本文格式為Word版，下載可任意編輯——分子生物學(xué)課程教學(xué)講義朱玉賢四.C-value和Cot1/2

ThetotalamountofDNAinthehaploidgenomeisacharacteristicofeachlivingspeciesknownasC-value.

Cot1/2istheproductofconcentrationandtimerequiredfor50%reassociationgiveninnucleotide-moles×second/liter.

五、染色體結(jié)構(gòu)

DNAmoleculesarethelargestmacromoleculesinthecellandarecommonlypackagedintostructurescalled“chromosomes〞,mostbacteriaviruseshaveasinglechromosomewhereasEukaryoticcellsusuallycontainmany.

任何一條染色體上都帶有大量基因，一條高等生物的染色體上可能帶有成千上萬(wàn)個(gè)基因，一個(gè)細(xì)胞中的全部基因序列及其間隔序列統(tǒng)稱為genomes（基因組）。假使設(shè)想將人體細(xì)胞中的DNA分子繞地球一周，那么，每個(gè)堿基大約只占1－5厘米，而一個(gè)2－3kb的基因只相當(dāng)于地球上一條數(shù)十米長(zhǎng)，數(shù)厘米寬的線段！

Genotype(基因型)：Thegeneticconstitutionofagivenorganism(指某個(gè)特定生物體細(xì)胞內(nèi)的全部遺傳物質(zhì))。

Phenotype(表現(xiàn)型)：Visiblepropertyofanygivenorganism(某個(gè)特定生物體中可觀測(cè)到的物理或生理現(xiàn)象)。

Mutations：染色體DNA中可遺傳的核苷酸序列變化。

六、染色體的組成

1．染色質(zhì)和核小體

染色質(zhì)DNA的Tm值比自由DNA高，說(shuō)明在染色質(zhì)中DNA極可能與蛋白質(zhì)分子相互作用；在染色質(zhì)狀態(tài)下，由DNA聚合酶和RNA聚合酶催化的DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活性大大低于在自由DNA中的反應(yīng)；DNA酶I（DNaseI）對(duì)染色質(zhì)DNA的消化遠(yuǎn)遠(yuǎn)慢于對(duì)純DNA的作用。染色質(zhì)的電子顯微鏡圖顯示出由核小體組成的念珠狀結(jié)構(gòu)，可以看到由一條細(xì)絲連接著的一連串直徑為10nm的球狀體。

核小體是由H2A、H2B、H3、H4各兩個(gè)分子生成的八聚體和由大約200bpDNA組成的。八聚體在中間，DNA分子盤繞在外，而H1則在核小體的外面。每個(gè)核小體只有一個(gè)H1。在核小體中DNA盤繞組蛋白八聚體核心，從而使分子收縮成1/7，200bpDNA的長(zhǎng)度約為68nm，卻被壓縮在10nm的核小體中。但是，人中期染色體中含3.3×109堿基對(duì)，其理論長(zhǎng)度應(yīng)是180cm，這么長(zhǎng)的DNA被包含在46個(gè)51μm長(zhǎng)的圓柱體（染色體）中，其壓縮

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比約為104。

2．染色體中的核酸組成

⑴不重復(fù)序列在單倍體基因組里，這些序列一般只有一個(gè)或幾個(gè)拷貝，它占DNA總量的40%－80%。不重復(fù)序列長(zhǎng)約750－2000dp，相當(dāng)于一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的長(zhǎng)度。單拷貝基因通過(guò)基因擴(kuò)增仍可合成大量的蛋白質(zhì)，如一個(gè)蠶絲心蛋白基因可作為模板合成104個(gè)絲心蛋白mRNA，每個(gè)mRNA可存活4d，共合成105個(gè)絲心蛋白，這樣，在幾天之內(nèi)，一個(gè)單拷貝絲心蛋白基因就可以合成109個(gè)絲心蛋白分子。

⑵中度重復(fù)序列這類重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)在10－104之間，占總DNA的10%－40%。各種rRNA、tRNA及組蛋白基因等都屬這一類。

非洲爪蟾的18S、5.8S及28SrRNA基因是連在一起的，中間隔著不轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)，這些單位在DNA鏈上串聯(lián)重復(fù)約5000次。在卵細(xì)胞形成過(guò)程中這些基因可進(jìn)行幾千次不同比例的復(fù)制，產(chǎn)生2×106個(gè)拷貝，使rDNA占卵細(xì)胞DNA的75%，從而使該細(xì)胞能積累1012個(gè)核糖體。

⑶高度重復(fù)序列——衛(wèi)星DNA這類DNA只在真核生物中發(fā)現(xiàn)，占基因組的10%—60%，由6—100個(gè)堿基組成，在DNA鏈上串聯(lián)重復(fù)幾百萬(wàn)次。由于堿基的組成不同，在CsCl密度梯度離心中易與其他DNA分開(kāi)，形成含量較大的主峰及高度重復(fù)序列小峰，后者又稱衛(wèi)星區(qū)帶（峰）。

高等真核生物DNA無(wú)論從結(jié)構(gòu)還是功能看都極為繁雜，以小鼠為例：

1.小鼠總DNA的10％是小于10bp的高度重復(fù)序列，重復(fù)數(shù)十萬(wàn)到上百萬(wàn)次/genome。2.總DNA的20％是重復(fù)數(shù)千次、長(zhǎng)約數(shù)百bp的中等重復(fù)序列。

3.總DNA的70％是不重復(fù)或低重復(fù)序列,絕大部分功能基因都位于這類序列中。

Centromere：是細(xì)胞有絲分裂期間紡錘體蛋白質(zhì)與染色體的結(jié)合位點(diǎn)（attachmentpoint），這種結(jié)合對(duì)于染色體對(duì)在子細(xì)胞中的有序和平均分派至關(guān)重要。在酵母中，centromere的功能單位長(zhǎng)約130bp，富含AT堿基對(duì)。在高等真核細(xì)胞中，centromere都是由長(zhǎng)約5－10bp、方向一致的高度重復(fù)序列所組成。

TelomeresaresequencesattheendsofeukaryoticChromosomesthathelpstabilizethem。酵母Telomeres一般以100bp左右不確切重復(fù)序列所組成。5’(TxGy)n3’(AxCy)n

其中X、Y一般為1－4，單細(xì)胞真核生物中n常為20－100，高等真核生物中1500。

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染色體末端的線性重復(fù)序列不能被DNApolymarase所確鑿復(fù)制，它們一般在DNA復(fù)制完成以后由telomarase合成后加到染色體末端。

Alu（長(zhǎng)約300bp）是人類高度重復(fù)序列,由于該序列中帶有AluI的識(shí)別序列而得名。數(shù)十萬(wàn)個(gè)

Alu

重

復(fù)

序

列散

布

于整

個(gè)

人類

class=\

href=\基因組\基因組中，達(dá)到總序列的1－3％。Alu與其它高度重復(fù)序列共占人類DNA的10％以上。

3．染色體中的蛋白質(zhì)

染色體上的蛋白質(zhì)包括組蛋白和非組蛋白。組蛋白是染色體的結(jié)構(gòu)蛋白，它與DNA組成核小體。尋?？梢杂?mol/LNaCl或0.25mol/L的HCl/H2SO4處理使組蛋白與DNA分開(kāi)。組蛋白分為H1、H2A、H2B、H3及H4。這些組蛋白都含有大量的賴氨酸和精氨酸，其中H3、H4富含精氨酸，H1富含賴氨酸；H2A、H2B介于兩者之間。⑴組蛋白的一般特性

1>、進(jìn)化上的極端保守性。牛、豬、大鼠的H4氨基酸序列完全一致。牛的H4序列與豌豆序列相比只有兩個(gè)氨基酸的差異（豌豆H4中的異亮氨基酸60→纈氨酸60，精氨酸→賴氨酸）。H3的保守性也很大，鯉魚(yú)與小牛胸腺的H3只差一個(gè)氨基酸，小牛胸腺與豌豆H3只差4個(gè)氨基酸。

2>、無(wú)組織特異性。到目前為止，僅發(fā)現(xiàn)鳥(niǎo)類、魚(yú)類及兩棲類紅細(xì)胞染色體不含H1而帶有H5，精細(xì)胞染色體的組蛋白是魚(yú)精蛋白。

3>、肽鏈上氨基酸分布的不對(duì)稱性。堿性氨基酸集中分布在N端的半條鏈上。例如，N端的半條鏈上凈電荷為+16，C端只有+3，大部分疏水基團(tuán)都分布在C端。組蛋白的修飾作用。包括甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。⑵非組蛋白的一般特性

染色體上除了存在大約與DNA等量的組蛋白以外，還存在大量的非組蛋白。非組蛋白的多樣性。非組蛋白的量大約是組蛋白的60%～70%，但它的種類卻好多，約在20-100種之間，其中常見(jiàn)的有15-20種。非組蛋白的組織專一性和種屬專一性。(3)幾類常見(jiàn)的非組蛋白

a.HMG蛋白（highmobilitygroupprotein）。這是一類能用低鹽（0.35mol/LNaCl）溶液抽提、能溶于2%的三氯乙酸、相對(duì)分子質(zhì)量較低的非組蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量都在3.0×104以下。

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b.DNA結(jié)合蛋白。用2mol/LNaCl除去全部組蛋白和70%非組蛋白后，還有一部分蛋白必需用2mol/LNaCl和5mol/L尿素才能與DNA解離。這些蛋白分子量較低，約占非組蛋白的20%，染色質(zhì)的8%。

七.原核與真核染色體DNA比較

原核生物中一般只有一條染色體且大都帶有單拷貝基因，只有很少數(shù)基因〔如rRNA基因〕是以多拷貝形式存在；

整個(gè)染色體DNA幾乎全部由功能基因與調(diào)控序列所組成；幾乎每個(gè)基因序列都與它所編碼的蛋白質(zhì)序列呈線性對(duì)應(yīng)狀態(tài)。ViralDNAmoleculesarerelativelysmallHIV=9000ntRNAQβ=4200nt

BactariaDNAis100timesthanviralE.coli4639221bpdouble-stranded

Contourlength=1.7mm,850倍細(xì)菌本身長(zhǎng)度。細(xì)菌中往往帶有質(zhì)粒DNA。Eucaryoticcells

果蠅帶有25倍于E.Coli的DNA,人類帶有600倍于E.Coli的DNA.EucaryoticDNA中基因密度明顯低于原核和病毒。如人DNA中平均每毫米只帶有50個(gè)基因,而E.Coli中基因密度每毫米DNA帶有2400個(gè)基因！一個(gè)人細(xì)胞中所帶有的DNA約有2m/1.7mm細(xì)菌。成人帶有1X10^14個(gè)細(xì)胞，成人體內(nèi)全部DNA的總長(zhǎng)度（ContourLength）＝2X10^11Km第三講

蛋白質(zhì)合成

一.基因與基因表達(dá)的一般概念

基因作為唯一能夠自主復(fù)制、永久存在的單位，其生理學(xué)功能以蛋白質(zhì)形式得到表達(dá)。DNA序列是遺傳信息的貯存者，它通過(guò)自主復(fù)制得到永存，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄生成mRNA，翻譯生成蛋白質(zhì)的過(guò)程控制所有生命現(xiàn)象。

編碼鏈（codingstrand）又稱sensestrand，是指與mRNA序列一致的那條鏈。非編碼鏈（anticodingstrand），又稱antisensestrand，是指那條根據(jù)堿基互補(bǔ)原則指導(dǎo)mRNA生物合成的DNA鏈。

Geneticinformationisperpetuatedbyreplication（復(fù)制）inwhichadouble-strandednucleicacidisduplicatedtogiveidenticalcopies.

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基因表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄（transcription）和翻譯（translation）兩個(gè)階段。轉(zhuǎn)錄是指拷貝出一條與DNA鏈序列完全一致（除了T→U之外）的RNA單鏈的過(guò)程，是基因表達(dá)的核心步驟。翻譯是指以新生的mRNA為模板，把核苷酸三聯(lián)子遺傳密碼翻譯成氨基酸序列、合成蛋白質(zhì)多肽鏈的過(guò)程，是基因表達(dá)的最終目的。

只有mRNA所攜帶的遺傳信息才被用來(lái)指導(dǎo)蛋白質(zhì)生物合成，所以人們一般用U、C、A、G這4種核苷酸而不是T、C、A、G的組合來(lái)表示遺傳性狀。所謂翻譯是指將mRNA鏈上的核苷酸從一個(gè)特定的起始位點(diǎn)開(kāi)始，按每3個(gè)核苷酸代表一個(gè)氨基酸的原則，依次合成一條多肽鏈的過(guò)程。

二.遺傳密碼——三聯(lián)子

mRNA上每3個(gè)核苷酸翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的一個(gè)氨基酸，這3個(gè)核苷酸就稱為一個(gè)密碼，也叫三聯(lián)子密碼。翻譯時(shí)從起始密碼子AUG開(kāi)始，沿mRNA5’→3’的方向連續(xù)閱讀直到終止密碼子，生成一條具有特定序列的多肽鏈。

mRNA中只有4種核苷酸，而蛋白質(zhì)中有20種氨基酸，若以一種核苷酸代表一種氨基酸，只能代表4種(41=4)。若以兩種核苷酸作為一個(gè)密碼（二聯(lián)子），能代表42=16種氨基酸。而假定以3個(gè)核苷酸代表一個(gè)氨基酸，則可以有43=64種密碼，滿足了編碼20種氨基酸的需要。

50-60年代破譯遺傳密碼方面的三項(xiàng)重要成果：

（1）PaulZamecnik等人證明細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所。他們把放射性標(biāo)記的氨基酸注射到大鼠體內(nèi)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后收獲其肝臟，進(jìn)行蔗糖梯度沉淀并分析各種細(xì)胞成份中的放射性蛋白質(zhì)。

假使注射后經(jīng)數(shù)小時(shí)（或數(shù)天）收獲肝臟，所有細(xì)胞成份中都帶有放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì);假使注射后幾分鐘內(nèi)即收獲肝臟，那么，放射性標(biāo)記只存在于含有核糖體顆粒的細(xì)胞質(zhì)成份中。

（2）FrancisCrick等人第一次證明只有用三聯(lián)子密碼的形式才能把包含在由AUGC四個(gè)字母組成遺傳信息（核酸）確鑿無(wú)誤地翻譯成由20種不同氨基酸組成的蛋白質(zhì)序列，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的表達(dá)。試驗(yàn)1:

用吖啶類試劑（誘導(dǎo)核苷酸插入或丟失）處理T4噬菌體rII位點(diǎn)上的兩個(gè)基因，使之發(fā)生移碼突變（frame-shift），就生成完全不同的、沒(méi)有功能的蛋白質(zhì)。試驗(yàn)2:

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研究煙草壞死衛(wèi)星病毒發(fā)現(xiàn)，其外殼蛋白亞基由400個(gè)氨基酸組成，相應(yīng)的RNA片段長(zhǎng)1200個(gè)核苷酸，與密碼三聯(lián)子體系正好相吻合。試驗(yàn)3:

以均聚物為模板指導(dǎo)多肽的合成。在含有tRNA、核糖體、AA-tRNA合成酶及其它蛋白質(zhì)因子的細(xì)胞抽提物中參與mRNA或人工合成的均聚物作為模板以及ATP、GTP、氨基酸等成分時(shí)又能合成新的肽鏈，新生肽鏈的氨基酸順序由外加的模板來(lái)決定。

1961年，Nirenberg等以poly（U）作模板時(shí)發(fā)現(xiàn)合成了多聚苯丙氨酸，從而推出UUU代表苯丙氨酸（Phe）。以poly（C）及poly（A）做模板分別得到多聚脯氨酸和多聚賴氨酸。試驗(yàn)4:

以特定序列的共聚物為模板指導(dǎo)多肽的合成。以多聚二核苷酸作模板可合成由2個(gè)氨基酸組成的多肽，

5'?UGUGUGUGUGUGUGUGUG?3',不管讀碼從U開(kāi)始還是從G開(kāi)始，都只能有UGU（Cys）及GUG（Val）兩種密碼子。試驗(yàn)5:

以共聚三核苷酸作為模板可得到有3種氨基酸組成的多肽。如以多聚（UUC）為模板，可能有3種起讀方式：5’?UUCUUCUUCUUCUUC?3’或5’?UCUUCUUCUUCUUCU?3’或5'?CUUCUUCUUCUUCUU?3'分別產(chǎn)生UUC（Phe）、UCU（Ser）或CUU（Leu）.

多聚三核苷酸為模板時(shí)也可能只合成2種多肽：5’?GUAGUAGUAGUAGUA?3’或5’?UAGUAGUAGUAGUAG?3’或5’?AGUAGUAGUAGUAGU?3’由其次種讀碼方式產(chǎn)生的密碼子UAG是終止密碼，不編碼任何氨基酸，因此，只產(chǎn)生GUA（Val）或AGU（Ser）。試驗(yàn)6:

以隨機(jī)多聚物指導(dǎo)多肽合成。Nirenberg等及Ochoa等又用各種隨機(jī)的多聚物作模板合成多肽。例如，以只含A、C的多聚核苷酸作模板，任意排列時(shí)可出現(xiàn)8種三聯(lián)子，即CCC、CCA、CAC、ACC、CAA、ACA、AAC、AAA，獲得由Asn、His、Pro、Gln、Thr、Lys等6種氨基酸組成的多肽。

（3）氨基酸的“活化〞與核糖體結(jié)合技術(shù)。

假使把氨基酸與ATP和肝臟細(xì)胞質(zhì)共培養(yǎng)，氨基酸就會(huì)被固定在某些熱穩(wěn)定且可溶性RNA分子（transferRNA，tRNA）上?，F(xiàn)將氨基酸活化后的產(chǎn)物稱為氨基酰-tRNA

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（aminoacyl-tRNA），并把催化該過(guò)程的酶稱為氨基酰合成酶（aminoacyl-tRNASynthetase）。以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等為模板，在含核糖體、AA-tRNA的反應(yīng)液中保溫后通過(guò)硝酸纖維素濾膜，只有游離的AA-tRNA因相對(duì)分子質(zhì)量小而通過(guò)濾膜，而核糖體或與核糖體結(jié)合的AA-tRNA則留在濾膜上，這樣可把已結(jié)合與未結(jié)合的AA-tRNA分開(kāi)。

當(dāng)體系中帶有多聚核苷酸模板時(shí)，從大腸桿菌中提取的核糖體經(jīng)常與特異性氨基酰-tRNA相結(jié)合。假使把核糖體與poly（U）和Phe-tRNAPhe共溫育，核糖體就能同時(shí)與poly（U）和Phe-tRNAPhe相結(jié)合。

4種核苷酸組成61個(gè)編碼氨基酸的密碼子和3個(gè)終止密碼子，它們不能與tRNA的反密碼子配對(duì)，但能被終止因子或釋放因子識(shí)別，終止肽鏈的合成。由一種以上密碼子編碼同一個(gè)氨基酸的現(xiàn)象稱為簡(jiǎn)并（degeneracy），對(duì)應(yīng)于同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子（synonymouscodon）。

三．密碼子和反密碼子的相互作用

蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程中，tRNA的反密碼子通過(guò)堿基的反向配對(duì)與mRNA的密碼子相互作用。1966年，Crick根據(jù)立體化學(xué)原理提出搖擺假說(shuō)（wobblehypothesis），解釋了反密碼子中某些稀有成分如I以及大量有2個(gè)以上同源密碼子的配對(duì)問(wèn)題。Wobblehypothesis

①任意一個(gè)密碼子的前兩位堿基都與tRNAanticodon中的相應(yīng)堿基形成Watson-Crick堿基配對(duì)。

②反密碼子第一位是A或C時(shí)，只能識(shí)別一個(gè)密碼子。當(dāng)反密碼子第一位是U或G時(shí)，能識(shí)別兩個(gè)密碼子。當(dāng)Inosine（I）作為反密碼子第一位時(shí)，能識(shí)別三個(gè)密碼子。③假使數(shù)個(gè)密碼子同時(shí)編碼一個(gè)氨基酸，凡是第一、二位堿基不一致的密碼子都對(duì)應(yīng)于各自的tRNA。

④根據(jù)上述規(guī)則，至少需要32種不同的tRNA才能翻譯61個(gè)密碼子。四．tRNA

tRNA在蛋白質(zhì)合成中處于關(guān)鍵地位，被稱為其次遺傳密碼。它不但為將每個(gè)三聯(lián)子密碼翻譯成氨基酸提供了接合體，還為確鑿無(wú)誤地將所需氨基酸運(yùn)輸?shù)胶颂求w上提供了載體。所有的tRNA都能夠與核糖體的P位點(diǎn)和A位點(diǎn)結(jié)合，此時(shí)，tRNA分子三葉草型頂端突起部位通過(guò)密碼子：反密碼子的配對(duì)與mRNA相結(jié)合，而其3’末端恰好將所轉(zhuǎn)運(yùn)的氨基酸送到正在延伸的多肽上。代表一致氨基酸的tRNA稱為同工tRNA。在一個(gè)同工tRNA組內(nèi)，

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所有tRNA均專一于一致的氨基酰-tRNA合成酶。1、tRNA的三葉草型二級(jí)結(jié)構(gòu)

受體臂（acceptorarm）主要由鏈兩端序列堿基配對(duì)形成的桿狀結(jié)構(gòu)和3’端末配對(duì)的3-4個(gè)堿基所組成，其3’端的最終3個(gè)堿基序列永遠(yuǎn)是CCA，最終一個(gè)堿基的3’或2’自由羥基（—OH）可以被氨?；?。TφC臂是根據(jù)3個(gè)核苷酸命名的，其中φ表示擬尿嘧啶，是tRNA分子所擁有的不常見(jiàn)核苷酸。反密碼子臂是根據(jù)位于套索中央的三聯(lián)反密碼子命名的。D臂是根據(jù)它含有二氫尿嘧啶（dihydrouracil）命名的。

最常見(jiàn)的tRNA分子有76個(gè)堿基，相對(duì)分子質(zhì)量約為2.5×104。不同的tRNA分子可有74-95個(gè)核苷酸不等，tRNA分子長(zhǎng)度的不同主要是由其中的兩條手臂引起的。tRNA的稀有堿基含量十分豐富，約有70余種。每個(gè)tRNA分子至少含有2個(gè)稀有堿基，最多有19個(gè)，多數(shù)分布在非配對(duì)區(qū)，特別是在反密碼子3'端鄰近部位出現(xiàn)的頻率最高，且大多為嘌呤核苷酸。這對(duì)于維持反密碼子環(huán)的穩(wěn)定性及密碼子、反密碼子之間的配對(duì)是很重要的。2．tRNA的L形三級(jí)結(jié)構(gòu)

酵母和大腸桿菌tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)都呈L形折疊式。這種結(jié)構(gòu)是靠氫鍵來(lái)維持的，tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)與AA-tRNA合成酶的識(shí)別有關(guān)。受體臂和TφC臂的桿狀區(qū)域構(gòu)成了第一個(gè)雙螺旋，D臂和反密碼子臂的桿狀區(qū)域形成了其次個(gè)雙螺旋。

tRNA的L形高級(jí)結(jié)構(gòu)反映了其生物學(xué)功能，由于它上所運(yùn)載的氨基酸必需靠近位于核糖體大亞基上的多肽合成位點(diǎn)，而它的反密碼子必需與小亞基上的mRNA相配對(duì)，所以兩個(gè)不同的功能基團(tuán)最大限度分開(kāi)。3．tRNA的功能

轉(zhuǎn)錄過(guò)程是信息從一種核酸分子（DNA）轉(zhuǎn)移至另一種結(jié)構(gòu)上極為相像的核酸分子（RNA）的過(guò)程，信息轉(zhuǎn)移靠的是堿基配對(duì)。翻譯階段遺傳信息從mRNA分子轉(zhuǎn)移到結(jié)構(gòu)極不一致的蛋白質(zhì)分子，信息是以能被翻譯成單個(gè)氨基酸的三聯(lián)子密碼形式存在的，在這里起作用的是解碼機(jī)制。4．tRNA的種類

（1）起始tRNA和延伸tRNA

能特異地識(shí)別mRNA模板上起始密碼子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA統(tǒng)稱為延伸tRNA。原核生物起始tRNA攜帶甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA攜帶甲硫氨酸（Met）。（2）同工tRNA

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代表同一種氨基酸的tRNA稱為同工tRNA，同工tRNA既要有不同的反密碼子以識(shí)別該氨基酸的各種同義密碼，又要有某種結(jié)構(gòu)上的共同性，能被AA-tRNA合成酶識(shí)別。（3）校正tRNA

校正tRNA分為無(wú)義突變及錯(cuò)義突變校正。

在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因中，一個(gè)核苷酸的改變可能使代表某個(gè)氨基酸的密碼子變成終止密碼子（UAG、UGA、UAA），使蛋白質(zhì)合成提前終止，合成無(wú)功能的或無(wú)意義的多肽，這種突變就稱為無(wú)義突變。

五．AA-tRNA合成酶是一類催化氨基酸與tRNA結(jié)合的特異性酶，其反應(yīng)式如下：它實(shí)際上包括兩步反應(yīng)：

第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸復(fù)合物。AA+ATP+酶（E）→E-AA-AMP+PPi

其次步是氨酰基轉(zhuǎn)移到tRNA3’末端腺苷殘基上，與其2’或3’-羥基結(jié)合。E-AA-AMP+tRNA→AA-tRNA+E+AMP

蛋白質(zhì)合成的真實(shí)性主要決定于AA-tRNA合成酶是否能使氨基酸與對(duì)應(yīng)的tRNA相結(jié)合。AA-tRNA合成酶既要能識(shí)別tRNA，又要能識(shí)別氨基酸，它對(duì)兩者都具有高度的專一性。不同的tRNA有不同堿基組成和空間結(jié)構(gòu)，簡(jiǎn)單被tRNA合成酶所識(shí)別，困難的是這些酶如何識(shí)別結(jié)構(gòu)上十分相像的氨基酸。有兩道關(guān)口:

Thefirstfilteristheinitialbindingoftheaminoacidtotheenzymeanditsactivationtoaminoacyl-AMP.

Thesecondfilteristhebindingofincorrectaminoacyl-AMPproductstoaseparateactivesiteontheenzyme.

核糖體像一個(gè)能沿mRNA模板移動(dòng)的工廠，執(zhí)行著蛋白質(zhì)合成的功能。它是由幾十種蛋白質(zhì)和幾種核糖體RNA（ribosomalRNA，rRNA）組成的亞細(xì)胞顆粒。一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)約有20000個(gè)核糖體，而真核細(xì)胞內(nèi)可達(dá)106個(gè)，在未成熟的蟾蜍卵細(xì)胞內(nèi)則高達(dá)1012。核糖體和它的輔助因子為蛋白質(zhì)合成提供了必要條件。1.核糖體的組成

原核生物核糖體由約2/3的RNA及1/3的蛋白質(zhì)組成。真核生物核糖體中RNA占3/5，蛋白質(zhì)占2/5。核糖體是一個(gè)致密的核糖核蛋白顆粒，可以解離為兩個(gè)亞基，每個(gè)亞基都含有一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量較大的rRNA和大量不同的蛋白質(zhì)分子。

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大腸桿菌核糖體小亞基由21種蛋白質(zhì)組成，分別用S1??S21表示，大亞基由33種href=\蛋白質(zhì)組\蛋白質(zhì)組成，分別用L1??L33表示。真核生物細(xì)胞核糖體大亞基含有49種蛋白質(zhì)，小亞基有33種蛋白質(zhì)。2、rRNA3.核糖體的功能

核糖體包括至少5個(gè)活性中心，即mRNA結(jié)合部位、結(jié)合或接受AA-tRNA部位（A位）、結(jié)合或接受肽基tRNA的部位、肽基轉(zhuǎn)移部位（P位）及形成肽鍵的部位（轉(zhuǎn)肽酶中心），此外還有負(fù)責(zé)肽鏈延伸的各種延伸因子的結(jié)合位點(diǎn)。小亞基上擁有mRNA結(jié)合位點(diǎn)，負(fù)責(zé)對(duì)序列特異的識(shí)別過(guò)程，如起始位點(diǎn)的識(shí)別和密碼子與反密碼子的相互作用。大亞基負(fù)責(zé)氨基酸及tRNA攜帶的功能，如肽鍵的形成、AA-tRNA、肽基-tRNA的結(jié)合等。A位、P位、轉(zhuǎn)肽酶中心等主要在大亞基上。

核糖體可解離為亞基或結(jié)合成70S/80S顆粒。翻譯的起始階段需要游離的亞基，隨后才結(jié)合成70S/80S顆粒，繼續(xù)翻譯進(jìn)程。體外反應(yīng)體系中，核糖體的解離或結(jié)合取決于Mg2+離子濃度。在大腸桿菌內(nèi)，Mg2+濃度在10-3mol/L以下時(shí)，70S解離為亞基，濃度達(dá)10-2mol/L時(shí)則形成穩(wěn)定的70S顆粒。細(xì)胞中大多數(shù)核糖體處于非活性的穩(wěn)定狀態(tài)，單獨(dú)存在，只有少數(shù)與mRNA一起形成多聚核糖體。它從mRNA的5'末端向3'末端閱讀密碼子，至終止子時(shí)合成一條完整的多肽鏈。mRNA上核糖體的多少視mRNA的長(zhǎng)短而定，一般40個(gè)核苷酸有一個(gè)核糖體。七.信使核糖核酸

mRNAmessengerribonucleicacidDNAdeoxyribonucleicacid.

雖然mRNA在所有細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行著一致的功能，即通過(guò)三聯(lián)子密碼翻譯生成蛋白質(zhì)，其生物合成的具體過(guò)程和成熟mRNA的結(jié)構(gòu)在原核和真核生物細(xì)胞內(nèi)是不同的。八、蛋白質(zhì)的生物合成

核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所，mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板，tRNA是模板與氨基酸之間的接合體。此外，有20種以上的AA-tRNA及合成酶、10多種起始因子、延伸因子及終止因子，30多種tRNA及各種rRNA、mRNA和100種以上翻譯后加工酶參與蛋白質(zhì)合成和加工過(guò)程。

蛋白質(zhì)合成消耗了細(xì)胞中90%左右用于生物合成反應(yīng)的能量。細(xì)菌細(xì)胞中的2萬(wàn)個(gè)核

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糖體，10萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)因子和20萬(wàn)個(gè)tRNAs約占大腸桿菌干重的35%。在大腸桿菌中合成一個(gè)100個(gè)氨基酸的多肽只需5分鐘。1.蛋白質(zhì)生物合成的主要步驟：

翻譯的起始——核糖體與mRNA結(jié)合并與氨基酰-tRNA生成起始復(fù)合物。肽鏈的延伸——核糖體沿mRNA5’端向3’端移動(dòng)，導(dǎo)致從N端向C端的多肽合成。肽鏈的終止以及肽鏈的釋放——核糖體從mRNA上解離，準(zhǔn)備新一輪合成反應(yīng)。主要分為五步

1、ActivationofAminoAcids(Thisreactiontakesplaceinthecytosol,notontheribosome).2、Initiation.ThemRNAbearingthecodeforthepolypeptidebindstothesmallribosomalsubunitandtotheinitiatingaminoacyl-tRNA.3、Elongation.Peptidebondsareformedinthisstage.

4、TerminationandRelease.CompletionofthepolypeptidechainissignaledbyaterminationcodoninthemRNA.

5、FoldingandPosttranslationalProcessing.肽鏈延伸分為三步

①Bindingofanincomingaminoacyl-tRNA.②Peptidebondformation.③Translocation.

2.與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的因子

起始因子Initiationfactor（IF）延伸因子Elongationfactor（EF）終止因子。原核中有RF1-3。RF-1識(shí)別UAA和UAG;RF-2識(shí)別UAA和UGA;RF-3僅能促進(jìn)RF-1和RF-2的功能。終止因子行使功能時(shí)需要GTP。真核生物中只有一個(gè)RF，能識(shí)別3個(gè)終止子。3、蛋白質(zhì)合成的起始蛋白質(zhì)合成的起始復(fù)合物:30S核糖體小亞基模板mRNAfMet-tRNAfMet起始因子GTP

50S核糖體大亞基

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Mg2+

合成的起始可分為三步:

1、30S核糖體小亞基與起始因子IF–1和IF-3相結(jié)合，誘發(fā)模板mRNA與小亞基結(jié)合。2、由30S小亞基、起始因子IF–1和IF-3及模板mRNA所組成的復(fù)合物馬上與GTP-IF-2及fMet-tRNAfMet相結(jié)合。反密碼子與密碼子配對(duì)。

3、上述六組分復(fù)合物再與50S大亞基結(jié)合，水解GTP生成并釋放GDP和Pi。釋放三個(gè)起始因子。

表27-9真核細(xì)胞中參與翻譯起始的蛋白質(zhì)因子及其功能真核因子功能

eIF2促進(jìn)Met-tRNAMet與核糖體40S小亞基結(jié)合。eIF2BeIF3

是最早與核糖體40S小亞基結(jié)合的促進(jìn)因子，蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的正常進(jìn)行。

eIF4A具有RNA解旋酶活性，解除mRNA模板的次級(jí)結(jié)構(gòu)并使之與40S小亞基結(jié)合，形成eIF4F復(fù)合物。

eIF4B與mRNA模板相結(jié)合，協(xié)助核糖體掃描模板序列，定位AUG。eIF4E與mRNA5'的帽子結(jié)構(gòu)相結(jié)合，形成eIF4F復(fù)合物。

eIF4G與eIF4E和poly（A）結(jié)合蛋白（PAB）相結(jié)合，形成eIF4F復(fù)合物。

eIF5促使多個(gè)蛋白因子與40S小亞基解體，以此幫助大小亞基結(jié)合形成80核糖體，形成翻譯起始復(fù)合物。

eIF6促進(jìn)沒(méi)有蛋白質(zhì)合成活性的80S核糖體解離成40S和60S兩個(gè)亞基。4、肽鏈的延伸肽鏈延伸的基本要求是：有完整的起始復(fù)合物，有氨基酰-tRNA，

有延伸因子EF-Tu,EF-Ts和EF-G，有GTP。

肽鏈延伸也可被分為三步：

第一步，與新進(jìn)來(lái)的氨基酰-tRNA相結(jié)合。氨基酰-tRNA首先必需與GTP-EF-Tu復(fù)合物相結(jié)合，形成氨基酰-tRNA-GTP-EF-Tu復(fù)合物并與70S中的A位點(diǎn)相結(jié)合。此時(shí)，GTP

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水解并釋放GDP-EF-Tu復(fù)合物。

其次步，肽鍵形成。肽鍵形成之初，兩個(gè)氨基酸依舊分別與各自的tRNA相結(jié)合，依舊分別位于A位點(diǎn)和P位點(diǎn)上。A位點(diǎn)上的氨基酸（其次個(gè)氨基酸）中的α-氨基作為親核基團(tuán)取代了P位點(diǎn)上的tRNA，并與起始氨基酸中的COOH基團(tuán)形成肽鍵。本反應(yīng)可能由peptidyltransferase催化。

第三步，移位（translocation）。核糖體向mRNA的3’方向移動(dòng)一個(gè)密碼子，使得帶有其次個(gè)氨基酸（現(xiàn)已成為二肽）的tRNA從A位進(jìn)入P位，并使第一個(gè)tRNA從P位進(jìn)入E位。此時(shí)模板上的第三個(gè)密碼子正好在A位上。核糖體的移位需要EF-G（translocase）和另一分子GTP水解提供能量。5、肽鏈的終止

當(dāng)終止密碼子進(jìn)入核糖體A位點(diǎn)時(shí)，在釋放因子RF1-3的作用下：（1）水解末端肽基tRNA；（2）釋放新生肽和tRNA；

（3）使70S核糖體解離成30S和50S兩個(gè)亞基。6、蛋白質(zhì)合成的抑制劑

抗菌素對(duì)蛋白質(zhì)合成的作用可能是阻止mRNA與核糖體結(jié)合（氯霉素），或阻止AA-tRNA與核糖體結(jié)合（四環(huán)素類），或干擾AA-tRNA與核糖體結(jié)合而產(chǎn)生錯(cuò)讀（鏈霉素、新霉素、卡那霉素等），或作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑抑制蛋白質(zhì)合成。

鏈霉素是一種堿性三糖，干擾fMet-tRNA與核糖體的結(jié)合，從而阻止蛋白質(zhì)合成的正確起始，并導(dǎo)致mRNA的錯(cuò)讀。若以poly（U）作模板，則除苯丙氨酸（UUU）外，異亮氨酸（AUU）也會(huì)摻入。對(duì)鏈霉素敏感位點(diǎn)在30S亞基上。

嘌呤霉素是AA-tRNA的結(jié)構(gòu)類似物，能結(jié)合在核糖體的A位上，抑制AA-tRNA的進(jìn)入。它所帶的氨基與AA-tRNA上的氨基一樣，能與生長(zhǎng)中肽鏈上的羧基生成肽鍵，這個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物是一條3'羧基端掛了一嘌呤霉素。

青霉素、四環(huán)素和紅霉素只與原核細(xì)胞核糖體發(fā)生作用，從而阻遏原核生物蛋白質(zhì)的合成，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。氯霉素和嘌呤霉素既能與原核細(xì)胞核糖體結(jié)合，又能與真核生物核糖體結(jié)合，阻礙細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，前3種抗生素被廣泛用于人類醫(yī)學(xué)，后兩種則很少在醫(yī)學(xué)上使用。

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第四講DNA、RNA和蛋白質(zhì)代謝

DNA是貯藏遺傳信息的最重要的生物大分子。DNA分子中的核苷酸排列順序不但決定了胞內(nèi)所有RNA及蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，還通過(guò)蛋白質(zhì)（酶）的功能間接控制了細(xì)胞內(nèi)全部有效成份的生產(chǎn)、運(yùn)轉(zhuǎn)和功能發(fā)揮。貯藏在任何基因中的生物信息都必需首先被轉(zhuǎn)錄生成RNA，才能夠得到表達(dá)。DNA和RNA雖然很相像，只有T或U及核糖的其次位碳原子上有所不同，但它們的生物學(xué)活性卻很不同。

RNA主要以單鏈形式存在于生物體內(nèi)，其高級(jí)結(jié)構(gòu)很繁雜；RNA既擔(dān)負(fù)著貯藏及轉(zhuǎn)移遺傳信息的功能，又能作為核酶直接在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮代謝功能。蛋

白

質(zhì)

是

class=\

href=\生物信息\生物信息通路上的終產(chǎn)物，一個(gè)活細(xì)胞在任何發(fā)育階段都需要數(shù)千種不同的蛋白質(zhì)。因此，活細(xì)胞內(nèi)時(shí)刻進(jìn)行著各種蛋白質(zhì)的合成、修飾、運(yùn)轉(zhuǎn)和降解反應(yīng)。

一、核苷酸的合成與代謝

核苷酸是DNA和RNA的前體是細(xì)胞內(nèi)化學(xué)能流通領(lǐng)域中的載體（ATP，GTP）,是NAD、FAD、S-adenosylmethionine及CoenzymeA等的重要成份。在糖代謝中也有重要作用，如生成UDPG和CDP-diacylglycerol等。cAMP,cGMP還是其次信使。1、DeNovo嘌呤核苷酸的生物合成始于PRPP（Phosphoribosyl1-pyrophosphate）

這一途徑的第一步是由谷氨酰胺捐獻(xiàn)一個(gè)氨基到PRPP的C-1位上，生成5-phosphoribosylamine。

其次，把甘氨酸中的三個(gè)基團(tuán)加到PRA上。第三，由N10-甲基四氫葉酸提供一個(gè)甲基。第四，谷氨酰胺提供另一個(gè)N。第五，脫水環(huán)化形成咪唑環(huán)。第六，羧基化

第七，通過(guò)分子重排將羧基從咪唑第4碳的環(huán)外氨基上轉(zhuǎn)移到第5位碳原子上。第八-九，由天門冬酰胺把另一個(gè)氨基加到第5位碳原子上。第十，再由N10-甲基四氫葉酸提供一個(gè)甲基。第十一，脫水環(huán)化，形成嘌呤IMP。

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參與合成AMP的是①腺苷琥珀酸合成酶和②腺苷琥珀酸裂解酶。參與合成GMP的是③IMP脫氫酶和④XMP-谷氨酰胺酰胺轉(zhuǎn)移酶。2.嘌呤核苷酸合成中的反饋調(diào)理

3．嘧啶核苷酸是由天門冬酰胺、PRPP和氨基甲酰磷酸等共同形成的

嘧啶從頭合成途徑不同于嘌呤的合成，6-原子嘧啶環(huán)首先被合成，然后才與核糖-5-磷酸相連。這個(gè)反應(yīng)需要氨基甲酰磷酸（Carbamoylphosphate）。4．核苷單磷酸轉(zhuǎn)化為核苷三磷酸

反應(yīng)生成的ADP可通過(guò)糖酵解酶或氧化磷酸化途徑被進(jìn)一步磷酸化。ATP能夠把磷酸基團(tuán)加到其它所有核苷單磷酸上生成核苷三磷酸。

核苷二磷酸可通過(guò)一個(gè)公用的核苷二磷酸激酶被進(jìn)一步磷酸化生成核苷三磷酸。5．核糖核苷酸（ribonucleotides）是脫氧核糖核苷酸（Deoxyribonucleotides）的前體。所有dNTP都直接來(lái)自于NTP（其實(shí)是NDP）。這個(gè)反應(yīng)很特別，由于核糖上的還原反應(yīng)發(fā)生于一個(gè)沒(méi)有活化的碳原子上。催化該反應(yīng)的酶是核糖核苷酸還原酶。

大腸桿菌核苷酸還原酶有兩大特征，它的生物學(xué)活性和底物特異性同時(shí)受效應(yīng)子（effectormolecules）的影響。每個(gè)R1亞基上都有兩個(gè)調(diào)理位點(diǎn)，當(dāng)影響整體酶活性的那個(gè)位點(diǎn)與ATP相結(jié)合時(shí)，酶活性增加；而當(dāng)它與dATP結(jié)合時(shí)，酶活性消失。

其次個(gè)調(diào)理位點(diǎn)控制了底物特異性。當(dāng)dATP與該位點(diǎn)相結(jié)合時(shí)，UDP和CDP的還原反應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行。當(dāng)dTTP與該位點(diǎn)相結(jié)合時(shí)，GDP的還原反應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行。核糖核苷酸還原反應(yīng)的主要過(guò)程

1.還原酶R2亞基處于氧化態(tài)-X˙，向核糖3'位碳原子上的H發(fā)起攻擊，生成3'位自由基。2.R1亞基上的-SH基團(tuán)為2'-OH提供一個(gè)H原子，使之生成-OH2基團(tuán)。3.脫水后，3'位自由基幫助維持2'位O+基團(tuán)。

4.R1亞基上的另一個(gè)-SH基團(tuán)為2'-CH+提供一個(gè)H原子5.2'上的C˙-OH向R2亞基上的X-H發(fā)起攻擊。

6.2'上的C-OH失去氧原子，生成dNDP。其中，dTMP（thymidylate）來(lái)自于dCDP和dUMP，其直接前體是dUMP，由胸苷酸合酶（thymidylatesynthase）將dUMP轉(zhuǎn)化為dTMP；反應(yīng)中的甲基來(lái)自于N5，N10-Methylene-tetrahydrofolate。7、嘌呤和嘧啶降解后分別生成UricAcid和Urea。嘌呤核苷酸降解

第一步是在5'-核苷酸酶（5'-nucleotidase）的作用下消去磷酸基團(tuán)，由

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Adenosine-monophosphate變成Adenosine，或從GMP變成Guanosine。二、在Adenosinedeaminase的作用下生成Inosine；

三、在nucleosidase的作用下生成Hypoxanthine或由Guanosine生成Guanine；四、在Xanthineoxidase或Guaninedeaminase作用下生成Xanthine；五、在Xanthineoxidase的作用下生成Uricacid。嘌呤代謝突變會(huì)引起重要疾病。

如人體內(nèi)缺失adenosinedeaminase，會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的免疫缺失性疾病，由于此時(shí)T-淋巴和B-淋巴細(xì)胞不能正常發(fā)育。AD缺失后，細(xì)胞內(nèi)dATP的含量將高達(dá)正常細(xì)胞中的100倍，而過(guò)量的dATP則抑制了其余dNTP在T-淋巴細(xì)胞中的合成。大量化療（chemotherapy）藥劑都針對(duì)核苷酸合成途徑。如Azaserine和Acivicin都是Glutamine類似物，被用于阻斷核苷酸的生物合成。

胸苷合成中的主要抑制劑有fluorouracil（氟脲）、methotrexate（氨甲基葉酸）和aminopterin（氨喋呤）。氟脲本身不是thymidylatesynthase抑制劑，但它在細(xì)胞中被轉(zhuǎn)化為FdUMP以后，就能直接與TS相結(jié)合并使之失活。氨甲基葉酸和氨喋呤都是dihydrofolatereductase的抑制劑，氨甲基葉酸與該酶的親和力比底物dihydrofolate高100倍。

二、氨基酸代謝

按所占的質(zhì)量比例計(jì)算，N在生物體內(nèi)的重要性排在CHO之后，列第4位。大量N元素都是有機(jī)氮，被結(jié)合于氨基酸或核苷酸分子中。

地球上的動(dòng)植物共含氮約1.5×1010t，而每年通過(guò)硝化細(xì)菌以氣態(tài)氮的形式釋放到大氣中的氮就有2×108—5×108t。全世界氮肥廠每年生產(chǎn)的化肥僅含氮約108t，所以，假使沒(méi)有生物固氮，生命很快就不復(fù)存在了。

1.銨通過(guò)谷氨酸→谷氨酰胺被結(jié)合到有機(jī)物質(zhì)中。主要有兩步反應(yīng)：

⑴Glutamate+ATP→γ-glutamylphosphate+ADP⑵γ-Glutamylphosphate+NH4+→glutamine+Pi+H+總結(jié)：

Glutamyl+NH4++ATP→glutamine+ADP+Pi+H+因此，谷氨酰胺合成酶是氮代謝中的主要調(diào)控位點(diǎn)。

在大腸桿菌中，GS由12個(gè)一致的亞基（50kDa）聚合而成，其活性既通過(guò)構(gòu)象變化，也能通過(guò)共價(jià)修飾的方式得到調(diào)理。Alanine，Glycine和其它至少6種gln代謝產(chǎn)物都是GS

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活性的變構(gòu)抑制劑，每個(gè)抑制劑都只有部分抑制作用。除變構(gòu)抑制之外，GS活性還受共價(jià)修飾調(diào)理。當(dāng)?shù)?97位酪氨酸被腺苷化后（加上AMP），該酶更簡(jiǎn)單受變構(gòu)抑制劑的反饋調(diào)理。

2.氨基酸的生物合成

高等動(dòng)物不能合成大約一半氨基酸，只能從食物中直接獲取這些必需氨基酸（Essential）。

表18-1人體必需氨基酸(*.哺乳期至幼兒期必需)表22-1氨基酸合成的六條主要途徑3.氨基酸脫羧基化后生成有機(jī)胺。

大量重要的神經(jīng)遞質(zhì)都是胺或其次生代謝產(chǎn)物。Tyrosine降解產(chǎn)物有dopamine（多巴胺），epinephrine（腎上腺素），norepinephrine，統(tǒng)稱為Catecholamines（兒茶酚胺）。4.精氨酸降解產(chǎn)生NO˙(NitricOxide)。

本世紀(jì)80年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)NO是人體內(nèi)重要的信號(hào)分子，它參與神經(jīng)傳遞、凝血和血壓調(diào)控等一系列生理反應(yīng)。雖然它是氣體，極易擴(kuò)散，但由于它十分活躍，其擴(kuò)散半徑一般只有1mm。

三、氨基酸及功能蛋白質(zhì)合成后的修飾

1.蛋白質(zhì)剛剛被合成時(shí)，都以fMet（原核）或Met（真核）開(kāi)始，多肽合成后，N端的formylgroup、Met殘基，有時(shí)還包括N揣多個(gè)殘基或C端的殘基都會(huì)被切除。50%的真核蛋白中，N-端殘基的氨基酸會(huì)被N-乙基化。

2.切除信號(hào)肽。大量蛋白質(zhì)都帶有15-30個(gè)殘基的signalpeptides，負(fù)責(zé)指導(dǎo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的確切定位。3.特定氨基酸的修飾。4.氨基酸的糖苷化

5.氨基酸的異戊烯化（AdditionofIsoprenylGroups）6.有些蛋白質(zhì)還要與輔基(prostheticgroups)相結(jié)合；

CytochromeC只有與血紅素（heme）相結(jié)合才有功能。此外，Acetyl-CoA羧化酶常與Biotin分子相結(jié)合。有些蛋白質(zhì)必需經(jīng)蛋白酶切割后才有功能。有些蛋白質(zhì)只有在形成二硫鍵之后才有功能。

四、蛋白質(zhì)的運(yùn)輸和降解

1、絕大部分被運(yùn)入ER內(nèi)腔的蛋白質(zhì)都帶有一個(gè)Signalpeptide。該序列往往位于蛋白質(zhì)的

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氨基末端，長(zhǎng)度一般在13-36個(gè)殘基之間，有三個(gè)特點(diǎn)：（1）一般帶有10-15個(gè)疏水氨基酸；（2）往往在靠近該序列N-端疏水氨基酸區(qū)上游帶有1個(gè)或數(shù)個(gè)帶正電荷的氨基酸；（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位點(diǎn)處往往帶有數(shù)個(gè)極性氨基酸，離切割位點(diǎn)最近的那個(gè)氨基酸往往帶有很短的側(cè)鏈（Ala或Gly）。

研究發(fā)現(xiàn)，信號(hào)肽把Ribosome牽引到ER上。蛋白質(zhì)合成之初，一旦信號(hào)肽序列的N端暴露在核糖體外，該序列（包括核糖體）就迅速與SRP（signalrecognitionparticle）相結(jié)合，誘發(fā)SRP與GTP相結(jié)合，中止新生肽的進(jìn)一步延伸（此時(shí)新生肽一般長(zhǎng)約70個(gè)殘基左右）。

受位于ER外膜上的SRP-receptor及ribosome-receptor的牽引，這個(gè)復(fù)合物（GTP-SRP-ribosome-mRNA-新生肽）馬上向ER外膜靠攏，并通過(guò)peptidetransportcomplex進(jìn)入ER內(nèi)腔。

5.RoughER上的蛋白質(zhì)往往通過(guò)運(yùn)轉(zhuǎn)載體將經(jīng)過(guò)修飾的蛋白質(zhì)送入高爾基體，再分別送到各個(gè)亞細(xì)胞位點(diǎn)。

6.蛋白質(zhì)中的核定位序列一般不被切除。

蛋白質(zhì)的核定位是通過(guò)多個(gè)蛋白的共同作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Importin(α,β亞基)的作用有點(diǎn)像SRP受體。NLS蛋白-Importin復(fù)合物停留在核孔上，并在Ran-GTPase的作用下通過(guò)核孔。

細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)也存在類似的蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)。7、蛋白質(zhì)降解是一個(gè)有序的過(guò)程。

在大腸桿菌中，大量蛋白質(zhì)的降解是通過(guò)一個(gè)依靠于ATP的蛋白酶（稱為L(zhǎng)on）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)細(xì)胞中存在有錯(cuò)誤或半衰期很短的蛋白質(zhì)時(shí)，該蛋白酶就被激活。每切除一個(gè)肽鍵要消耗兩分子ATP。

在真核生物中，蛋白質(zhì)的降解需要Ubiquitin，一個(gè)有76個(gè)氨基酸殘基組成極為保守的蛋白參與。與Ubiquitin相連的蛋白將被送到一個(gè)依靠于ATP的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)（Proteasome，Mr.1×106）。

成熟多肽N-端第一個(gè)殘基對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有重要影響。

五、DNA代謝

無(wú)論是只含有一對(duì)染色體的原核細(xì)胞還是帶有多對(duì)染色體的真核細(xì)胞，只有整個(gè)基因組得到了完整確鑿的復(fù)制，細(xì)胞分裂才能順利發(fā)生。所以說(shuō)，DNA復(fù)制的起始，標(biāo)志了細(xì)胞進(jìn)入一個(gè)新的周期。

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㈠、DNA復(fù)制

根據(jù)反應(yīng)階段和所需的不同酶類，DNA的復(fù)制可被分為三個(gè)階段，即復(fù)制起始、延伸和終止。每個(gè)DNA復(fù)制的獨(dú)立單元被稱為復(fù)制子（replicon），主要包括復(fù)制起始位點(diǎn)（Origineofreplication）和終止位點(diǎn)（terminus）。原核生物的整個(gè)染色體上一般只有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。

大腸桿菌DNA的復(fù)制需要有20種左右的酶和蛋白質(zhì)因子參與，整個(gè)DNA復(fù)制機(jī)器被稱之為DNAreplicasesystem或replisome。

Helicase，任何DNA在被復(fù)制前都必需解開(kāi)雙鏈，這個(gè)過(guò)程是由helicase來(lái)完成的，它可在ATP的作用下將DNA母鏈不斷解開(kāi)形成單鏈。

Topoisomerase，主要功能是消除DNA解鏈過(guò)程中所產(chǎn)生的扭曲力。DNA結(jié)合蛋白，使新解鏈的DNA保持穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。Primases，為DNA復(fù)制提供RNA引物。

DNApolymerases，合成新生DNA鏈，切除RNA引物。

DNALigases，使新生DNA鏈上的缺口（3'-OH,5'-p）生成磷酸二酯鍵。1.DNA復(fù)制的起始

大腸桿菌中的復(fù)制起始位點(diǎn)是OriC，全長(zhǎng)245Bp，該序列在所有細(xì)菌復(fù)制起始位點(diǎn)中都是保守的。

DNA復(fù)制起始中的主要步驟

a.大約20個(gè)左右的DnaA蛋白首先與OriC中的4個(gè)9堿基重復(fù)區(qū)相結(jié)合；b.識(shí)別并使3個(gè)13堿基串聯(lián)重復(fù)區(qū)DNA形成開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)；

c.DnaB蛋白在DnaC的幫助下與未解鏈序列結(jié)合。每六個(gè)DnaB蛋白形成一組并與一條DNA母鏈結(jié)合，可在不同方向同時(shí)起始DNA的復(fù)制。當(dāng)細(xì)胞中存在足夠的SSB和DNAgyrase時(shí)，DnaB的解鏈效率十分高。

整個(gè)DNA復(fù)制過(guò)程中，只有復(fù)制起始受細(xì)胞周期的嚴(yán)作風(fēng)控。\。\

DNA甲基化與DNA復(fù)制起始密切相關(guān)。OriC中有11個(gè)GATC回文結(jié)構(gòu)（一般說(shuō)來(lái)，256bp才應(yīng)有一個(gè)GATC重復(fù)）。DNA子鏈被合成后，母鏈馬上被甲基化（稱為hemimethylated）。此時(shí)，oriC與細(xì)胞原生質(zhì)膜相結(jié)合。只有當(dāng)oriC被從膜上釋放出來(lái)，子鏈被Dam甲基化后，才能有效地與DnaA蛋白結(jié)合，起始新一輪的DNA復(fù)制。復(fù)制起始可能還受ATP水解過(guò)程調(diào)控，由于DnaA只有與ATP相結(jié)合時(shí)才能與oriC區(qū)DNA相結(jié)合。

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2.DNA子鏈的延伸

主要包括兩個(gè)不同但相互有聯(lián)系的事件，即前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成。由DNAhelicase解開(kāi)雙螺旋，由拓樸異構(gòu)酶消除DNA鏈上的扭曲力，SSB結(jié)合使DNA單鏈穩(wěn)定。前導(dǎo)鏈的合成：由DnaG（primase）在復(fù)制起始位點(diǎn)附近合成一個(gè)10-60nt的RNA引物，然后由polII把dNTP加到該引物上。

滯后鏈的合成：產(chǎn)生Okazakifragments，消除RNA引物并由DNApolI補(bǔ)上這一小段DNA序列，由DNALigase把兩個(gè)片段相連。3.DNA鏈的終止

當(dāng)子鏈延伸達(dá)到terminusregion（ter，帶有多個(gè)20bp序列）時(shí)，DNA復(fù)制就終止了。Ter有點(diǎn)像一個(gè)陷井（trap），使復(fù)制叉只能進(jìn)入，不能出來(lái)。Ter的功能主要是由Ter-Tus復(fù)合物（terutilizationsubstance）來(lái)完成的。4.真核細(xì)胞DNA的復(fù)制比大腸桿菌更繁雜

真核生物的originofreplication被稱為ARS-autonomouslyreplicatingsequences或者被稱為replicators。Yeastreplicators長(zhǎng)約150dp，有多個(gè)保守重復(fù)區(qū)，共有約500個(gè)replicators分布于酵母的17條染色體中。

㈡、DNA的損傷修復(fù)

1．錯(cuò)配修復(fù)（mismatchRepair）

錯(cuò)配修復(fù)對(duì)DNA復(fù)制忠實(shí)性的貢獻(xiàn)力達(dá)102-103，DNA子鏈中的錯(cuò)配幾乎完全都被修正，充分反映了母鏈的重要性。

2.堿基切除修復(fù)（Base-ExcisionRepair）

DNAgylcosylases能特異性識(shí)別常見(jiàn)的DNA損傷（如胞嘧啶或腺嘌呤去氨酰化產(chǎn)物）并將受損害堿基切除。去掉堿基后的核苷酸被稱為AP位點(diǎn)（apurinicorapyrimidinic）。細(xì)胞中最常見(jiàn)的UracilGlycosylase就能特異性切除細(xì)胞中的去氨基胞嘧啶。3.核苷酸切除修復(fù)（nucleotide-excisionrepair）

當(dāng)DNA鏈上相應(yīng)位置的核苷酸發(fā)生損傷，導(dǎo)致雙鏈之間無(wú)法形成氫鍵，由核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)負(fù)責(zé)進(jìn)行修復(fù)。

4.DNA的直接修復(fù)（Directrepair）

㈢、DNA的轉(zhuǎn)座

DNA的轉(zhuǎn)座，或稱移位（transposition），是由可移位因子（transposableelement）介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)\轉(zhuǎn)座\這一命名并不十分確鑿，由于在轉(zhuǎn)座過(guò)程中，可移位

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動(dòng)了轉(zhuǎn)錄起始。

若用基因工程的方法，將GAL4AD和BD分別克隆到不同的載體上，導(dǎo)入同一細(xì)胞株中表達(dá)，效應(yīng)基因無(wú)法被激活,但可把來(lái)自不同轉(zhuǎn)錄因子的AD或BD區(qū)域連成一個(gè)功能基因。主要試驗(yàn)過(guò)程：

a.選擇缺失GAL4編碼基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c；b.構(gòu)建帶有GAL1UAS-啟動(dòng)子-lacZ（His3）的轉(zhuǎn)化載體;

c.把已知的靶蛋白質(zhì)編碼基因克隆到pGBT9的多克隆位點(diǎn)上，把所有cDNA都克隆到

pGAD424載體上，構(gòu)成cDNA表達(dá)文庫(kù)。

d.從大腸桿菌中分別提取這兩種重組質(zhì)粒DNA，共轉(zhuǎn)化感受態(tài)釀酒酵母菌株。

e.將共轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培養(yǎng)基上，篩選表達(dá)相互作用的雜種

蛋白的陽(yáng)性菌落。E.基因的圖位克隆法

Map-basedcloning是分開(kāi)未知性狀目的基因的一種好方法。從理論上說(shuō)，所有具有某種表現(xiàn)型的基因都可以通過(guò)該方法克隆得到。首先，將目的基因定位到某個(gè)染色體的特定位點(diǎn)，并在其兩側(cè)確定緊湊連鎖的RFLP或RAPD分子標(biāo)記。二、利用與目的基因最緊湊連鎖的一對(duì)分子標(biāo)記作探針，通過(guò)染色體步移技術(shù)將位于這兩個(gè)標(biāo)記之間的基因片段href=\克隆\克隆并分開(kāi)出來(lái)。三、根據(jù)基因功能互作原理鑒定目的基因。

通過(guò)對(duì)大量不同的生態(tài)型及大量限制性內(nèi)切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標(biāo)記。在RFLP作圖中，連鎖距離是根據(jù)重組率來(lái)計(jì)算的，1cm（厘米）相當(dāng)于

1%

的

重

組

率

。

人

類

class=\

href=\基因組\基因組中，1cm≈1000kb;擬南芥菜中，1cm≈290kb;小麥中，1cm≈3500kb。

四、DNA的Microarray

只要事先除去高度及中等重復(fù)序列，任何DNA都可以被用于Microarray。最簡(jiǎn)單的例子是用機(jī)械手把極微量（nanoliters）的DNA點(diǎn)到玻片或其它載體上，照射UVlight使之永久固定，用不同細(xì)胞周期發(fā)育階段的cDNA作探針系統(tǒng)性地研究細(xì)胞中任意時(shí)期特異表達(dá)的基因；若把某一生物體內(nèi)全部全部已知基因分別點(diǎn)到DNA微列陣或者基因芯片上，再用不同發(fā)育階段的cDNA與之雜交，就能了解某些基因?qū)μ囟ㄉL(zhǎng)發(fā)育階段的重要性；基因

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芯片還可用于進(jìn)行基因診斷，可建立正常人特定組織、器官的基因，給出標(biāo)準(zhǔn)雜交信號(hào)圖。用可疑病人的cDNA做探針與之雜交，檢查哪些基因的表達(dá)受抑制或激活。

第六講原核基因表達(dá)調(diào)控

原核生物和單細(xì)胞真核生物直接暴露在變幻莫測(cè)的環(huán)境中，食物供應(yīng)毫無(wú)保障，只有能根據(jù)環(huán)境條件的改變合成各種不同的蛋白質(zhì)，使代謝過(guò)程適應(yīng)環(huán)境的變化，才能維持自身的生存和繁衍。自然選擇傾向于保存高效率的生命過(guò)程。在一個(gè)每30min增殖一倍的109細(xì)菌群體中，若有一個(gè)細(xì)菌變成了29.5min增殖一倍，大約經(jīng)過(guò)80天的連續(xù)生長(zhǎng)后，這個(gè)群體中的99.9%都將具有29.5min增殖一倍的生長(zhǎng)速度。

一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中約有2500-3000個(gè)基因。估計(jì)正常狀況下，可帶有107個(gè)蛋白質(zhì)，平均每個(gè)基因產(chǎn)生3000多個(gè)蛋白質(zhì)分子。但大腸桿菌中一般帶有15,000-30,000個(gè)核糖體，有50余種核糖體結(jié)合蛋白，數(shù)量也很驚人。此外，負(fù)責(zé)糖酵解系統(tǒng)的蛋白質(zhì)數(shù)量也很大。而象半乳糖苷酶等誘導(dǎo)酶，其含量可少至每細(xì)胞僅1-5個(gè)分子。

一個(gè)體系在需要時(shí)被開(kāi)啟，不需要時(shí)被關(guān)閉。這種\開(kāi)-關(guān)\（on-off）活性是通過(guò)調(diào)理轉(zhuǎn)錄來(lái)建立的，也就是說(shuō)mRNA的合成是可以被調(diào)理的。當(dāng)我們說(shuō)一個(gè)系統(tǒng)處于\狀態(tài)時(shí)，也有本底水平的基因表達(dá)，往往是每世代每個(gè)細(xì)胞只合成1或2個(gè)mRNA分子。所謂\關(guān)\實(shí)際的意思是基因表達(dá)量特別低，很難甚至無(wú)法檢測(cè)。

科學(xué)家把這個(gè)從DNA到蛋白質(zhì)的過(guò)程稱為基因表達(dá)(geneexpression)，對(duì)這個(gè)過(guò)程的調(diào)理就稱為基因表達(dá)調(diào)控(generegulation或genecontrol)。要了解動(dòng)、植物生長(zhǎng)發(fā)育的規(guī)律、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能，就必需弄明白基因表達(dá)調(diào)控的時(shí)間和空間概念，把握了基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)要，我們手中就有了一把透露生物學(xué)微妙的金鑰匙?；虮磉_(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控(transcriptionalregulation)；

②mRNA加工成熟水平上的調(diào)控(differentialprocessingofRNAtranscript)；③翻譯水平上的調(diào)控(differentialtranslationofmRNA).

原核生物中，營(yíng)養(yǎng)狀況(nutritionalstatus)和環(huán)境因素(environmentalfactor)對(duì)基因表達(dá)起著舉足輕重的影響。在真核生物特別是高等真核生物中，激素水平(hormonelevel)和發(fā)育階段(developmentalstage)是基因表達(dá)調(diào)控的最主要手段，營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境因素的影響力大為下降。

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一、乳糖操縱子的調(diào)控模式

大腸桿菌乳糖操縱子(lactoseoperon)包括3個(gè)結(jié)構(gòu)基因：Z、Y和A，以及啟動(dòng)子、控制子和阻遏子等。轉(zhuǎn)錄時(shí)，RNA聚合酶首先與啟動(dòng)區(qū)(promoter,P)結(jié)合，通過(guò)操縱區(qū)(oper