏈環(huán)形DNA為中間媒介；

4）易測(cè)出外源DNA的插入方向；

5）可產(chǎn)生能直接測(cè)序的單鏈DNA分子。第43頁(yè)/共93頁(yè)構(gòu)建M13噬菌體克隆載體的策略和途徑詳見第二版P116第44頁(yè)/共93頁(yè)噬菌粒載體（phagemidvector)由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的載體系統(tǒng)，稱為噬菌粒（phagemid或phasmid）第45頁(yè)/共93頁(yè)噬菌體質(zhì)粒單鏈?zhǔn)删w輔助噬菌體大腸桿菌寄主菌株pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101πVXM13M13變異株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL-Blue幾種常用的噬菌粒載體的一般特征第46頁(yè)/共93頁(yè)pUC119(MCS)pUC118(MCS)puC118和pUC119噬菌粒載體的分子結(jié)構(gòu)第47頁(yè)/共93頁(yè)噬菌粒載體的特點(diǎn)（1）具小分子量的共價(jià)、閉合、環(huán)狀的基因基因組DNA，可克隆高達(dá)10kb的外源DNA；拷貝數(shù)高；（2）有ampr等基因作為選擇記號(hào)；可用組織化學(xué)顯色反應(yīng)篩選重組子；存在多克隆位點(diǎn)；（3）具質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)，在無(wú)輔助噬菌體存在下，克隆外源基因可按質(zhì)粒一樣復(fù)制；（4）有單鏈?zhǔn)删w復(fù)制起點(diǎn)，在有噬菌體輔助感染的宿主細(xì)胞中，可合成出單鏈DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆粒分泌到培養(yǎng)基中。（5）可直接對(duì)克隆的基因進(jìn)行核苷酸測(cè)序第48頁(yè)/共93頁(yè)CaMV(花椰菜花葉病毒)載體系統(tǒng)：雙鏈DNA病毒TMV(煙草花葉病毒)載體系統(tǒng)：?jiǎn)捂淩NA病毒其他植物病毒載體系統(tǒng)，如單鏈DNA病毒：番茄金黃花葉病毒、非洲木薯花葉病毒、玉米線條病毒、小麥矮縮病毒，以及RNA病毒：雀麥草花葉病毒、大麥條紋花葉病毒、番茄叢矮病毒等等。植物病毒載體第49頁(yè)/共93頁(yè)花椰菜花葉病毒(caulimovirus，CaMV)：實(shí)際上是一個(gè)病毒群，已知有12個(gè)種。該病毒是為數(shù)不多的植物雙鏈DNA病毒之一。每個(gè)種的寄主范圍都很窄，不感染豆類和單子葉植株，它的寄主主要是十字花科植物（集中在蕓苔屬）和少數(shù)非十字花科（如茄科）植物。CaMVDNA的特征：

在病毒顆粒中，CaMVDNA分子以開環(huán)形式存在，兩條鏈的一定位置出現(xiàn)核苷酸序列不連續(xù)的缺口（負(fù)鏈：1個(gè)，即G1；正鏈：2個(gè)，即G2和G3）。CaMV(花椰菜花葉病毒)載體系統(tǒng)第50頁(yè)/共93頁(yè)構(gòu)建CaMV載體的基本策略自然條件下，

CaMV感染宿主后，其DNA可以侵入植物細(xì)胞，但不插入染色體DNA，而是在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，但其結(jié)果是導(dǎo)致植物的病害。根據(jù)此特征，構(gòu)建載體的基本策略是：合理利用CaMVDNA能侵入植物細(xì)胞的特性，可以將外源基因?qū)胫参矬w內(nèi)，但需要消除CaMV對(duì)植物的致病性。詳見第二版P130第51頁(yè)/共93頁(yè)◆質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細(xì)菌中繁殖，不能滿足動(dòng)物DNA重組的需要。能感染動(dòng)物的病毒可改造為動(dòng)物細(xì)胞的載體病毒載體多為穿梭載體：動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費(fèi)較多動(dòng)物病毒載體◆常用病毒載體:改造來自猴腎病毒SV40（SimianVirus40）、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和昆蟲桿狀病毒等目的:

將目的基因或序列放入動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)或試驗(yàn)其功能、或作基因治療等

第52頁(yè)/共93頁(yè)SV40病毒

SV40病毒呈小型20面體，環(huán)狀DNA，外殼蛋白由VP1、VP2、VP3構(gòu)成?；蚪Y(jié)構(gòu)早期表達(dá)區(qū)編碼大T抗原和小t抗原（即腫瘤蛋白質(zhì)或抗原）。T抗原的功能是控制SV40基因組的復(fù)制和調(diào)節(jié)。小t抗原的功能不詳晚期表達(dá)區(qū)合成Vp1、Vp2、Vp3（外殼蛋白），包裝釋放受納細(xì)胞（permissivecell）：病毒感染宿主細(xì)胞后，使細(xì)胞裂解，并釋放感染性病毒顆粒。非受納細(xì)胞（nonpermissivecell）：不產(chǎn)生感染性病毒顆粒，而病毒DNA整合到細(xì)胞染色體中產(chǎn)生癌變。半受納細(xì)胞（semi-permissivecell）:只有部分被感染的細(xì)胞會(huì)裂解產(chǎn)生出感染性的病毒顆粒。第53頁(yè)/共93頁(yè)第54頁(yè)/共93頁(yè)(1)取代型基因載體

取代型基因載體

特點(diǎn)：外源DNA直接插入在缺陷型的病毒基因組上。插入的外源DNA片段在大小同被取代的病毒基因組區(qū)段是等同的，這樣形成的重組體DNA能夠在哺乳動(dòng)物的受納細(xì)胞中增殖，并被包裝成病毒顆粒。

但為了補(bǔ)充被取代的病毒基因組DNA的功能，必須使用一種與之互補(bǔ)的輔助病毒。第55頁(yè)/共93頁(yè)含有完整早期區(qū)段和復(fù)制起點(diǎn)的病毒-質(zhì)粒載體第56頁(yè)/共93頁(yè)①晚期區(qū)段取代載體

SV40晚期基因被外源DNA取代后，失去合成外殼蛋白功能，若加入一種溫度敏感（ts）的輔助病毒tsA58（它是一種在41℃下便不能合成T抗原的突變體），與缺乏了整個(gè)晚期區(qū)段功能的SV40病毒，可以互補(bǔ)，這兩種病毒混合感染時(shí)，仍然能夠增殖。重組體病毒能提供此種T抗原，tsA58則可以復(fù)制，并合成出外殼蛋白質(zhì)，這樣就能在受納細(xì)胞中擴(kuò)增表達(dá)。第57頁(yè)/共93頁(yè)第58頁(yè)/共93頁(yè)②早期區(qū)段取代載體

這種載體被外源基因取代早期基因而缺失大T抗原，可由COS細(xì)胞提供大T抗原，故可利于重組病毒在COS細(xì)胞中增殖和擴(kuò)增。第59頁(yè)/共93頁(yè)(2)病毒-質(zhì)粒重組型基因載體

一類穿梭載體例如：由大T抗原、復(fù)制子和pBR322構(gòu)成pAC10載體。在細(xì)菌中擴(kuò)增提取基因重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染小鼠細(xì)胞5-6天后可高拷貝擴(kuò)增并高效表達(dá)基因產(chǎn)物。微型病毒復(fù)制子-質(zhì)粒載體，可用特殊細(xì)胞來克隆和表達(dá)相當(dāng)于植物的一元載體；第60頁(yè)/共93頁(yè)第61頁(yè)/共93頁(yè)其他動(dòng)物病毒載體系統(tǒng)-自學(xué)逆轉(zhuǎn)錄病毒基因載體腺病毒基因載體痘苗病毒基因載體桿狀病毒表達(dá)載體詳見P135第62頁(yè)/共93頁(yè)第3節(jié)染色體定位整合載體《基因工程》龍敏南第二版P120

樓士林第一版P138第63頁(yè)/共93頁(yè)質(zhì)粒與病毒克隆載體的不足：1、游離于染色體之外的外源DNA分子能多拷貝復(fù)制，但易丟失，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因生物的不穩(wěn)定性2、隨機(jī)插入染色體的外源DNA片段能穩(wěn)定維持，但因插入的位點(diǎn)不確定，可能干擾受體細(xì)胞基因組的自穩(wěn)系統(tǒng)，導(dǎo)致有害突變，造成選育轉(zhuǎn)基因生物不可知性，增加難度設(shè)計(jì)背景（染色體定位整合載體）第64頁(yè)/共93頁(yè)染色體定位整合平臺(tái)系統(tǒng)(geneintegrationplatformsystem)整合平臺(tái)：外源DNA整合位置,即受體細(xì)胞基因組上給定的DNA區(qū)域定位整合載體:除含有一般質(zhì)粒必備元件外，具有一個(gè)或兩個(gè)與整合平臺(tái)DNA區(qū)域同源的DNA片段（長(zhǎng)度最好＞1kb）第65頁(yè)/共93頁(yè)基因打靶(genetargeting)基因定點(diǎn)同源重組(site-specifichomologusrecombination)第66頁(yè)/共93頁(yè)定位整合克隆載體的幾種模式:(1)內(nèi)源平臺(tái)雙交換置換克隆載體(2)外源平臺(tái)雙交換置換克隆載體(3)內(nèi)源平臺(tái)雙交換插入克隆載體(4)內(nèi)源平臺(tái)單交換插入克隆載體第67頁(yè)/共93頁(yè)

一、定位整合克隆載體的幾種模式（一）內(nèi)源平臺(tái)雙交換置換克隆載體第68頁(yè)/共93頁(yè)（二）外源平臺(tái)雙交換置換克隆載體第69頁(yè)/共93頁(yè)（三）內(nèi)源平臺(tái)雙交換插入克隆載體第70頁(yè)/共93頁(yè)（四）內(nèi)源平臺(tái)單交換插入克隆載體第71頁(yè)/共93頁(yè)定位整合效率與受體細(xì)胞的種屬和同源DNA片段的長(zhǎng)短有關(guān)整合效率偏低，有待改進(jìn)第72頁(yè)/共93頁(yè)第4節(jié)人工染色體克隆載體artificialchromosome《基因工程》龍敏南第二版P142

樓士林第一版P146第73頁(yè)/共93頁(yè)大片段克隆載體

顯著特點(diǎn)：載體的容載能力擴(kuò)大,約100～350kb

,主要有:酵母人工染色（YAC)

細(xì)菌人工染色體（BAC)

源于噬菌體P1

的染色體（PAC)

哺乳動(dòng)物人工染色體（MAC）人類游離人工染色體（HAEC）第74頁(yè)/共93頁(yè)酵母人工染色體(

YAC)YAC載體的復(fù)制元件是其核心組成成分:大腸桿菌中復(fù)制起始位點(diǎn)(ori)其在酵母中復(fù)制的必需元件包括復(fù)制起點(diǎn)序列即自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）用于有絲分裂和減數(shù)分裂功能的著絲粒（centromere,CEN）兩個(gè)端粒（TEL）篩選主要是營(yíng)養(yǎng)缺陷型第75頁(yè)/共93頁(yè)第76頁(yè)/共93頁(yè)YAC

載體的突出特點(diǎn):容載能力大動(dòng)物的YAC

文庫(kù)平均插入長(zhǎng)度達(dá)900～2000kb植物YAC文庫(kù)平均插入片段一般為100～350kb

構(gòu)建基因組文庫(kù)時(shí),只需要較少的克隆數(shù)便可以覆蓋整個(gè)基因組,使構(gòu)建高等生物基因組遺傳圖譜和物理圖譜成為可能,基因組計(jì)劃得以順利實(shí)施。

第77頁(yè)/共93頁(yè)缺點(diǎn):

1)克隆外源基因存在嵌合現(xiàn)象(chimerism)2)有些YAC

克隆的穩(wěn)定性差3)插入片段的分離和純化困難，YAC克隆不容易與酵母自身染色體相分離4)轉(zhuǎn)化效率低

第78頁(yè)/共93頁(yè)酵母人工染色體的應(yīng)用領(lǐng)域在染色體區(qū)帶構(gòu)建YAC重疊群，可以促進(jìn)大規(guī)模基因組測(cè)序和致病基因的克隆。第79頁(yè)/共93頁(yè)第80頁(yè)/共93頁(yè)細(xì)菌人工染色體(

BAC)在大腸桿菌F

因子的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的,其復(fù)制是嚴(yán)謹(jǐn)型的,在每個(gè)細(xì)胞中僅有1～2

個(gè)拷貝,減小了插入片段發(fā)生重組的機(jī)率人工構(gòu)建的BAC較小（如pBeloBAC11僅有7.4kb，保留了與F因子的自主復(fù)制、拷貝數(shù)控制及質(zhì)粒分配等功能相關(guān)基因）克隆能力可達(dá)300kb以上，遠(yuǎn)大于柯斯質(zhì)粒，但小于YAC篩選通過抗性、藍(lán)白斑等第81頁(yè)/共93頁(yè)BAC

載體的容載能力一般為100～350kb

(1)轉(zhuǎn)化率高(2)提取質(zhì)粒較方便(3)嵌合及重組現(xiàn)象少(4)篩選目的基因,方便快捷(5)T7

和Sp6

聚合酶啟動(dòng)子,可以用于轉(zhuǎn)錄獲得RNA

探針或直接用于插入片段的末端測(cè)序第82頁(yè)/共93頁(yè)六倍體小麥小偃54的BAC文庫(kù)情況第83頁(yè)/共93頁(yè)小偃54的BAC文庫(kù)剛建成時(shí)有937,920個(gè)克隆，約覆蓋基因組5倍。BAC文庫(kù)共有三級(jí)：一級(jí)庫(kù)：

488塊板每個(gè)板有384個(gè)孔每個(gè)孔里有5個(gè)克隆二級(jí)庫(kù)：

243塊板每個(gè)板是96孔每個(gè)孔里有5×8=40個(gè)克隆三級(jí)庫(kù)：保存在1,954個(gè)1.5ml的離心管中，每個(gè)離心管中有5×8×12=480個(gè)克?。?/p>

三級(jí)庫(kù)同時(shí)配備有質(zhì)粒DNA，以便于篩庫(kù)。目前三級(jí)庫(kù)可用的大約有20個(gè)96孔板，即20×96=1920個(gè)克隆第84頁(yè)/共93頁(yè)P(yáng)1派生人工染色體（PAC）P1噬菌體載體是在P1噬菌體的基礎(chǔ)上構(gòu)建的克隆載體，用于克隆真核基因組DNA。P1派生人工染色體（PAC)是將BAC和P1噬菌體載體二者優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來的克隆體系，可以克隆100-300kb的外源DNA片段。特點(diǎn)1）含有卡那霉素抗性基因，便于篩選。2）其在宿主細(xì)胞中以單拷貝的形式存在，避免了因多拷貝造成的不穩(wěn)定。第85頁(yè)/共93頁(yè)P(yáng)AC載體第86頁(yè)/共93頁(yè)哺乳動(dòng)物人工染色體（MAC）從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離出復(fù)制起始區(qū)、端粒以及著絲粒構(gòu)建而成的克隆載體。它可以克隆大于1000kb的外源DNA片段。應(yīng)用領(lǐng)域1）有絲分裂和減數(shù)分裂對(duì)DNA片段大小的定量分析。2）研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞中染色體功能。3）對(duì)復(fù)雜的基因做功能分析。4）用于體細(xì)胞基因治