抗菌藥物敏感試驗(yàn)測定抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑菌或殺菌作用的方法稱為抗菌藥物敏感性試驗(yàn)（AntimicrobialSusceptibilityTest），簡稱藥敏試驗(yàn)（AST）。第一頁，共54頁。藥敏試驗(yàn)的意義預(yù)測抗菌治療的效果；指導(dǎo)抗菌藥物的臨床應(yīng)用；發(fā)現(xiàn)或提示細(xì)菌耐藥機(jī)制的存在，能幫助臨床醫(yī)生選擇合適的藥物，避免產(chǎn)生或加重細(xì)菌的耐藥；監(jiān)測細(xì)菌耐藥性，分析耐藥菌的變遷，掌握耐藥菌感染的流行病學(xué)，以控制和預(yù)防耐藥菌感染的發(fā)生和流行。第二頁，共54頁。藥敏試驗(yàn)MIC：在與微生物生長速率有關(guān)的特定時(shí)間間隔內(nèi)，通常是18～24小時(shí)，能夠抑制被測菌生長的最低藥物濃度。第三頁，共54頁。敏感性分類(CLSI的定義)敏感（Susceptible）用常規(guī)用量治療有效常規(guī)用藥時(shí)達(dá)到的平均血藥濃度超過細(xì)菌的MIC5倍以上。耐藥（Resistance）用常規(guī)用量治療不能抑制細(xì)菌的生長MIC高于藥物在血、體液中可能達(dá)到的濃度第四頁，共54頁。敏感性分類（2）中介(Intermediate)MIC接近血、體液中藥物的濃度，治療反應(yīng)率低于敏感株藥物生理濃集部位有效(尿-FQ)加大用藥劑量可能有效第五頁，共54頁。藥敏試驗(yàn)的方法學(xué)半定量…紙片擴(kuò)散法(抑菌圈直徑)MIC法：稀釋法(肉湯、瓊脂)自動(dòng)化儀法抗生素連續(xù)梯度法(Etest)流式細(xì)胞儀第六頁，共54頁。

將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer法）第七頁，共54頁。紙片擴(kuò)散法水解酪蛋白（MH）培養(yǎng)基，pH7.2～7.4，做成瓊脂厚度4mm，直徑90mm的平板；挑取孵育16～24小時(shí)已分純菌落，置于生理鹽水管中，振蕩混勻后校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)。

第八頁，共54頁。紙片擴(kuò)散法用無菌棉拭子蘸取菌液，在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液；然后在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度；最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周；平板在室溫下干燥3～5min，用無菌鑷子或商品化的紙片分配器將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心距離應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣大于15mm。第九頁，共54頁。紙片擴(kuò)散法35℃孵育16～24小時(shí)量取抑菌圈直徑；根據(jù)抑菌環(huán)的直徑，按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀，報(bào)告敏感、中介、耐藥。第十頁，共54頁。11紙片擴(kuò)散法－影響因素MIC接種菌量細(xì)菌生長率抗生素含量、擴(kuò)散性平皿厚度溫度，預(yù)孵育時(shí)間第十一頁，共54頁。12紙片擴(kuò)散法－標(biāo)準(zhǔn)化CLSI：美國實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute)每年修訂更改包括質(zhì)控新藥的判定標(biāo)準(zhǔn)特殊耐藥性的檢測第十二頁，共54頁。13CLSI的法規(guī)規(guī)定紙片含量、接種濃度、培養(yǎng)基、平皿厚度、判定標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控；規(guī)定常規(guī)測試報(bào)告的抗生素；不同的藥判定標(biāo)準(zhǔn)不同；不同的菌判定標(biāo)準(zhǔn)也不同。第十三頁，共54頁。14常規(guī)測試并報(bào)告的藥物分組(1)

腸桿菌科

綠膿和非腸桿菌科一級氨芐西林頭孢他啶，慶大霉素頭孢唑林，慶大霉素 替卡西林，哌拉西林二級阿米卡星 阿米卡星氨芐西林/舒巴坦頭孢吡肟，頭孢哌酮

阿莫西林/克拉維酸 氨曲南頭孢呋肟，頭霉素 環(huán)丙沙星，亞胺培南頭孢噻肟，頭孢曲松替卡西林/克拉維酸

環(huán)丙沙星，亞胺培南妥布霉素，復(fù)方磺胺

替卡西林，哌拉西林 三級氨曲南，頭孢他啶 頭孢曲松卡那霉素，奈替米星氯霉素，奈替米星妥布霉素 四環(huán)素，氯霉素

第十四頁，共54頁。15常規(guī)測試并報(bào)告的藥物分組(2)

葡萄球菌

腸球菌一級苯唑西林，青霉素青霉素，氨芐西林二級紅霉素類 萬古霉素克林霉素，萬古霉素三級氯霉素 慶大霉素第十五頁，共54頁。16常規(guī)測試并報(bào)告的藥物分組(3)

流感嗜血桿菌

肺炎鏈球菌一級氨芐西林，青霉素 青霉素，紅霉素復(fù)方磺胺

復(fù)方磺胺二級頭孢呋肟，頭孢噻肟 氧氟沙星，四環(huán)素頭孢他啶，氯霉素萬古霉素三級阿奇霉素，頭孢克羅 氯霉素，利福平環(huán)丙沙星，亞胺培南 利福平，四環(huán)素第十六頁，共54頁。17預(yù)報(bào)用藥(一)

測試藥 菌名 推測其他藥物的敏感性苯唑西林 葡萄球菌 所有β-內(nèi)酰胺類四環(huán)素 所有（除葡 多西環(huán)素，米諾環(huán)素

萄球菌和不 動(dòng)桿菌〕紅霉素 G＋球菌 羅紅霉素，克拉霉素，

阿奇霉素克林霉素 所有 林可霉素第十七頁，共54頁。2023/4/418預(yù)報(bào)用藥(二)測試藥 菌名 推測其他藥物的敏感性氨芐西林 腸球菌 青霉素青霉素G 葡萄球菌 氨芐西林，美洛西林

替卡西林頭孢噻吩 腸桿菌科 頭孢拉定，頭孢氨芐

頭孢克羅奈啶酸

腸桿菌科 所有氟喹諾酮類萬古霉素

所有 替考拉寧第十八頁，共54頁。以一定濃度的抗菌藥物與含有被試菌株的培養(yǎng)基進(jìn)行一系列不同倍數(shù)稀釋（通常為雙倍稀釋），經(jīng)培養(yǎng)后觀察其最低抑菌濃度。稀釋法中用瓊脂培養(yǎng)基者為瓊脂稀釋法，用肉湯培養(yǎng)基者為肉湯稀釋法。藥敏試驗(yàn)-稀釋法第十九頁，共54頁。Etest法E試條是一條5mm×50mm的無孔試劑載體，一面固定有一系列預(yù)先制備的，濃度呈連續(xù)指數(shù)增長稀釋抗菌藥物，另一面有讀數(shù)和判別的刻度；抗菌藥物的梯度可覆蓋有20個(gè)MIC對倍稀釋濃度的寬度范圍；將E試條放在細(xì)菌接種過的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點(diǎn)的刻度濃度即為抗菌藥物抑制細(xì)菌的最小抑菌濃度。第二十頁，共54頁。2023/4/4wanghui-ART21Etest法

細(xì)菌生長區(qū)Etest塑料條橢圓形細(xì)菌生長抑制區(qū)2561288016判讀抑菌濃度（MICug/ml)第二十一頁，共54頁。Etest法菌液制備及接種均同紙片擴(kuò)散法。90mm平板上可放E試驗(yàn)試條1～2條，140mm平板最多可放6條。孵育溫度及時(shí)間同紙片擴(kuò)散法。第二十二頁，共54頁。2023/4/423Etest法優(yōu)點(diǎn)連續(xù)濃度梯度，與瓊脂稀釋法相關(guān)性好影響因素少，穩(wěn)定性高操作簡單，省時(shí)缺點(diǎn)：昂貴用途：快生長菌，苛養(yǎng)菌，厭氧菌，酵母菌，分枝桿菌第二十三頁，共54頁。細(xì)菌耐藥機(jī)制

細(xì)菌耐藥機(jī)制主要有四種：產(chǎn)生一種或多種水解酶、鈍化酶和修飾酶；抗生素作用的靶位改變，包括青霉素結(jié)合蛋白位點(diǎn)、DNA解旋酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的改變等；細(xì)菌膜的通透性下降，包括細(xì)菌生物被膜的形成和通道蛋白丟失；細(xì)菌主動(dòng)外排系統(tǒng)的過度表達(dá)。在上述耐藥機(jī)制中，第一、二種耐藥機(jī)制具有專一性，第三、四種耐藥機(jī)制不具有專一性。第二十四頁，共54頁。Β-內(nèi)酰胺酶

β內(nèi)酰胺酶是一類水解青霉素、頭孢菌素類抗生素的滅活酶；該酶位于革蘭陽性球菌菌體外，革蘭陰性桿菌間質(zhì)中；檢測方法有微生物培養(yǎng)法、碘－淀粉法、頭孢硝噻吩紙片法。其中頭孢硝噻吩紙片法因?yàn)楹唵巍⒎奖恪⒖焖?，?yīng)用于臨床檢測。第二十五頁，共54頁。

葡萄球菌屬–青霉素

方法敏感中介耐藥MIC0.12g/ml-0.25g/ml紙片擴(kuò)散法29mm-28mmCLSIM100-S20.Table2C.第二十六頁，共54頁。誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)苯唑西林(誘導(dǎo)劑)接種純菌落于瓊脂上(例如，BAP,MHA)；貼?-內(nèi)酰胺類紙片(例如,苯唑西林,頭孢西丁)；孵育過夜；測試抑菌圈周圍的細(xì)菌；如果β-內(nèi)酰胺酶陽性,報(bào)告青霉素R。PosNeg第二十七頁，共54頁。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）ESBLs是指由質(zhì)粒介導(dǎo)的能水解青霉素類、頭孢菌素類和單環(huán)內(nèi)酰胺類氨曲南的一類酶；ESBLs不能水解頭霉素類和碳青霉烯類藥物，能被克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦等內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制；ESBLs主要見于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，此外也見于腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、沙雷菌屬等其他腸桿菌科細(xì)菌、不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌。第二十八頁，共54頁。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）紙片法，出現(xiàn)以下一種情況即可懷疑該菌株產(chǎn)生ESBL（篩選陽性）：頭孢泊肟≤17mm頭孢他啶≤22mm頭孢噻肟≤27mm頭孢曲松≤25mm氨曲南≤27mm第二十九頁，共54頁。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）紙片法（表型確認(rèn)試驗(yàn)）頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸。任一復(fù)方制劑的抑菌圈直徑與相應(yīng)單藥抑菌圈直徑相差≥5mm時(shí)，即可判斷該菌產(chǎn)ESBL。第三十頁，共54頁。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）稀釋法，出現(xiàn)以下一種情況即可懷疑該菌株產(chǎn)生ESBL：頭孢他啶或頭孢噻肟或頭孢曲松或氨曲南MIC≥2mg/mL或頭孢泊肟MIC≥8mg/mL

第三十一頁，共54頁。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）稀釋法（表型確認(rèn)試驗(yàn)）頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸。任何一組酶抑制劑復(fù)方制劑的MIC值比相應(yīng)單藥的MIC降低3個(gè)稀釋度者即可判定該菌為產(chǎn)ESBL菌株。

第三十二頁，共54頁。AmpC酶的特征AmpC酶是在革蘭陰性菌中發(fā)現(xiàn)的由染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)的水解頭孢菌素的Ⅰ型β內(nèi)酰胺酶，可分為誘導(dǎo)酶和非誘導(dǎo)酶。與ESBLs不同的是，AmpC酶對三代頭孢菌素耐藥但對四代頭孢菌素敏感且不被酶抑制劑克拉維酸所抑制，但其酶活性可被氯唑西林和硼酸抑制。第三十三頁，共54頁。AmpC酶的檢測方法頭孢西丁三維試驗(yàn)是檢測AmpC酶的經(jīng)典方法；除此之外，還有以硼酸化合物為抑制劑檢測肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的AmpC酶、AmpCDisk、頭孢西丁瓊脂基礎(chǔ)法等。第三十四頁，共54頁。碳青霉烯酶碳青霉烯酶可以定義為具有水解碳青霉烯類抗生素活性的β-內(nèi)酰胺酶，主要分布于β-內(nèi)酰胺酶A、B、D類中。根據(jù)水解機(jī)制中作用位點(diǎn)的不同可以將碳青霉烯酶分為兩大類：一類稱為金屬碳青霉烯酶，這類酶以金屬鋅離子為活性作用位點(diǎn)，可以被EDTA抑制，屬于B類β-內(nèi)酰胺酶；另一類以絲氨酸（Ser）為酶的活性作用位點(diǎn)，可以被酶抑制劑克拉維酸和他唑巴坦所抑制，屬于A、D類β-內(nèi)酰胺酶。第三十五頁，共54頁。碳青霉烯酶A類酶B類酶D類酶染色體編碼：SMENMCIMI質(zhì)粒編碼：KPCGES質(zhì)粒編碼OXA-23OXA-24OXA-51OXA-58OXA-55OXA-48OXA-50OXA-60OXA-62金屬酶，位于GMEs上，包括VIM，IMP，GIM，SPM，SIM等可以被酶抑制劑抑制可以被EDTA抑制第三十六頁，共54頁。碳青霉烯酶表型檢測方法-改良hodge試驗(yàn)ATCC25922，0.5麥?zhǔn)希?:10稀釋涂MH平板平皿中心貼10μg

厄他培南或亞胺培南紙片10μl環(huán)挑取3～5個(gè)菌落從平板中心紙片邊緣向平板邊緣劃線被測菌株與大腸埃希菌ATCC25922抑菌環(huán)交匯處大腸埃希菌生長增強(qiáng)，即產(chǎn)碳青霉烯酶。第三十七頁，共54頁。改良hodge試驗(yàn)的結(jié)果判讀第三十八頁，共54頁。金屬酶表型檢測方法：EDTA協(xié)同試驗(yàn)用0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇郎y菌懸液涂布MH平板。貼IMP(10μg)紙片．距其1cm處貼EDTA紙片（0.5mol/L4μl）。35℃過夜培養(yǎng)。亞胺培南抑菌圈在靠近加EDTA紙片側(cè)明顯擴(kuò)大者為產(chǎn)金屬酶菌株。

亞胺培南EDTA10mm第三十九頁，共54頁。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）攜帶SCCmec基因盒。SCCmec基因盒中的MecA基因編碼修飾的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a，這種蛋白對甲氧西林和其他的β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力下降，從而導(dǎo)致對這些抗生素的耐藥。耐甲氧西林葡萄球菌第四十頁，共54頁。耐甲氧西林葡萄球菌的檢測MRSA的檢測方法有頭孢西丁紙片擴(kuò)散法、苯唑西林瓊脂稀釋法、乳膠凝膠試驗(yàn)檢測PBP2a、mecA基因測定及MRSA顯色培養(yǎng)基。頭孢西丁紙片法、苯唑西林瓊脂稀釋法是目前檢測耐甲氧西林葡萄球菌最常用篩選方法。對于金黃色葡萄球菌，MRSA的檢測可以使用苯唑西林紙片，但對于凝固酶陰性葡萄球菌則不能使用苯唑西林紙片。

第四十一頁，共54頁。凝固酶陰性葡萄球菌中苯唑西林MIC結(jié)果的報(bào)告策略*苯唑西林MIC(μg/ml)進(jìn)行mecA或PBP2a或頭孢西丁紙片擴(kuò)散≤0.25≥4.00.5-2.0報(bào)告苯唑西林敏感報(bào)告苯唑西林耐藥陰性陽性報(bào)告苯唑西林敏感報(bào)告苯唑西林耐藥*檢測無菌部位感染的非表皮葡萄球菌菌株第四十二頁，共54頁?？肆置顾卣T導(dǎo)耐藥試驗(yàn)第四十三頁，共54頁?？肆置顾卣T導(dǎo)耐藥葡萄球菌紅霉素*耐藥的金葡菌或凝固酶陰性葡萄球菌可對克林霉素結(jié)構(gòu)性或誘導(dǎo)性耐藥或僅對紅霉素耐藥。

*或其他大環(huán)內(nèi)酯類第四十四頁，共54頁。機(jī)制耐藥基因紅霉素克林霉素核糖體修飾-藥物不能結(jié)合于靶位ermRS*RR結(jié)構(gòu)性泵-藥物被泵出msrARSerm =erythromycinribosomemethylasemsrA =macrolidestreptograminresistance*需要誘導(dǎo)來顯示耐藥性

紅霉素/克林霉素耐藥葡萄球菌耐藥機(jī)制第四十五頁，共54頁。誘導(dǎo)性克林霉素耐藥（erm介導(dǎo)）葡萄球菌-“D試驗(yàn)”患者不會(huì)對克林霉素有反應(yīng)-報(bào)告克林霉素耐藥無克林霉素誘導(dǎo)（msrA介導(dǎo)）真的克林霉素敏感-報(bào)告克林霉素敏感“D”陽性陰性15～26mm第四十六頁，共54頁。葡萄球菌誘導(dǎo)性克林霉素耐藥的MIC檢測方法4.0 μg/ml紅霉素0.5 μg/ml克林霉素Nogrowth=無誘導(dǎo)性克林霉素耐藥生長=誘導(dǎo)性克林霉素耐藥第四十七頁，共54頁。對于紅霉素耐藥，克林霉素敏感的葡萄球菌，需檢測誘導(dǎo)性克林霉素耐藥注意試驗(yàn)適用于金葡菌和凝固酶陰性葡萄球菌(苯唑西林敏感和耐藥株)；對于CoNS，該試驗(yàn)不必常規(guī)開展因?yàn)榭肆置顾睾苌儆糜谥委熌堂戈幮云咸亚蚓淮蠖鄶?shù)醫(yī)院相關(guān)MRSA是克林霉素耐藥的；大多數(shù)社區(qū)相關(guān)MRSA是克林霉素敏感的(