ICS5.150遼寧省地DB21方標準DBT3120—2019nicalspecificationforspeciesmolecularidentificationusingCOIand遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布前言GBT定。大連市質量技術監(jiān)督局提出。遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。要起草單位：遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院。水產(chǎn)動物物種分子鑒定COI、16SrRNA分子標記法本方法規(guī)定了水產(chǎn)動物物種分子鑒定COI、16SrRNA分子標記法的相關術語和定義，標記方式，試劑、儀器和設備，樣品采集、保存和前處理，DNA提取和檢測，序列擴增和測序，以及物種鑒定的于水產(chǎn)動物物種分子鑒定COI、16SrRNA分子標記法。范性引用文件(包括所有的修改單)適用于本文件。GBT6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法定義物種分子鑒定aquaticspeciesmolecularidentification指利用分子生物學手段,對水產(chǎn)動物樣本(尤其適用于形態(tài)學特征相近、模糊或丟失的樣本)的分分析，鑒定生物種類的過程。反應polymerasechainreaction(PCR)ADNAsequencingalignment排列。ACOIcI(cytochromeccoxidasesubunitI)。bosomalRNA4標記方式NA比對，確定物種分類信息。本方法同時對COI和16SrRNA兩種分子標記條形碼進行分析，并在GenBank https//genbank)和BOLDSystem()兩個數(shù)試劑、儀器和設備5.1試劑醇；——95%乙醇；——TE緩沖液(pH7.6)(100mol/LTris-Cl，pH7.6；10mmol/LEDTA，pH8.0)；——Taq酶(5U/μL)；水；——10×PCR緩沖液(500mmol/LKCl；100mmol/LTris-Cl，pH8.3；15mmol/LMgCl2)；——引物(10μmol/L)；dNTP每種脫氧核糖核苷三磷酸濃度2.5mmol/L)；——溴化乙錠(10mg/mL)；糖；酚；——氯仿/異戊醇(24:1)；菌蒸餾水；——細胞裂解液(20mmol/L)。5.2儀器和設備要包含以下內(nèi)容：成像分析系統(tǒng)；PCR；序列擴增和測序壓穩(wěn)流電泳儀；道可調(diào)移液器；浴恒溫震蕩器；外分光光度計；傳分析儀。采集、保存和前處理L樣品采集、保存Z樣品前處理L新離心管中(重復此過程一次)。LZL測LZZ測分別于260nm和280nm波長下測定DNA的紫外吸收值。DNA濃度(μg/mL)=[A260/(0.020×L)]×稀釋8.1引物PCR參見附錄A。.3測序9物種鑒定9.1序列比對鑒定將COI基因序列在GenBank和BOLDSystem中進行核苷酸序列比對，將16SrRNA基因序列在GenBank列比對檢出標準為序列相似度≥99%；——對于鑒定成功的樣本，記錄于《水產(chǎn)動物物種分子鑒定記錄表》(見附錄B)；的樣本，作為未檢出樣本處理。9.2未檢出樣本未檢出樣本記錄于《未檢出水產(chǎn)動物分類記錄表》(詳見附錄C)。A(資料性附錄)COI基因PCR擴增引物F:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'R5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3'F:5'-TATTATTAGACAAGAATCTGGTAAA-3'R5'-AGGAAATGTTGAGGGAAGAAAGTAA-3'F5'-ACAAATCAYAARGAYATYGG-3'R'-ACCAATCATAAAGATATTGG-3'F5'-ACAAAYCATAAAGAYATTGG-3'R'-GTAAATATATGRTGGGCTCA-3'F5'-ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3'R'-GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3'F:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGAAC-3'R:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'F:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'R5'-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3'F:5'-ACTCAGCCATCTTACCTGTGATT-3'R:5'-TGGTGGGCTCATACAATAAAGC-3'(選用)F:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'R:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'(除甲殼F:5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3'R:5'-TCCATAGGGTCTTCTCGTC-3'F:5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3'R:5'-TCCATAGGGTCTTATCGTC-3'F:5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3'R:5'-TCCATAGGGTCTTTTCGTC-3'(資料性附錄)物種分子鑒定記錄表B；地點；年月日時分至年月日時分123456789(資料性附錄)產(chǎn)動物分類記錄表；地點；年月日時分至年月日時分123456789參考文獻sequencesinthemitochondrial16SrRNAgene.Legalmedicine,2009,11:S449-S450.[2]LakraWS,GoswamiM,GopalakrishnanA.Mol