熒光原位雜交技術（fluorescenceinsituHybridization,FISH）當前1頁，總共25頁。定義：熒光原位雜交技術（fluorescenceinsituHybridization,FISH）是一種非放射性原位雜交方法，用特殊的熒光素標記DNA探針，在染色體、細胞或組織切片標本上進行DNA雜交，以檢測細胞內(nèi)DNA或RNA特定序列存在與否。當前2頁，總共25頁。FISH的基本原理用已知的標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而探針可以直接與染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。當前3頁，總共25頁。雜交所用的探針大致可以分類三類：1）染色體特異重復序列探針，例如α衛(wèi)星、衛(wèi)星III類的探針，其雜交靶位常大于1Mb，不含散在重復序列，與靶位結(jié)合緊密，雜交信號強，易于檢測；2）全染色體或染色體區(qū)域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一區(qū)段上極端不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質(zhì)粒中的染色體特異大片段獲得；3）特異性位置探針，由一個或幾個克隆序列組成。當前4頁，總共25頁。探針的熒光素標記方法：間接標記法：是采用生物素標記DNA探針，雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進行檢測，同時還可以利用親和素-生物素-熒光素復合物，將熒光信號進行放大，從而可以檢測500bp的片段。直接標記法：是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價結(jié)合，或在缺口平移法標記探針時將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標記法在檢測時步驟簡單，但由于不能進行信號放大，因此靈敏度不如間接標記的方法。當前5頁，總共25頁。當前6頁，總共25頁。應用范圍：FISH檢測對被測樣本沒有特殊的要求。骨髓的細胞羊水的細胞冰凍切片的樣本，石蠟包埋的樣本尿液樣本（獲取的樣本細胞也無需經(jīng)過培養(yǎng)擴增，F(xiàn)ISH檢測可以顯示單個細胞核內(nèi)）當前7頁，總共25頁。實驗步驟試劑準備脫蠟蛋白酶處理變性雜交細胞核染色當前8頁，總共25頁。試劑準備：（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀釋而成，儲存于4℃；（2）20×SSC（pH7.0）：175.3g

NaCl，88.2g檸檬酸鈉，加水至1000mL（用10mol/L

NaOH調(diào)pH

至7.0）（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀釋而成；（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。（5）變性液(70％甲酰胺2×SSC，pH7.0)：4ml20×SSC；8ml蒸餾水；28ml甲酰胺。每次新鮮配制。（6）雜交后洗滌液：20×SSC4ml；蒸餾水16ml；甲酰胺20ml。每次新鮮配制。調(diào)節(jié)pH前升至室溫。當前9頁，總共25頁。脫蠟（1）二甲苯脫蠟3次，每次5min；（2）100％酒精兩次，每次2min；（3）移出酒精，斜置切片，標記末段向下，空氣干燥。當前10頁，總共25頁。蛋白酶處理（1）每個染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC40ml倒入Facal管，在水浴槽中預熱。將消化酶液加入管內(nèi)，搖動直到酶溶解。（2）37℃水浴槽中預熱染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。（3）2×SSC在室溫下漂洗切片3次，每次1min。（4）梯度(70%、90%、100%)酒精脫水（-20℃預冷），空氣中干燥。當前11頁，總共25頁。變性（1）每一個立式染色缸配制40ml變性溶液；（2）78℃水浴槽中平衡預熱混合液染色缸；（3）78℃孵育8min；（4）即移入-20℃預冷70%酒精的染色缸內(nèi)2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃預冷酒精內(nèi)，每缸2min；（5）空氣干燥。當前12頁，總共25頁。雜交（1）準備探針；（2）取一個較大的濕盒，交叉放置切片；（3）滴10μl探針在切片的組織上，加蓋玻片；（4）蓋上濕盒蓋，37℃孵育12~16h。當前13頁，總共25頁。雜交雜交后水洗：（5）鑷子小心去除蓋玻片；（6）43℃預熱雜交后水洗溶液40ml水洗切片15min；（7）2×SSC（37℃）洗兩次，每次10min；（8）切片放人染色缸的1×PBS內(nèi)待檢測，勿使切片干燥。當前14頁，總共25頁。雜交（9）從1×PBS中取出切片，除去過多的水分，避免標本干燥。把切片放入濕盒內(nèi)，同時處理4張切片。（10）每張切片使用30~60μl羅丹明抗-地高辛抗體（抗地高辛單克隆抗體）或FITC卵白素，室溫下孵育20min；（11）去掉塑料蓋膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min。當前15頁，總共25頁。雜交（12）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；（13）每張切片滴30~60μl抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min；（14）去掉塑料蓋膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min；（15）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；（16）每張切片滴30~60μl抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min；（17）1×PBS室溫下洗3次，每次2min。當前16頁，總共25頁。細胞核染色（1）每張切片加10~20μlDAPI，覆蓋蓋玻片并在室溫下孵育2~5min；（2）盡可能快的在熒光顯微鏡下觀察或封閉盒內(nèi)保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h內(nèi)可以在顯微鏡下觀察。當前17頁，總共25頁。熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果先在可見光源下找到具有細胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源，F(xiàn)ITC的激發(fā)波長為490nm。細胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標記的探針所在的位置發(fā)出綠色熒光。當前18頁，總共25頁。檢驗儀器1、流式細胞儀2、熒光顯微鏡3、共聚焦當前19頁，總共25頁。單一染色當前20頁，總共25頁。多重染色當前21頁，總共25頁。光色波長λ（nm）代表波長：紅（Red）630~780、700橙（Orange）600~630、620黃（Yellow）570~600、580綠（Green）500~570、550青（Cyan）470~500、500藍（Blue）420~470、470紫（Violet）380~420、420=當前22頁，總共25頁。優(yōu)點：操作簡便，一步式反應，能迅速得到結(jié)果，一次標記后可使用二年。方法敏感，敏感程度等同甚至超過放射性同位素原位雜交。在同一標本上，可同時應用幾種不同探針，標記不同的顏色?？捎糜诜至鸭毎挽o止期細胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究。當前23頁，總共25頁。技術延伸：熒光原位雜交技術可以傳統(tǒng)技術完美結(jié)合：1、FISH和細胞免疫化學技術結(jié)合，可以同時用多種不同顏色標記不同的核苷酸鏈和蛋白質(zhì)，這樣可以在單個細胞內(nèi)同時找到基因的位點，轉(zhuǎn)錄和翻譯的產(chǎn)物，有助了解核苷酸結(jié)構功能以及與蛋白質(zhì)表達之間的關系。2、FISH技術和RFLE（RESTRICTFRAGMENTLENTHPOLYMORPHSIM）結(jié)合，可以精確地描述染色體長，短臂等結(jié)構改變和染色體核型或復雜片段的性質(zhì)。在基因圖譜繪制中，F(xiàn)ISH和Linkagemapping結(jié)合起來即使對具有高度多形態(tài)的基因位點也能較精確地確定下來。當前24頁，總共25頁。引用文獻[1]YanYang,DavidS,Geldmacher,etal.DNAReplicationPrecedesNeuronalCellDeathinAlzheimer’sDisease[J].TheJournalofNeuroscience,2001,21(8):2661–2668[2]BirgitMosch,M