微生物培養(yǎng)檢驗技術(shù)第1頁/共22頁第十章微生物學(xué)培養(yǎng)檢驗技術(shù)

樣品的采集采樣：指從待檢物中采取少量具代表性的樣品供分析檢驗用。一、采樣要求1、采樣前，準(zhǔn)備好滅菌的容器及采樣工具。2、無菌采樣3、用無菌紙袋或玻璃器皿存放樣品4、樣品及時封口，并做好記錄5、及時送檢第2頁/共22頁二、采集方法1、面包、糕點、方便食品采集方法：取原包裝，用無菌鑷子夾下包裝紙采取外部及中心部位檢樣共200g，帶餡糕點直接采取外皮與內(nèi)陷25g。檢樣處理：無菌稱檢樣25g，加入225ml無菌生理鹽水中制成菌懸液。2、豆制品樣品采集：采取接觸盛器邊緣、底部及上面不同部位樣品200g放入滅菌容器內(nèi)。檢樣處理：無菌稱樣25g，放入225ml無菌水中混勻。第3頁/共22頁3、乳及乳制品（1）樣品采集散裝或大型包裝：用滅菌刀、勺取樣，每件不少于200g，及時送檢。大型包裝：采用整件原包裝，每件樣品采集量為瓶裝：1瓶袋裝：1袋罐裝：1罐(2）檢樣處理鮮奶、酸奶：無菌手續(xù)去紙蓋，瓶口火焰消毒后無菌吸取25ml放入225ml無菌生理鹽水中混勻。煉乳：將瓶或罐用溫水洗凈，用點燃的酒精棉球消毒，無菌開罐器開瓶后，無菌稱25g(ml)放入225ml無菌生理鹽水中混勻。第4頁/共22頁奶油：無菌開包，取適量于滅菌△瓶內(nèi),45℃水浴溶解（溫箱），立即吸25ml225ml生理鹽水中十倍稀釋（45℃水溶中保溫）。從檢樣融化到接種完畢不應(yīng)超過30分鐘。奶粉：罐裝的同煉乳。袋裝的用75%酒精棉球涂擦消毒袋口，無菌開封取樣25g，放入含玻珠的△瓶中,將225ml溫?zé)嵘睇}水徐徐加入，防結(jié)塊。奶酪：用滅菌刀削去部分表面封蠟，再用點燃的酒精棉球消毒表面后，用滅菌刀切開后，用無菌刀取表層及深層檢樣少許，置滅菌乳缽內(nèi)搗碎，加少許生理鹽水調(diào)成糊狀。第5頁/共22頁4、蛋及蛋制品（1）樣品采集鮮蛋：用流水沖洗外殼，再用95%酒精棉球涂擦消毒后，放入滅菌袋內(nèi)，加封作好標(biāo)記送檢。全蛋粉、蛋黃粉、蛋白片：將包裝開口處用75%酒精棉球消毒再開蓋，用滅菌的金屬制雙層螺旋式套管采樣器斜角插入箱底，使套管旋轉(zhuǎn)收取檢樣，提出箱外用滅菌小匙自上、中、下部取樣，裝入滅菌廣口瓶中，每個檢樣不少于100克。（2）檢樣處理鮮蛋外殼：①用無菌生理鹽水浸濕的棉拭充分擦試蛋殼，將棉拭直接放入培養(yǎng)基內(nèi)增菌培養(yǎng)。第6頁/共22頁②將整只鮮蛋用無菌水擦洗，以擦洗液作檢樣。鮮蛋蛋液：蛋殼流水下洗凈75%酒精消毒殼打蛋蛋粉：裝樣瓶浸入流動冷水中，檢樣融化后取出放入有玻珠的瓶中。5、肉及肉制品肉類包括鮮肉、凍肉、肉餡、禽肉等，肉制品指火腿、香腸等。第7頁/共22頁（1）樣品采集生肉：宰后用無菌刀取兩腿內(nèi)側(cè)肌肉各500克或劈半后兩側(cè)背最長肌各50克，立即送檢。家禽：用滅菌棉拭采胸腹各10cm2，背10cm2，四邊各5cm2其他熟制品：一般采200克。（2）檢樣處理生肉：表面消毒（沸水內(nèi)燙3—4秒或燒灼消毒）無菌剪取檢樣深層肌肉25克滅菌乳缽內(nèi)剪碎無菌玻璃砂研磨加滅菌水225ml熟肉、灌腸、肉松：直接稱25克放入滅菌乳缽內(nèi)無菌剪碎研磨加225ml無菌水棉拭液：凡用棉拭采取的檢樣作原液，搖勻后10倍稀釋第8頁/共22頁6、調(diào)味品（1）樣品采集醬油、食醋：瓶裝采取1瓶散裝無菌吸500ml醬類用滅菌勺子取500g味精采取一袋100g（2）檢樣處理瓶裝：酒精棉球消毒瓶口石碳酸紗布蓋好滅菌開瓶器開啟檢驗散裝：直接吸取接種醬類：無菌稱25g225ml無菌水第9頁/共22頁7、冷食品（1）樣品采集冷食菜：將樣品混勻，采樣200g瓶裝飲料：兩瓶為一件散裝采500ml冰淇凌：4杯為一件散裝采200g，放瓶內(nèi)冷藏或隔熱容器中食用冰塊：食用冰塊取500g（2）檢樣處理冷食菜：25g+225ml無菌水中瓶裝飲料：點燃酒精棉球燒瓶口石碳酸紗布蓋好無菌開蓋第10頁/共22頁

樣品的微生物檢測方法一、感官檢驗1、色澤①微生物菌體本身的顏色。②微生物分泌的色素。③微生物的代謝產(chǎn)物促使食品發(fā)生化學(xué)變化。2、氣味不正常的氣味產(chǎn)生，如霉味臭、乙酸臭、胺臭、糞便臭、硫化氫臭、酯臭等。3、口味從口味的改變上反映出來如酸味、苦味及其它異味。4、組織狀態(tài)固體食品：變形、軟化、發(fā)粘、結(jié)塊、濕潤。例如魚肉因微生物作用使組織細(xì)胞破壞，細(xì)胞內(nèi)容物外溢而呈現(xiàn)肌肉松馳、彈性差，有時表面發(fā)粘。液體食品：渾濁、沉淀、浮膜、變稠、產(chǎn)氣。第11頁/共22頁二、樣品的微生物鏡檢直接對樣品進(jìn)行鏡檢。三、培養(yǎng)檢驗（一）培養(yǎng)基的選擇細(xì)菌肉湯蛋白胨培養(yǎng)基酵母用酵母菌培養(yǎng)基霉菌用霉菌培養(yǎng)基并加入細(xì)菌抑制劑（孟加拉紅70mg/100ml或鏈霉素4000μg/100ml）放線菌用高氏一號培養(yǎng)基第12頁/共22頁（二）培養(yǎng)檢驗方法1、種植培養(yǎng)（1）方法：適用于粒狀或塊狀試樣的全菌和內(nèi)部菌分析①直接種植培養(yǎng)適于全菌分析。樣品不做任何處理，直接點植于平板培養(yǎng)基上。②表面消毒種植培養(yǎng)適于樣品的內(nèi)部菌分析。第13頁/共22頁（2）注意事項①用無菌鑷子夾取樣品均勻種植在培養(yǎng)皿上，微壓。②種植數(shù)?9-11cm培養(yǎng)皿5點或10點③塊將樣品切成1cm2×0.1-0.5cm,每皿3-5塊④貼標(biāo)簽，注明樣品名稱、日期、分析方法、培養(yǎng)細(xì)菌32℃1—2天；霉菌28℃5—7天結(jié)果分析計算菌的檢出率；某菌檢出率=檢出某菌的點數(shù)/種植培養(yǎng)總點數(shù)記錄培養(yǎng)特征；鏡檢形態(tài)特征第14頁/共22頁2、稀釋培養(yǎng)適用于菌量分析：外部菌、內(nèi)部菌及全菌（1）方法①洗滌稀釋適于粒狀或塊狀樣品外部菌分析②混合稀釋適于粉狀或流體試樣的全菌分析③搗碎稀釋用組織搗碎器或研缽將定量無菌水搗碎，試樣經(jīng)表面消毒后也可作內(nèi)部菌分析。（2）菌落計數(shù)①菌落計數(shù)時限細(xì)菌定溫培養(yǎng)1—2天酵母2—3天霉菌5—7天第15頁/共22頁②稀釋度選擇試用三個連續(xù)稀釋度，每稀釋度做2—4套平行平板。一般試樣：細(xì)菌檢測用10-2、10-3、10-4

真菌檢測用10-1、10-2、10-3③計數(shù)平板選擇選用同一稀釋度各皿的平均菌落數(shù)，細(xì)菌30—300間，真菌10—100間。④報告含菌量（單位重量或體積）=平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)÷取樣量（采用二位有效數(shù)字）第16頁/共22頁樣品的微生物學(xué)檢驗項目

一、細(xì)菌學(xué)檢驗（一）細(xì)菌總數(shù)的檢測細(xì)菌總數(shù)：指單位樣品（重量、體積、面積）中所含的細(xì)菌總數(shù)（雜菌數(shù)）1、細(xì)菌總數(shù)的意義①常作判定樣品被微生物污染程度的指標(biāo)。②預(yù)測樣品耐存放的程度和期限。③細(xì)菌越多，菌相越復(fù)雜，污染致病菌的機(jī)會越多。2、細(xì)菌總數(shù)的檢測方法檢樣稱?。?5克+225ml+玻珠）稀釋（十倍稀釋）平皿滴加（選用三個連續(xù)的稀釋度）培養(yǎng)基的平皿傾注（45-50℃10-15ml）培養(yǎng)（37℃倒置24-48小時）菌落計數(shù)報告第17頁/共22頁（二）大腸菌群及其衛(wèi)生學(xué)意義①大腸菌群——指一群37℃下24小時內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、好氧或兼性好氧的G（-）無芽孢短桿菌。②衛(wèi)生學(xué)意義作為理想的糞便污染指示菌，它具備A．腸道內(nèi)特有，顯示指示特性B．腸道內(nèi)數(shù)量大，易檢出C．腸外環(huán)境中抵抗力強(qiáng)D．少量存在也能檢出2、檢驗方法根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查表報告大腸菌群的近似數(shù)MPN(100ml或100克樣品中MostprobableNumber)EMB平板上大腸菌群菌落特征：深紫黑色、黑紫色、淡紫紅色。

第18頁/共22頁（三）致病性細(xì)菌的檢測主要指一些能引起人類食物中毒的細(xì)菌，主要有：沙門氏菌、大腸菌、肉毒梭菌、葡萄球菌。食品衛(wèi)生法中規(guī)定，這四種致病菌不得有檢出。目前，對樣品中病原菌進(jìn)行檢驗還存在一定的局限性。因借一種或少數(shù)幾種檢驗方法無法將多種病原菌全部檢出，而采用較多的檢驗方法在實際工作中又不現(xiàn)實。同時樣品種類多，所處的環(huán)境條件不一，污染致病菌的種類和數(shù)量也不一樣。但多數(shù)情況下，污染的病原菌數(shù)量不會太多（對環(huán)境的抵抗力弱），一般檢驗難以檢出，故進(jìn)行致病菌檢驗時只能根據(jù)食品的特點選一些致病菌作重點檢測對象。如：蛋粉、肉制品、凍肉禽類常確定沙門氏菌牛奶、罐藏食品常選肉毒桿菌。第19頁/共22頁二、真菌學(xué)檢驗（一）霉菌的測定1、稀釋培養(yǎng)法測全菌固樣——搗碎稀釋粉樣、流體樣——混合稀釋2、顯微鏡直接鏡檢法①血球計數(shù)器計數(shù)法②視野計數(shù)法吸管、載片、蓋玻等徹底消毒，用吸管準(zhǔn)確測出1ml菌液的滴數(shù)，并滴一滴