基因工程基本操作的四個步驟第1頁/共16頁基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構建3、將目的基因導入受體細胞4、目的基因的檢測與鑒定第2頁/共16頁第3頁/共16頁一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質的結構基因2、獲取目的基因的常用方法有哪些?（1）從基因文庫中獲?。?）利用PCR技術擴增（3）人工合成請閱讀P9第一和二兩段第4頁/共16頁(一)從基因文庫中獲取目的基因

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫基因文庫

基因組文庫（某物種全部基因

）部分基因文庫（如:cDNA文庫）1.基因文庫第5頁/共16頁2.基因文庫的構建方法與目的基因的獲得①鳥槍法：供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶與載體連接載入受體細胞（基因組文庫）

產生特定性狀導入外源DNA擴增目的基因分離(直接分離法)(一)從基因文庫中獲取目的基因第6頁/共16頁②反轉錄法：

以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA雜交雙鏈(單鏈RNA/單鏈DNA)單鏈DNA反轉錄酶核酸酶H2.基因文庫的構建方法與目的基因的獲得DNA聚合酶雙鏈DNA(目的基因)（cDNA文庫）第7頁/共16頁③根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：

根據(jù)已知蛋白質的氨基酸序列，推測出相應的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結構基因的核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成2.基因文庫的構建方法與目的基因的獲得第8頁/共16頁上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點？優(yōu)點缺點鳥槍法反轉錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來的有時并非一個基因專一性強操作過程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術條件較高專一性最強僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因思考:為什么要構建基因文庫?直接從含有目的基因的生物體內提取不行嗎?第9頁/共16頁PCR技術—聚合酶鏈式反應概念：原理：前提：PCR擴增儀DNA雙鏈復制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術第10頁/共16頁四種脫氧核苷酸dNTP一對引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(含有目的基因)溫度控制條件：④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）⑤結果：使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增指數(shù)2n第11頁/共16頁⑥過程：a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第12頁/共16頁第13頁/共16頁利用PCR技術擴增目的基因第14頁/共16頁①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術③條件：_______________________、

_______________、___________(做啟動子)、___________.前提條件：②原理：__________④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）⑤結果：選修1P60多聚酶鏈式反應體外特定DNA片段DNA雙鏈復制已知基因的核苷酸序列四種