實(shí)驗(yàn)三血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆针娪镜幕驹?，加深?duì)蛋白質(zhì)兩性解離性質(zhì)的理解。掌握血清醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)的基本操作。實(shí)驗(yàn)原理

背景：電泳現(xiàn)象早在十九世紀(jì)初就已發(fā)現(xiàn)（1808年俄國物理學(xué)家Re?ss進(jìn)行了世界上第一次電泳實(shí)驗(yàn)）。但電泳技術(shù)的廣泛應(yīng)用，則是在1937年用濾紙作為支持介質(zhì)成功地進(jìn)行紙電泳以后，是近幾十年以來，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

為了克服溶液對(duì)電泳離子的影響，一般在電泳體系中加入不流動(dòng)的固體支持物。（一）按支持物的物理性狀不同，可分為：1．濾紙及其它纖維(如玻璃纖維、聚氯乙烯纖維薄膜、醋酸纖維)電泳2．粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳；3．凝膠電泳：如瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳；4．絲線電泳：尼龍絲、人造絲電泳。電泳的分類

（二）按支持物的裝置形式不同，可分為：1．平板式電泳：支持物水平放置；2．垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳；3．垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤狀電泳

電泳速度:帶電粒子在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)時(shí)，單位電場(chǎng)強(qiáng)度內(nèi)粒子運(yùn)動(dòng)的速度，以u(píng)表示，即

V—粒子運(yùn)動(dòng)的速度X—電場(chǎng)強(qiáng)度Q—粒子所帶電荷r—粒子的半徑η—介質(zhì)的粘度影響電泳速度的主要因素

1.樣品本身:

分子帶電量：Q越多，u越大；分子大小:

分子小，r越小，u越大；

分子形狀：形狀越小，與支持物介質(zhì)摩擦 越小，u越大。形狀越規(guī)則，u越大，反之則越小。球形分子>纖維狀分子2.緩沖溶液：A.pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大B.離子強(qiáng)度(I)：離子強(qiáng)度代表所有類型的離子所產(chǎn)生的靜電力，也就是全部的離子效應(yīng)，它取決于離子電荷的總數(shù)，而與溶液中鹽類的性質(zhì)無關(guān)。溶液的離子強(qiáng)度越高，帶電質(zhì)點(diǎn)的泳動(dòng)速度越慢；離子強(qiáng)度越低，質(zhì)點(diǎn)泳動(dòng)的速度越快。一般離子強(qiáng)度的選擇范圍在0.02～0.2之間。電泳緩沖液相對(duì)于固體支持物的移動(dòng)稱電滲。如紙電泳時(shí)，濾紙吸附OH-帶負(fù)電荷，與紙接觸的緩沖液帶正電荷向負(fù)極移動(dòng)，會(huì)對(duì)顆粒的移動(dòng)造成不良影響，故電泳時(shí)，電滲小些為好。4．電滲現(xiàn)象醋酸纖維薄膜電泳

醋酸纖維是纖維素的醋酸酯，由纖維素的羥基經(jīng)乙?；?。涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，有強(qiáng)滲透性，厚度約為120微米。

醋酸纖維素薄膜電泳有以下優(yōu)點(diǎn)：微量、快速、簡(jiǎn)便、分辨力高、對(duì)樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象

人血清中幾種主要蛋白組分血清蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分子量占總蛋白的％清蛋白4.6469,00057～72α1－球蛋白5.06200,0002～5α2－球蛋白5.06300,0004～9β－球蛋白5.1290,000～150,0006.5～12γ－球蛋白6.85～7.3156,000～950,00012～20

緩沖液pH=8.6

pH>pI血清蛋白帶負(fù)電荷,在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。

經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為5條區(qū)帶染色和定量膜條經(jīng)過氨基黑10B染色后顯出清晰色帶。各色帶蛋白質(zhì)含量與染料結(jié)合量基本成正比。可將各色帶剪開，分別溶于堿性溶液中。用分光光度法計(jì)算各種蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。（注意：在薄膜負(fù)極端寫好學(xué)號(hào)或者做好標(biāo)記)2．電泳放置膜條點(diǎn)樣端置于陰極點(diǎn)樣面向下膜條貼緊濾紙，拉直膜條平衡10分鐘通電電壓：160v時(shí)間：50min關(guān)閉電源４.定量(兩人的膜條共用)取試管6支，編號(hào)1~6試管編號(hào)

Aα1α2βγ00.4mol/LNaOH6.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml蛋白條帶清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白無蛋白區(qū)充分振蕩、脫凈染料比色、定量15min血清蛋白電泳結(jié)果的臨床意義：可能相關(guān)疾病清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑*腎病綜合癥↓↑*↑*腎炎↑*↑肝硬化↓↑*急性肝壞死↓*↑↑↑↑傳染性肝炎↓↑*↑*急性感染初期↑*↑*↑*慢性炎癥/感染后期↑*低球蛋白血癥↓*臨床上還可用A/G比來表示清球蛋白的量的關(guān)系：正常人A/G＝1.5～2.5注意事項(xiàng)：1、點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，吸水量以不干不濕為宜。2、點(diǎn)樣時(shí)，動(dòng)作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。3、點(diǎn)樣應(yīng)點(diǎn)在薄膜的毛面上，點(diǎn)樣量要適量，不宜過多或過少。4、電泳時(shí)應(yīng)將薄膜的點(diǎn)樣端置于電泳槽的負(fù)極端，且點(diǎn)樣面向下。5、應(yīng)控制染色時(shí)間。