野菊花總黃酮提取工藝的研究摘要：采用超聲輔助法提取野菊花中總黃酮，通過單因素分析和正交分析實(shí)驗(yàn)確定野菊花總黃酮的最佳提取工藝條件。結(jié)果表明：野菊花中總黃酮的最佳條件是料液比1:20，60%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇濃度，提取溫度70℃，提取功率60w，提取時(shí)間50min。野菊花(學(xué)名:Dendranthemaindicum)是菊科的一種多年生草本植物，野菊花的花和菊花相似呈棕黃色，其葉、花及全草入藥。根據(jù)野菊花的化學(xué)成分研究表明，野菊花中主要含有豐富的揮發(fā)油類物質(zhì)，萜類物質(zhì)，有機(jī)酸，黃酮類物質(zhì)及其他成分。傳統(tǒng)的提取方法和大部分中藥提取類似，有水蒸氣蒸餾法，超聲輔助提取法，微波提取法和加熱回流提取法等。大部分成分由于其物理性質(zhì)決定其加熱不穩(wěn)定，在加熱或者濃縮過程中易于揮發(fā)或降解，損失許多有效成分。采用傳統(tǒng)方法無可避免消耗大量溶劑，提取效率低下，污染環(huán)境，能耗大等的通病。因此，亟待發(fā)現(xiàn)一種新的，高效的，穩(wěn)定環(huán)保的提取與方法。黃酮類化合物，它在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、開花、結(jié)果以及抗菌防病等方面起著重要的作用。黃酮類包括木樨草素、刺槐素、蒙花苷、芹菜素、金合歡素、槲皮素、異澤蘭素等成分[1.2.3.4]。目前提取植物體重總黃酮常見的方法有溶劑浸提法，酶輔助提取法和超聲輔助提取法，超聲輔助提取法因具有簡(jiǎn)單、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注［5］。單科開［6］等人以干苦菜為原料，采用超聲波－乙醇提取法提取苦菜總黃酮，通過響應(yīng)面法對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，在優(yōu)化后的工藝條件下，苦菜總黃酮理論得率為3.71%。本實(shí)驗(yàn)以野菊花為原材料，采用超聲輔助法提取野菊花中總的黃酮，并優(yōu)化提取工藝條件。1材料與儀器1.1材料與試劑野菊花：購自中國藥品生物制品檢定所，貨號(hào)120995，批號(hào)：120995-201707，本品為菊科植物野菊ChrysanthemumindicumL.干燥頭狀花序的粉末，系供中國藥典2015版一部野菊花，野菊花栓。西林瓶1G/支蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：100080中國藥品生物制品檢定所氫氧化鈉：R015000氫氧化鈉,AR,96%羅恩試劑亞硝酸鈉，95%乙醇，硝酸鋁，石油醚等 1.2主要儀器電子天平：JA1003N,上海精密科學(xué)儀器有限公司高速粉碎機(jī)：AF-04A溫嶺市奧力中藥機(jī)械有限公司鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9015A上海一恒科學(xué)儀器有限公司真空抽濾裝置，布什漏斗，抽濾瓶，燒瓶，試管，移液器：津騰烘箱：PH-010(A)上海一恒科學(xué)儀器有限公司循環(huán)水式真空泵：SHZ-DⅢ上海力辰儀器科技有限公司可見光分光光度計(jì)：V-1200B上海美譜達(dá)儀器有限公司超聲波清洗儀：HU10260D 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司索氏提取儀：上海精密儀器儀表有限公司SXT系列離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司型號(hào)：L535-12方法2.1野菊花預(yù)處理工藝野菊花→脫脂脫色（先在石油醚中浸泡）→抽濾→烘箱干燥（50℃）→避光保存?zhèn)溆?.2野菊花總黃酮的提取2.2.1工藝流程野菊花→烘干→磨碎→脫色（索氏提取法，石油醚脫色）→提取→過濾→定容→離心→總黃酮提取液。2.2.2具體實(shí)驗(yàn)過程具體實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取1.0000g野菊花樣品5份于燒杯中，加入一定濃度的乙醇溶液若干毫升，于一定超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率的條件下超聲輔助提取，過濾，定容，離心，將上清液吸取1mL，定容至5mL，搖勻，然后吸取0.5mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min，加4%氫氧化鈉4mL，加50%乙醇至刻度，搖勻，放置15min，測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算出黃酮含量，并計(jì)算總黃酮得率。2.3樣品液的制備將野菊花粉末用索氏提取方法進(jìn)行脫色。稱取脫色后的野菊花粉末1g，以50%的乙醇水溶液為提取劑，超聲輔助提取，得提取液過濾后定容，在2000r/min的轉(zhuǎn)速下離心20min，取上清液，得待測(cè)樣品。2.4蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制根據(jù)文獻(xiàn)[6]：先用70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液配制0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，再準(zhǔn)確吸取0.0,0.6,1.2,1.8,2.4,3.0mL,0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于比色管中，用70%乙醇溶液定容，搖勻備用。吸取1.0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL的比色管中，加入0.3ml的5%（體積分?jǐn)?shù)）亞硝酸鈉溶液搖勻，靜止6min，隨后加入0.3mL的10%（體積分?jǐn)?shù)）的硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6min，再加入4.0mL的4%（體積分?jǐn)?shù)）的氫氧化鈉溶液，然后用70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液定容至10mL，搖勻后放置反應(yīng)15min，以70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液作為空白對(duì)照，于510nm處測(cè)定溶液吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=11.35×C-0.1037，R2=0.9987,說明在此濃度范圍內(nèi)，吸光度與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的濃度具有較好的線性關(guān)系。2.5提取物的指標(biāo)控制根據(jù)前期研究，初步確定野菊花的有效部位是其非極性部位，但是缺少有效成分指標(biāo)，本次以提取率作為指標(biāo)來研究其工藝參數(shù)的影響。按照L16（45）正交表設(shè)計(jì)優(yōu)化方案，通過計(jì)算公式計(jì)算出各方案中野菊花非極性部位提取物的提取率。料液比：取1.0000g野菊花粉末,按照不同料液比1:15（g/mL）,1:20,1:25,1:30與50%乙醇混合，提取功率30W，40℃下超聲提取30min乙醇濃度：取1.0000g野菊花粉末,按照料液比1：15（g/mL）分別與50%，60%，70%，80%的乙醇混合，提取功率30W，在60℃下超聲提取30min，分析乙醇濃度對(duì)野菊花中總黃酮提取率的影響提取溫度：取1.0000g野菊花粉末，按照料液比1：15（g/mL）與50%乙醇混合，提取功率30W，分別在40℃，50℃，60℃，70℃下超聲提取30min，分析溫度對(duì)野菊花中總黃酮提取率的影響提取功率：取1.0000g野菊花粉末，按照料液比1：15（g/mL）與50%乙醇混合，提取功率分別是30w，40w，50w，60w，在60℃下超聲提取30min，分析提取功率對(duì)野菊花中總黃酮提取率的影響提取時(shí)間：取1.0000g野菊花粉末，按照料液比1：15（g/mL）與50%乙醇混合，取功率30w，60℃超聲提取時(shí)間分別是30min，40min，50min，60min，分析超聲提取時(shí)間對(duì)野菊花中總黃酮提取率的影響根據(jù)影響CO2超聲輔助提取的因素，選取料液比（A）乙醇濃度（B）,提取溫度（C），提取功率（D）,提取時(shí)間（E）,作為實(shí)驗(yàn)依據(jù)，設(shè)置四個(gè)水平條件，以總黃酮為指標(biāo)，選用L16（45）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，各因素水平條件見表1表1因素水平條件表水平條件料液比A因素B乙醇濃度因素C提取溫度/℃因素D提取功率/W因素E提取時(shí)間/Min11:1550%40303021:2060%50404031:2570%60505041:3080%7060602.6野菊花中總黃酮得率的測(cè)定吸取1ML的待測(cè)樣品，定容至5ML，充分搖勻，吸取0.5ml，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3ML，搖勻，靜置6min，加入0.3ml的10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6min，加入4%氫氧化鈉4ml，加50%乙醇至刻度線，搖勻，靜置15min，測(cè)其吸光度，帶入回歸方程式算出黃酮含量，并計(jì)算總黃酮得率。3.結(jié)果與分析3.1料液比對(duì)野菊花中總黃酮提取率的影響當(dāng)料液比（g/mL）分別為：1:15、1:20、1:25、1:30時(shí)，提取率為7.531%、7.953%、7.135%、7.101%。由結(jié)果可知，野菊花中總黃酮的提取率隨料液比的增加而增大。當(dāng)料液比大于1:20后，黃酮提取率逐漸下降，這是因?yàn)槿軇┯昧吭龃髸r(shí)，溶劑中的有效成分濃度低，與物料及溶劑邊界層的有效成分濃度差大，擴(kuò)散推動(dòng)力大，因而提取率高。從提取效果、減少溶劑用量等方面綜合考慮，溶劑用量不宜過大，因此選擇料液比為1:20。3.2乙醇濃度對(duì)野菊花總黃酮提取率的影響當(dāng)乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%時(shí)提取率為7.943%、8.019%、8.179%、7.858%。由結(jié)果可知，隨著乙醇濃度的增大，黃酮類化合物提取率也隨著增大，但當(dāng)乙醇濃度較高時(shí)脂溶性物質(zhì)溶出量也增大，從而導(dǎo)致提取率的降低。同時(shí)干擾因素隨之增多，給后續(xù)的提純帶來困難，因此確定乙醇濃度為60%為宜。3.3超聲溫度對(duì)野菊花總黃酮提取率的影響當(dāng)超聲溫度分別為40℃、50℃、60℃、70℃時(shí)提取率為7.837%、8.196%、8.252%、7.847%。由結(jié)果可知，隨著超聲溫度的升高總黃酮提取率增長(zhǎng)，溫度超過60℃，提取率降低。溫度過高，一方面其中的活性成分會(huì)受到破壞，雜質(zhì)的溶出量增加。給后續(xù)的操作帶來不便，成本費(fèi)用增加；另一方面也會(huì)造成溶劑損失。綜合以上兩方面的因索，提取時(shí)適宜的溫度應(yīng)定為60℃。3.4提取功率對(duì)野菊花總黃酮提取率的影響當(dāng)超聲功率從30w、40w、50w、60w時(shí)，提取率為7.121%、7.426%、7.537%、7.544%。由結(jié)果可知，隨著超聲功率的升高總黃酮提取率增長(zhǎng)，且對(duì)提取率的影響不大，節(jié)能考慮選擇超聲功率60w。3.5超聲時(shí)間對(duì)野菊花總黃酮提取率的影響當(dāng)超聲時(shí)間分別為30、40、50、60min時(shí)提取率為7.164%、7.436、7.812%、7.445%。由結(jié)果可知，總黃酮的提取率隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)而增高，當(dāng)提取時(shí)間大于50min，提取率下降，結(jié)合提取率和時(shí)間，選擇最佳提取時(shí)間為50min。3.6正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表2正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表水平A料液比B乙醇濃度C提取溫度/℃D提取功率/w提取時(shí)間/min11:1550%40303021:2060%50404031:2570%60505041:3080%706060表3正交實(shí)驗(yàn)分析表表4方差分析結(jié)果由表3表4結(jié)果分析，得出如下結(jié)論：影響總黃酮提取率的主次關(guān)系是A＞C＞E＞D＞B。方差分析表明，A（料液比）對(duì)野菊花總黃酮提取率的影響具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為主要因素，其余影響為次要因素。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，最佳組合是A2B2C4D4E3,即超聲波輔助提取野菊花總黃酮的最佳條件是料液比1:20，60%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇濃度，提取溫度70℃，提取功率60w，提取時(shí)間50min。3.8驗(yàn)證試驗(yàn)為了進(jìn)一步考察上述優(yōu)選工藝的穩(wěn)定性，按上述的最佳條件：料液比1:20，60%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇濃度，提取溫度70℃，提取功率60w，提取時(shí)間50min，進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)。紫外分光光度法測(cè)定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其提取率，結(jié)果總黃酮提取率可達(dá)到8.013%，說明此工藝有一定的可行性。用超聲輔助提取野菊花中黃酮的最佳工藝條件為料液比1:20，60%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇濃度，提取溫度70℃，提取功率60w，提取時(shí)間50min。超聲技術(shù)應(yīng)用能提高有效成分的溶出速度、縮短提取時(shí)間、節(jié)省溶劑的消耗、提高提取率。3．討論超聲波是指頻率高于2*104HZ的聲波,屬機(jī)械波的一種,由于超越了人類聽覺的上限,故稱為超聲波。超聲化學(xué)是聲學(xué)和化學(xué)相互交叉滲透的一門新的學(xué)科,作為一門邊緣性交叉學(xué)科,年代以來發(fā)展十分迅猛。隨著功率超聲波理論研究的深入和儀器設(shè)備制造技術(shù)的日趨完善,超聲化學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)和食品加工、化工、醫(yī)療、生物工程等許多領(lǐng)域[7-13]超聲輔助提取技術(shù)室利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的溶出，另外超聲波的次級(jí)效應(yīng)，如機(jī)械振動(dòng)，乳化，擴(kuò)散，擊碎，化學(xué)效應(yīng)等也能加速待提取物的擴(kuò)散釋放并加快與溶劑的混合，提高藥物溶出速度和溶出次數(shù)。與常規(guī)提取法相比，提取時(shí)間短，一般一個(gè)小時(shí)之內(nèi)就能提取完成，提取率高，是普通方法的2-3倍，低溫提取更是有利于保存易揮發(fā)，不穩(wěn)定成分等優(yōu)點(diǎn)。Toma等（2001）[14]對(duì)超聲輔助提取酸橙、茼香種子、駱駝蓬屬種子、啤酒花球果、土木香根、薄荷葉等7種植物材料中的活性物質(zhì)進(jìn)行了研究，主要考察了超聲處理與傳統(tǒng)的提取方法對(duì)幾種植物材料溶脹系數(shù)、提取含量和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明超聲處理1h金盞花、酸橙、酋香種子、駱駝蓬屬種子、啤酒花球果、土木香根、薄荷葉吸水的體積分別為6、5、4、3、3、2.5、2.5mL,溶脹率分別增加了27、20、100、60、43、55、38%。而提取溶劑對(duì)提取含量有最直接的影響，但是超聲處理后提取物的含量均比浸泡提取的高。此外，通過掃描電鏡圖片觀察了超聲處理后對(duì)植物材料細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)植物組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯被破壞，提取成分從植物材料快速溶入到提取溶劑，首次從細(xì)胞結(jié)構(gòu)的角度解釋了超聲強(qiáng)化的機(jī)理。Paniwnyk等（2001）[15]進(jìn)行了槐樹花牙中蘆丁的超聲增強(qiáng)提取，發(fā)現(xiàn)不當(dāng)?shù)某曁幚韺?dǎo)致提取量的下降。Li等(2004)[16]研究了超聲增強(qiáng)大豆油的提取，同樣利用大豆粉末細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的電鏡圖片解釋了超聲增強(qiáng)的機(jī)理。Vinatoru(2001)[17]比較全面的綜述了超聲輔助提取蕓香科植物活性物質(zhì)的研究，文章中詳細(xì)介紹了提取溶劑的選擇、超聲參數(shù)對(duì)提取過程可能產(chǎn)生的影響以及超聲增強(qiáng)的原理、超聲提取技術(shù)的優(yōu)勢(shì)以及研發(fā)規(guī)?；曉O(shè)備的要求。Knorr(2003)[18]對(duì)植物有機(jī)代謝物的非熱處理方法進(jìn)行了綜述，認(rèn)為超聲輔助提取植物代謝物以及在加工功能性食品的非熱預(yù)處理等方面有巨大的應(yīng)用潛力；Wang等[19]綜述了各種提取方法應(yīng)用于提取植物材料中營養(yǎng)成分的研究進(jìn)展，比較了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)以及未來的發(fā)展方向，并探討了開發(fā)快速、有效、環(huán)保等優(yōu)勢(shì)的提取技術(shù)的應(yīng)用前景和市場(chǎng)潛力。Vilkhu等(2007)[20]對(duì)超聲輔助提取動(dòng)植物材料中的多酚、多糖、花色昔等多種功能性成分的研究報(bào)道及其今后在食品加工領(lǐng)域的發(fā)展前景進(jìn)行了綜述，提出了超聲規(guī)模化提取活性物質(zhì)的一些關(guān)鍵問題：（1）植物材料細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)特性；（2）提取成分在植物組織中所在的部位；（3）超聲提取前對(duì)植物組織的處理；（4）提取成分的理化性質(zhì)；（5）超聲對(duì)植物材料表面的破壞及生物量轉(zhuǎn)變的影響、擴(kuò)散作用、減少提取時(shí)間、增加提取效率等等。Patist等（2007）[21]探討了超聲波技術(shù)在食品領(lǐng)域內(nèi)可能的商業(yè)化應(yīng)用以及工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)面臨的挑戰(zhàn)及其未來的發(fā)展趨勢(shì)，特別對(duì)超聲波加工技術(shù)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用充滿了信心。本文根據(jù)影響超聲輔助法提取野菊花中總黃酮的因素，選取料液比（A）乙醇濃度（B）,提取溫度（C），提取功率（D）,提取時(shí)間（E），作為實(shí)驗(yàn)依據(jù)，設(shè)置四個(gè)水平條件，以總黃酮為指標(biāo)，選用L16（45）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：最佳組合是A2B2C4D4E3,即超聲波輔助提取野菊花總黃酮的最佳條件是料液比1:20，60%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇濃度，提取溫度70℃，提取功率60w，提取時(shí)間50min。[1]崔蘭沖,李小芩,韓瑩,李發(fā)美.HPLC測(cè)定野菊花中蒙花苷與木犀草素的含量[J].2007,32（1）：3[2]戴勝，張明，程文明，張勛，張群林，李俊.HPLC測(cè)定野菊花藥材中8種黃酮和有機(jī)酸的含量[J].2013,38（12）：5[3]元琦，李新民，王月伶，等.β-環(huán)糊精修飾區(qū)帶毛細(xì)管電泳法測(cè)定野菊花中刺槐素、木樨草素和槲皮素[J]理化檢驗(yàn)（化學(xué)分冊(cè)），2005(7):464[4]吳釘紅，楊立偉，蘇薇薇.野菊花化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)[J]中藥材，2004，27（2）：142[5]楊昱，白靖文，俞志剛．超聲輔助提取技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用[J]．食品與機(jī)械，2011,27（1）：170-174[6]鐘姣姣，李萬林.菊花中總黃酮微波輔助提取工藝條件研究[J].西部皮革，2014，36（12）15-21[7]單科開，王鴻飛，許鳳，羅潔，韓愛茹，李艷霞，邵興鋒，韋瑩瑩，苦菜總黃酮超聲波輔助提取及抗氧化能力研究[J]，2019，33（9）1755-1764[8] 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