3.膜的合成與分選MedicineNobelgoestopioneerofproteinguidancemechanismsNature401,625(1999)Howdotheproteinsknowwheretogo?Howdotheymaketheirway?----NatureGunterBlobel細(xì)胞中自組裝和自組織問(wèn)題的重要課題之一是物質(zhì)的分選、定向和轉(zhuǎn)運(yùn)，是細(xì)胞自組裝自組織過(guò)程的第一步..#IndividualProteinsaretransportedwithinthepatternaccordingtointrinsicsignals.Signalsequences---initiatetranslocationofproteinsacrossspecificmembranes.Stop-transfersequences---interruptthetranslocationprocessthatwaspreviouslyinitiatedbyasignalsequence.Sortingsequences---actasdeterminantsforposttranslocationaltrafficofsubpopulationsofproteins.Insertionsequences---initiateunilateralintegrationofproteinsintothelipidbilayerwithoutthemediationofadistinctproteineffector.-------GunterBlobel(PANS77,1980,1496-1500)蛋白質(zhì)分選存在不同層次由線粒體和葉綠體DNA編碼的蛋白，則在這些細(xì)胞器的核糖體中合成，因此這些蛋白就直接編入線粒體和葉綠體空間里(compartment)。在真核細(xì)胞中，大多數(shù)線粒體和葉綠體蛋白，以及其它細(xì)胞器、顆粒和膜的蛋白都是由核DNA編碼，并在胞漿核糖體中合成的。將這些蛋白分選到其正確的方向，就需要多重的分選信號(hào)及多步的分選活動(dòng)。蛋白質(zhì)分選存在不同層次對(duì)于在胞漿中合成的蛋白質(zhì)分選在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上膜束縛的核糖體(membrane-attachedribosomes)上合成的蛋白。未附著膜上的胞漿核糖體(membrane-unattachedribosomes)合成的蛋白。蛋白質(zhì)分選存在不同層次對(duì)于未附著在膜上的胞漿核糖體中合成的蛋白合成后被釋放到胞漿中，其中一些蛋白仍保留在胞漿中，而另外一些則被編入細(xì)胞核、線粒體、葉綠體或過(guò)氧化酶體中，然后再進(jìn)一步分選到這些細(xì)胞器中的正確方位。

被導(dǎo)向線粒體的蛋白要首先與線粒體外膜胞質(zhì)側(cè)的特異性受體結(jié)合，即輸入受體(import-receptor)。許多進(jìn)入線粒體的蛋白含有一個(gè)具有信號(hào)功能的前導(dǎo)序列(pre-sequence)，大小從0.5kd到20kd不等。當(dāng)?shù)鞍锥ㄎ挥诰€粒體膜上之后此前導(dǎo)序列被切除。

對(duì)大量的前導(dǎo)序列的分析發(fā)現(xiàn)，它們富含Arg和Lys，并且通常被不帶電的氨基酸如Ser和Thr分隔開(kāi)，幾乎不含有酸性氨基酸。這些特征都說(shuō)明它們是決定蛋白在線粒體上定位的序列.

此外還發(fā)現(xiàn)線粒體前體蛋白在特定的內(nèi)外膜接觸區(qū)域跨越線粒體的內(nèi)外膜.蛋白質(zhì)分選存在不同層次對(duì)于在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上膜束縛的核糖體上合成并進(jìn)入分泌途徑的蛋白，又可分為兩種類型蛋白。一類以共轉(zhuǎn)移形式—即邊合成邊穿過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)而進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中腔中的蛋白。另一類為整合膜蛋白(integralmembraneprotein)，這些蛋白的前25個(gè)氨基酸組成的序列叫做拓?fù)湫蛄?topogenicsequences)，用以保證蛋白在插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜時(shí)獲得正確的定向。蛋白質(zhì)合成與分選的分泌途徑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號(hào)(signalsforretentioninER)

目前一種觀點(diǎn)認(rèn)為，那些將要離開(kāi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體、并進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜或溶酶體等細(xì)胞器的蛋白，是不需要特定的信號(hào)序列的(??，這種觀點(diǎn)可能不對(duì)!)。而在那些保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白上卻發(fā)現(xiàn)了一些保守的信號(hào)序列—所謂的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號(hào)。如，已發(fā)現(xiàn)序列l(wèi)ys-Asp-Glu-Leu對(duì)三種駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的非膜蛋白是必需的。轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡介導(dǎo)的胞內(nèi)運(yùn)輸轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡介導(dǎo)的胞內(nèi)運(yùn)輸對(duì)于進(jìn)入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分泌蛋白，通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡把它們轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基復(fù)合體。那些被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體囊泡中的蛋白，其中一部分將繼續(xù)留在高爾基體中，剩下的則會(huì)被運(yùn)送到溶酶體及各種囊泡中。其中進(jìn)入分泌囊泡的蛋白經(jīng)過(guò)胞吐(exocytosis)，即分泌小泡的膜與細(xì)胞膜融合，將蛋白釋放到細(xì)胞外Thesecretorypethwayofproteinsynthesis轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡介導(dǎo)的胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)谝唬D(zhuǎn)運(yùn)囊泡是如何形成的，某些膜整合蛋白是如何選擇性插入囊泡而其他蛋白卻被排除在外？第二，導(dǎo)致特定轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡只結(jié)合在特定種類細(xì)胞器膜上的分子機(jī)制是什么？第三，轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡與靶細(xì)胞器膜融合的機(jī)制是什么？StageandcomponentsofavesicleshuttleNature396(1998)543Science272(1996)228.Cell97(1999145Cell92(1998)759buddingtargetingfusion轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡介導(dǎo)的胞內(nèi)運(yùn)輸Budding(出芽):兩種包被蛋白參與兩類轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡的形成clathrin-coatedvesicles:由籠形蛋白(clathrin)包被的囊泡，形成于plasmamembrane和trans-GolgiNetwork之間。COP-coatedvesicles:COP包被蛋白包括若干種coatmer，其中COP是一種與籠形蛋白重鏈相似的蛋白。這些非籠形包被蛋白包被的囊泡形成于ER與Golgi之間，以及不同種類的Golgi囊泡之間?；\形蛋白包被囊泡的形成膜整合蛋白選擇性編入籠形蛋白包被囊泡過(guò)程一個(gè)的模型。一些膜蛋白的胞漿結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合在組裝顆粒上。然后，這些組裝顆粒再與籠形蛋白相結(jié)合，并與其一起自發(fā)地聚集到膜的一個(gè)區(qū)域。未與組裝顆粒結(jié)合的膜蛋白則被排除在籠形蛋白包被囊泡之外。位于纖維原細(xì)胞膜胞漿側(cè)的籠形蛋白包被凹陷，具有籠形蛋白纖維組成的多面體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Thecellwasrapidlyfrozeninliquidhelium,freeze-fractured,andthentreatedbythedeep-etchingtechnique.轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡介導(dǎo)的胞內(nèi)運(yùn)輸Budding(出芽)Targating(導(dǎo)向定位)Fusion(融合)

每一個(gè)Rab蛋白都有一個(gè)中心結(jié)構(gòu)，其氨基酸序列在所有Rab蛋白中都很相似，這一區(qū)域可以結(jié)合GTP并將其水解為GDP。接近C-端、約35個(gè)氨基酸長(zhǎng)的片斷，是各種Rab蛋白特異性的，它決定了該種Rab蛋白結(jié)合的膜的種類。C-端的半胱氨酸殘基，共價(jià)結(jié)合到聚異戊二烯脂上，通常是20碳的geranylgeranyl。各種Rab蛋白N-端的約20個(gè)殘基也非常不同。Rab蛋白的通常結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡介導(dǎo)的胞內(nèi)運(yùn)輸Budding(出芽)Targating(導(dǎo)向定位)Fusion(融合)膜融合前轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡與受體medial-Golgi囊泡的結(jié)合(Golgi復(fù)合體中囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)節(jié))兩個(gè)膜的吸附是由Rab蛋白起始的，并且由轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡膜上的VAMP樣蛋白的胞漿結(jié)構(gòu)域與受體囊泡膜上的syntaxin樣蛋白的胞漿結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。三種SNAP蛋白結(jié)合到上述復(fù)合體上，并進(jìn)一步結(jié)合NSF。然后（步驟5，不知在何處發(fā)生），ATP的水解引發(fā)了Golgi膜與轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡膜的融合，同時(shí)，NSF和SNAPs釋放到胞漿中。突觸囊泡循環(huán)的最關(guān)鍵步驟是膜融合引發(fā)的出胞作用。Golgi復(fù)合體中囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)節(jié)cis和medialGolgi囊泡間的轉(zhuǎn)運(yùn)步驟是通過(guò)對(duì)非細(xì)胞提取物的研究確定的。將cis-Golgi囊泡培育在GTP，ATP，和coatomer中，ARF（1）可以導(dǎo)致非籠形蛋白包被轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡的形成（2）這些囊泡結(jié)合到受體medial-Golgi囊泡上（3）。非籠形蛋白包被轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡的去包被（4）需要一種胞漿蛋白R(shí)ab及GTP水解為GDP和Pi；實(shí)驗(yàn)中若添加不能水解的GTP類似物，則此步驟被阻斷。囊泡膜與medial-Golgi膜（5）融合需要ATP的水解和四種胞漿蛋白：NSF和三種SNAPs（溶解的NSF結(jié)合蛋白）。添加化學(xué)物質(zhì)NEM（N-ethylmaleimide）可以選擇性阻斷這一步驟，因?yàn)樗梢耘cNSF上關(guān)鍵的SH基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。

轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡介導(dǎo)的胞內(nèi)運(yùn)輸VesicleshuttleVesicleshuttleVesicleshuttle膜脂的合成與運(yùn)輸膜脂的生成磷脂在已有細(xì)胞膜上結(jié)合的酶的催化下合成，并在合成后直接插入該膜中。膜的生成是在已有膜的基礎(chǔ)上的延伸。

上述觀點(diǎn)可由實(shí)驗(yàn)證明，將細(xì)胞暫時(shí)暴露在放射性磷酸鹽或放射性標(biāo)記的脂肪酸或糖中，則可以看到由這些前體物質(zhì)合成的放射性磷脂和糖脂全都與細(xì)胞內(nèi)的膜相結(jié)合；并沒(méi)有游離在胞漿中。由此可知，磷脂是邊合成邊插入膜中的。

所有的細(xì)胞中，磷脂都是在膜和胞漿的分界面上合成的。在動(dòng)物和植物細(xì)胞中，大多數(shù)磷脂的合成都是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相結(jié)合的，通常是滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。催化合成反應(yīng)的酶，大多是一端與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合或插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而另一端伸入胞漿中。

多數(shù)細(xì)胞可以利用乙酸鹽合成脂肪酸；而許多動(dòng)物細(xì)胞則可以從三酰甘油的水解獲得脂肪酸。在動(dòng)物細(xì)胞的磷脂酰乙醇胺合成途徑中，其中的一個(gè)底物--脂肪酰輔酶A是一種lipid-anchoredprotein，其脂肪酰鏈埋入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的胞漿側(cè)(inthecytosolicleafletoftheERmembrane)，輔酶A部分則伸向胞漿中(protrudingintothecytosol)。其它的底物和反應(yīng)產(chǎn)物，如ATP、乙醇胺、CTP等，則都是胞漿中的可溶性組分。特定的膜蛋白使磷脂在膜兩側(cè)平衡

新合成的磷脂分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞漿側(cè)，但不久，大多數(shù)磷脂就會(huì)如同大部分細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)一樣，分布到胞漿和非胞漿兩側(cè)。在大多數(shù)膜中，一個(gè)磷脂分子從膜的一側(cè)移動(dòng)到另一側(cè)(翻轉(zhuǎn),flip-flop)至少需要幾個(gè)小時(shí)。那么新合成的磷脂是如何快速地從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞漿側(cè)移動(dòng)到非胞漿側(cè)的呢?這是由于在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上(及細(xì)菌的細(xì)胞膜)含有一種或幾種蛋白，叫做翻轉(zhuǎn)酶(flippase)蛋白，可以催化磷脂的翻轉(zhuǎn)過(guò)程。這種翻轉(zhuǎn)過(guò)程的半衰期(half-time)，即一半新合成的磷脂移動(dòng)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的非胞漿側(cè)所需要的時(shí)間，只有幾分鐘。紅細(xì)胞膜含有少量的、不同種類的翻轉(zhuǎn)酶，可以催化磷脂從膜一側(cè)向另一側(cè)翻轉(zhuǎn)phospholipidflippase磷脂翻轉(zhuǎn)酶的檢驗(yàn)磷脂—二丁基磷脂酰膽堿是水溶性的，因?yàn)樗卸痰?、四碳脂肪酸鏈。?dāng)向純磷脂囊泡懸浮液中添加這種磷脂時(shí)，這些磷脂會(huì)自發(fā)插入到囊泡的外層，但由于脂質(zhì)體中缺少翻轉(zhuǎn)酶，這些磷脂無(wú)法翻轉(zhuǎn)到內(nèi)層。實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)加入一種翻轉(zhuǎn)酶之后，添加在囊泡外側(cè)的二丁基磷脂酰膽堿就可以翻轉(zhuǎn)到膜內(nèi)層。在膜內(nèi)層，這種磷脂就可自發(fā)的運(yùn)動(dòng)到囊泡腔中。磷脂—二丁基磷脂酰膽堿(Dibutyrylphosphatidylcholine)特定的膜蛋白使磷脂在膜兩側(cè)平衡

膜的兩側(cè)常含有不同的磷脂組成。這種脂類分布的不對(duì)稱性是如何達(dá)到的，目前還不清楚！其產(chǎn)生也可能部分受到磷脂對(duì)翻轉(zhuǎn)酶蛋白的不同親和性，或者整合膜蛋白在膜兩側(cè)特定區(qū)域的不均衡分布的影響。膜脂的運(yùn)輸胞內(nèi)和胞間的囊泡運(yùn)輸磷脂交換蛋白的參與膜脂的運(yùn)輸胞內(nèi)和胞間的囊泡運(yùn)輸細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡(vesicleshuttle)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上出芽、離開(kāi)，并與高爾基復(fù)合體的膜融合；然后另一種囊泡再?gòu)母郀柣鶑?fù)合體出芽，與其它的細(xì)胞器融合。這種反復(fù)的出芽-融合就完成了磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)。各種磷脂可以選擇性的插入不同的轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡，因此不同的細(xì)胞器有不同的磷脂組成。在動(dòng)物細(xì)胞中，糖脂末端的糖鏈如半乳糖、N-乙酰神經(jīng)氨酸(唾液酸)的添加是在高爾基復(fù)合體中進(jìn)行的。因此這種新合成的糖脂只存在于高爾基體膜的非胞漿側(cè)(內(nèi)腔側(cè))。合成后，糖脂經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡—可能與運(yùn)送新合成的分泌蛋白和膜整合蛋白相同的囊泡--運(yùn)送到細(xì)胞膜上。Theendosomaloriginofexosomes–一種胞間囊泡運(yùn)輸－

NatureReviews4(2001)213

C)Argosomes.GPIanchoredgreenfluorescentprotein(GFP)–GPI(greenstar,redtag)intheouter-membraneleafletandgeranylgeranyl-anchoredcyanfluorescentprotein(CFP)–Rho(geranylgeranyl,blue)intheinnerleafletareincorporatedintotheargosomemembrane(orange),whereasmyristoylanchoredGFP(GFP–Myr)intheinnerleafletofthemembraneisnot.Da)Theexosomaloriginofargosomes.Inthedonorcells,argosomalmembraneisendocytosed(1)andtargetedtoendosomes(2);invaginationofargosomalmembraneintheendosomesgivesrisetomultivesicularbodies(MVBs)(3).TheoutermembraneofMVBsfusestotheplasmamembrane(4),whichreleasestheinternalvesicles,exosomesorargosomes(5).Exosomesfusewiththeplasmamembrane(6)ortheyare