總RNA提取.濃度的測定一.原理討論基因的表達(dá)和調(diào)控時經(jīng)常要從組織和細(xì)胞中分別和純化RNA。RNA質(zhì)量的凹凸經(jīng)常影響cDNA庫、RT-PCR^nNorthernBlot等分子生物學(xué)試驗(yàn)的成敗。Trizol溶液是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細(xì)胞或組織中提取總RNAO其含有苯酚、異硫氧酸服等物質(zhì)，能快速破裂細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。Trizol在破裂和溶解細(xì)胞時能保持RNA的完整性，因此對純化DNA及標(biāo)準(zhǔn)化RNA的生產(chǎn)非常有用。二、試驗(yàn)試劑及儀器氯仿（三氯甲烷1異丙醇、無水乙醇、冷PBS、DEPC水、滅酶槍頭、一次性手套、EP管架、吸管、冷凍離心機(jī)4。（：預(yù)冷，眼科銀，眼科剪（組織用）三.試驗(yàn)步驟組織:L將器械，組織管，勻漿器鉆頭提前用DEPC水浸泡過夜。滅酶EP管編號。2、將新奇組織剪切成黃豆大小的塊，或凍存于液氮的樣品（在離體后應(yīng)快速冷凍在液氮中,也可加入保存）置入組織管內(nèi)，加入500pLTrizol,用勻漿器充分研碎組織。使用后的勻漿器鉆頭分別置于2管75%乙醇（DEPC水配制），2管DEPC水中空轉(zhuǎn)后方可進(jìn)入下一組織漿中。3、吸出研碎的粉紅色勻漿至EP管內(nèi)，室溫靜置10-15min。4、加入200pL氯仿，使用震蕩器震蕩為乳糜樣，12000rpm離心15min05、EP管內(nèi)可見分為水樣層，中間層和有機(jī)層，吸取上層水樣層至新EP管內(nèi)。6、加入500口1,異丙醇，上下混勻，室溫靜置lOmin,12000rpm離心15mino7、當(dāng)心吸取上清，留下沉淀，加入75%乙醇（DEPC水配制）5OO|jL,彈起沉淀，12000rpm離心5min，再次吸去上清，加入75%乙醇（DEPC水配制）5OO|jL,12000rpm離心5min，吸去上清。濾紙吸干管口余液。必要時再次離心2-3min,10pL槍頭吸取，打開EP管蓋晾干。8、黃豆大小組織提取的RNA可加DEPC水5O|jL溶解后置于冰上，亦可依據(jù)組織塊大小加入不同體積DEPC水溶解。9、打開DNA/RNA濃度測定儀，測定樣品A260和A280值。可預(yù)先滴一滴水為空白對比，調(diào)整A260零點(diǎn)和A280零點(diǎn)。擦干比色杯中的水，加入混合勻稱的RNA樣液O.5pL,測定A260值及A260/A280比值,RNA濃度100ng/ml,比值為1.921,方滿意試驗(yàn)要求。10、每管15RLRNA樣液分裝，放入-8CTC冰箱分裝，避開反復(fù)凍融。細(xì)胞：1、取出EP管、做好標(biāo)記，吸出或收集上清保存?zhèn)溆谩?、用冷PBS沖洗細(xì)胞兩次。3、加入1mlTrizol（24孔板每孔加0.5ml即可），調(diào)小刻度用移液器吹打細(xì)胞至液體澄清（或搖動混勻后室溫孵育lOmin\4、余步驟同組織提取操作。四、留意事項(xiàng)1、盡可能使用無菌，一次性塑料制品。已標(biāo)明RNase-Free的塑料制品，如沒有開封使用過，通常沒有必要再次處理。對于國產(chǎn)塑料制品，原則上都必需處理方可使用。處理方法如下：在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使DEPC的終濃度為0.1%。留意：DEPC為劇毒物，活性很強(qiáng)，當(dāng)心在通風(fēng)柜中使用。將待處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的全部部分都浸泡到溶液中。在通風(fēng)柜中室溫處理過夜。2、玻璃和金屬物品可采納250℃烘烤3小時以上滅活RNase。3、RNase廣泛存在于人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關(guān)的分子生物學(xué)試驗(yàn)時,必需戴手套。一般狀況下采納用DEPC配制的75%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部，基本達(dá)到要求。取RNase-free的物品時必需戴手套。4、A260nm是核酸最高汲取峰的汲取波長，最佳測量值的范圍為0.1至1.0。假如不在此范圍，稀釋或濃縮樣品，使之在此范圍內(nèi)；假如吸光度小于0.05,檢查是否存在操作因素（如移液不精確，樣品內(nèi)有懸浮物等）影響。核酸的吸光度必需大于0.1,其值才有效和牢靠。A280nm是蛋白和酚類物質(zhì)最高汲