基因工程原理柯斯質(zhì)粒等其他高級(jí)載體1第1頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第五章柯斯質(zhì)粒等其他高級(jí)載體用于克隆大片段DNA的載體特殊用途的載體2第2頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四用于連入更長DNA片段的載體基因組繪圖與測序需要把更長(>18kb)的片段連入載體柯斯質(zhì)粒(cosmid)Fosmids噬菌體P1載體系統(tǒng)(bacteriophageP1vector)BAC(bacterialartificialchromosome)PAC(P1-derivedartificialchromosome)YAC(Yeastartificialchromosome)Mega-YAC3第3頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四4第4頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四柯斯質(zhì)粒載體“柯斯克隆”（cosmidcloning）的理論依據(jù)：在λphage線性DNA分子的每一端都具有彼此互補(bǔ)的單鏈突出序列，即所謂的粘性末端(cos位點(diǎn))λphage的多連體分子是由cos連接而成的。末端酶(terminase)或叫Ter體系——即λphage具有一種位點(diǎn)特異的切割體系(site-specificcuttingsystem).coscoscoscoscoscos5第5頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四柯斯質(zhì)粒載體中克隆的簡化示意圖6第6頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四7第7頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四8第8頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四柯斯載體的特點(diǎn)第一，具有λ噬菌體的特性。第二，具有質(zhì)粒載體的持性。第三，具有高容量的克隆能力。第四，具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。9第9頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四柯斯克隆技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)由于柯斯載體兼具了質(zhì)粒和λ噬菌體兩方面的特性，提高了克隆外源DNA片段的能力，可達(dá)45kb左右，因此對(duì)于構(gòu)建真核生物基因文庫是一種特別有用的克隆載體；應(yīng)用柯斯質(zhì)粒作克隆載體，所形成的非重組體的克隆本底比較低，從而提高了篩選具外源DNA的重組體質(zhì)粒的幾率。10第10頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四柯斯克隆技術(shù)的缺點(diǎn)由于經(jīng)核酸內(nèi)切酶切割作用產(chǎn)生的線性的柯斯質(zhì)粒載體，彼此間會(huì)通過分子內(nèi)重組形成多聚體分子。由于經(jīng)核酸內(nèi)切酶做局部消化的折合基因組產(chǎn)生出來的DNA片段，在隨后的連接反應(yīng)中，往往會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)或數(shù)個(gè)片段隨機(jī)連接在一起的情況。11第11頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四

缺點(diǎn)克服辦法

a.堿性磷酸酶的脫磷酸作用為克服上述的局限性，一般是在連接反應(yīng)之前，先用堿性磷酸酶對(duì)線性的柯斯質(zhì)粒DNA，使之脫磷酸，以阻止它們之間發(fā)生自連。b.電泳分部分離克服上述局限性的另一種較為有效的辦法是，在連接反應(yīng)前，先將局部消化的DNA進(jìn)行電泳分部分離，富集大分子量的片段(31-45Kb)，再同線性化的柯斯載體DNA連接。12第12頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四Ish-Horowicz-Burke柯斯克隆方案13第13頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四14第14頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四Bates-Swift柯斯克隆方案柯斯質(zhì)粒載體c2XB具有兩個(gè)被平末端限制酶SmaI分隔開來的cos位點(diǎn)。這些平末端在所用的條件下僅以極低的效率發(fā)生連接，因此可以有效的避免形成多個(gè)載體拷貝的重組子15第15頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四pWE和sCos系列的現(xiàn)代柯斯質(zhì)粒特征：對(duì)未經(jīng)大小選擇的DNA進(jìn)行簡單克隆的多克隆位點(diǎn)；在克隆位點(diǎn)旁邊的噬菌體啟動(dòng)子；克隆位點(diǎn)兩側(cè)的單一Not

I,SacI或SfiI位點(diǎn)，可將單一片段插入從載體上切除下來。如果需要向哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)移基因，載體上還可以包含編碼顯性選擇標(biāo)記的哺乳動(dòng)物表達(dá)元件。16第16頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四17第17頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四柯斯質(zhì)粒的替代者BAC和PAC18第18頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四噬菌體Pl19第19頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四BAC系統(tǒng)(細(xì)菌人工染色體)20第20頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四利用重組酶的體內(nèi)DNA重組技術(shù)21第21頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四載體的選擇22第22頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四特殊用途載體可用于產(chǎn)生測序所需的單鏈DNA的載體表達(dá)載體制備RNA探針的載體最大量合成蛋白質(zhì)的載體簡化蛋白純化的載體促進(jìn)表達(dá)蛋白溶解的載體促進(jìn)蛋白外運(yùn)的載體合而為一：組合了多種特性的載體23第23頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四制備RNA探針的載體24第24頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四制備RNA探針?biāo)玫腖ITMUS載體的結(jié)構(gòu)和用途25第25頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四26第26頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四表達(dá)載體Thebasesequenceofthe?10and?35regionsoffournaturalpromoters,twohybridpromoters,andtheconsensuspromoter.27第27頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四Structureofafactor-independenttranscriptionalterminator.28第28頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四影響克隆基因表達(dá)的因素29第29頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四對(duì)插入基因進(jìn)行可控表達(dá)30第30頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四克隆到pET載體中的基因表達(dá)調(diào)控策略31第31頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四ControlofclonedgeneexpressionusingtheλcIpromoter32第32頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四RegulationofthepBADpromoter.33第33頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四簡化蛋白純化的載體Structureofavector(pBAD/His,InvitrogenCorporation)designedfortheexpressionofaclonedgeneasafusionproteincontainingapolyhistidinesequence.34第34頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四融合標(biāo)簽及其抗體35第35頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四Purificationofaclonedgeneproductsynthesizedasafusiontothebiotincarboxylasecarrierprotein(tag).36第36頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四內(nèi)含肽，外含肽和蛋白切割37第37頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四與內(nèi)含肽融合合成的克隆基因產(chǎn)物的純化38第38頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四促進(jìn)表達(dá)蛋白溶解的載體要減少包