電泳技術(shù)及其在分子生物學(xué)中的應(yīng)用第一頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日電泳是帶電荷的膠體顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)。

凈電荷：生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒形式分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介質(zhì)的H+濃度與其他大分子的相互作用。在電場(chǎng)中，帶電顆粒向陰極或陽(yáng)極遷移，遷移的方向取決于它們帶電的符號(hào)。電泳的實(shí)現(xiàn)還依賴于支持介質(zhì)的存在。電泳的三要素第二頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日

以淀粉膠、瓊脂或瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳法稱為凝膠電泳。瓊脂糖凝膠電泳

（agrosegelelectrophoresis）聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）凝膠電泳用于分離、鑒定和純化DNA片段第三頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日重點(diǎn)內(nèi)容影響DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速率的因素有哪些？Westernblotting的基本實(shí)驗(yàn)步驟,及每一步的操作意義.第四頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日瓊脂糖凝膠電泳第五頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日

瓊脂糖（agarose）是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。其結(jié)構(gòu)單元是D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成直徑從50nm到略大于200nm的三維篩孔的通道。

第六頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日凝膠的制備

以瓊脂糖為溶質(zhì)，電泳緩沖液為溶劑，用微波爐加熱，配制一定濃度的溶膠，灌入水平膠框，插入梳子，自然冷卻。第七頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日第八頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日緩沖液系統(tǒng)

常用的電泳緩沖液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。

第九頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日含不同量瓊脂糖的凝膠的分離范圍

凝膠中的瓊脂糖含量[%（w/v）]線狀DNA分子的有效分離范圍（kb）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2瓊脂糖濃度的選擇：根據(jù)被分離線狀DNA片斷的大小第十頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日樣品配制與加樣

DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內(nèi)含有0.25%溴酚藍(lán)或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使樣品集中。第十一頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日

電泳

低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。因此，為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，所用電壓不宜高于5V/cm。cm：電場(chǎng)正負(fù)極間的距離。

第十二頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日染色和拍照

常用熒光染料溴化乙錠（EB）染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片，并進(jìn)行有關(guān)的數(shù)據(jù)分析。

第十三頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日瓊脂糖凝膠中DNA的染色熒光染料溴化乙錠（EB）含有一個(gè)可以嵌入DNA或RNA的堆砌堿基之間的一個(gè)平面基團(tuán)與核酸結(jié)合后在紫外線激發(fā)下呈現(xiàn)橘黃色熒光，熒光的位置代表核酸片段所在的位置，熒光的強(qiáng)弱代表核酸量的多少,可以檢測(cè)到少至10ng的DNA條帶?？捎糜跈z測(cè)單鏈或雙鏈核酸（DNA和RNA）。

第十四頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知DNA片段在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得其分子量。第十五頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日雙鏈DNA分子在凝膠基質(zhì)遷移的速率與堿基對(duì)數(shù)目的常用對(duì)數(shù)成反比。雙鏈DNA分子在凝膠中的遷移率第十六頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日影響DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速率的因素DNA分子的大小瓊脂糖濃度；DNA的構(gòu)象：超螺旋環(huán)狀（I型）、切口環(huán)狀（II型）和線狀（III型）；共價(jià)閉環(huán)DNA＞直線DNA＞開環(huán)雙鏈DNA。當(dāng)凝膠濃度太高時(shí)，凝膠孔徑變小，環(huán)狀DNA（球形）不能進(jìn)入膠中，相對(duì)遷移率為0，而同等大小的直線DNA（剛性棒狀）可以按長(zhǎng)軸方向前移，相對(duì)遷移率大于0。第十七頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠;所用的電壓：低電壓時(shí)，DNA片段遷移率與所用的電壓成正比；電場(chǎng)強(qiáng)度升高時(shí)，高分子質(zhì)量片段的遷移率遂不成比例的增加；電泳緩沖液：組成和離子強(qiáng)度。第十八頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日聚丙烯酰胺凝膠第十九頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和

過(guò)硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長(zhǎng)鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，N，N'一亞甲雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠.第二十頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日

與瓊脂糖凝膠電泳的比較,PAGE的特點(diǎn)分辨率很強(qiáng)，長(zhǎng)度上相差1bp的DNA即可分開；從聚丙烯酰胺凝膠中回收的DNA純度很高，可適用于要求最高的實(shí)驗(yàn)（如胚胎注射）；裝載更多的DNA量；最適合分離小片段DNA(5-500bp),可以分離蛋白質(zhì);聚丙烯酰胺凝膠一律進(jìn)行垂直電泳.第二十一頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日第二十二頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日假如DNA順序中的某個(gè)堿基發(fā)生了突變，使突變所在部位的DNA序列產(chǎn)生（或缺失）某種限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)。這樣，利用該限制性內(nèi)切酶消化此DNA時(shí)，便會(huì)產(chǎn)生與正常不同的限制性片段。這樣，在同種生物的不同個(gè)體中會(huì)出現(xiàn)不同長(zhǎng)度的限制性片段類型，即限制性片段多態(tài)性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)。限制性片段多態(tài)性(RFLP)第二十三頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日點(diǎn)多態(tài)性實(shí)驗(yàn)方法1.DNA的提取2.PCR3.限制性內(nèi)切酶酶解4.聚丙烯酰胺凝膠電泳分離5.染色第二十四頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日第二十五頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日第二十六頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日第二十七頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）的原理第二十八頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉），SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)，在強(qiáng)還原劑（beta-巰基乙醇）作用下，使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂。蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合(多肽和SDS的質(zhì)量比為1:1.4)，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而消除了不同分子之間原有的電荷差異。第二十九頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日

蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的形狀近似于長(zhǎng)的橢圓棒，它們的短軸是恒定的，而長(zhǎng)軸與蛋白質(zhì)分子量的大小成比例。因此，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度，即蛋白質(zhì)亞基分子量的大小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。第三十頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日特點(diǎn)大多在不連續(xù)緩沖體系中進(jìn)行，其電泳槽緩沖液的pH值與離子強(qiáng)度不同于配膠緩沖液；不連續(xù)緩沖體系具有把樣品中的復(fù)合物全部濃縮于極小體積的能力，故提高了SDS的分辨力；系統(tǒng)中所有組分都含有0.1%的SDS。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）第三十一頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日負(fù)極積層膠分離膠加樣孔正極第三十二頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日配置積層膠分離膠丙烯酰胺濃度5%10-15%Tris-HCl1M，PH=6.81.5M，PH=8.8SDS，過(guò)硫酸銨，TEMED濃度相同電泳積層膠分離膠電壓80V120VTris-HCl-甘氨酸電泳緩沖液(pH8.3)在凝膠中的電離情況甘氨酸→帶負(fù)電的蛋白質(zhì)亞基→Cl-帶負(fù)電的蛋白質(zhì)亞基→甘氨酸-→Cl-被分離蛋白質(zhì)亞基的電離情況蛋白質(zhì)亞基由于甘氨酸的擠壓作用，在積層膠不被分離，而是被濃縮為最小體積蛋白質(zhì)亞基在分離膠根據(jù)分子量的大小被分離第三十三頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日

考馬斯亮藍(lán)染色(0.1-1.0ug的多肽)第三十四頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日One-DimensionalSDS第三十五頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日IsoelectricFocusing(IEF)第三十六頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日

等電聚焦電泳的過(guò)程電泳時(shí)可將樣品置于凝膠的任何位置；初始位置在負(fù)極時(shí)，因pH＞pI，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電，電泳時(shí)向正極移動(dòng)；移動(dòng)過(guò)程中，pH逐漸下降，所帶負(fù)電荷量逐漸減少，蛋白質(zhì)移動(dòng)速度減慢；當(dāng)移動(dòng)到pH=pI時(shí)，蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零，蛋白質(zhì)即停止移動(dòng)；各種不同蛋白質(zhì)在電泳結(jié)束后，會(huì)分別聚集于相應(yīng)的等電點(diǎn)位置，形成一個(gè)很窄的區(qū)帶；區(qū)帶的位置是由pH梯度的分布和蛋白質(zhì)的pI所決定，而與蛋白質(zhì)分子的大小和形狀無(wú)關(guān)。第三十七頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日Two-DimensionalSDS第三十八頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日PI(byisoelectricfocusing–IEF)Approximatemolwt.(bySDSPAGE)Exampleof2D-GelSeparationofProteins

2Dgelsareidealtoolsofproteinseparationbecauseoftheirhighresolution(>1000spotsarecommonlyvisualizedonasinglegel)andvisualreadout第三十九頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日Westernblotting第四十頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。第四十一頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日第四十二頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法.對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法;對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法.第四十三頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日WesternBlotting基本原理

在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來(lái)檢測(cè)。第四十四頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日1）蛋白提取2）SDS3）轉(zhuǎn)膜4）封閉5）一抗作用6）標(biāo)記二抗作用7）結(jié)果檢測(cè)Westernblotting基本步驟：第四十五頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日轉(zhuǎn)膜將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤(rùn)濾紙之間。

正極三層濾紙硝酸纖維素濾膜凝膠三層濾紙負(fù)級(jí)

第四十六頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)

麗春紅S染色預(yù)染蛋白marker

考馬斯亮藍(lán)染色第四十七頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日封閉:膜上的空白位點(diǎn)脫脂奶粉（5％）BSA(牛血清白蛋白)第四十八頁(yè)，共五十三頁(yè)，2022年，8月28日一抗、標(biāo)記二抗孵育把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液與濾膜溫育，4℃