大型儀器管理中心2010-9-27實時熒光定量PCR原理及其應(yīng)用熒光定量PCR儀的應(yīng)用基礎(chǔ)研究中基因表達(dá)豐度的測定；差異基因的表達(dá)檢測，基因型分析；臨床醫(yī)療領(lǐng)域病原體的檢測和基因診斷：包括特定基因的檢測、細(xì)菌和病毒等病原體的檢測；環(huán)境監(jiān)測，包括水質(zhì)、空氣的污染檢驗；檢驗檢疫工作：食品衛(wèi)生檢驗，轉(zhuǎn)基因作物的檢驗；法醫(yī)的遺傳學(xué)鑒定；實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR（Real-timeQ-PCR）技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積，實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過參照標(biāo)準(zhǔn)曲線對反應(yīng)體系中未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

實時熒光定量PCR中的三個概念增長曲線

(primarycurve)熒光閾值（threshold)CT值(CycleThreshold)增長曲線反映熒光強(qiáng)度與循環(huán)數(shù)的對應(yīng)關(guān)系CycleFluorescenceCt值Ct值:C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值與起始模板的關(guān)系每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。起始拷貝數(shù)越多，CT值越??；模板DNA的起始拷貝數(shù)越少，CT值越大。一般正常的CT值范圍在15-35之間，過大和過小都將影響實驗數(shù)據(jù)的精度。

熒光定量PCR標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料 SYBRGreenI序列特異性探針

Taqman

MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特異性探針

Amplifluor(Intergen)5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

SYBRGreen?I優(yōu)點(diǎn)：使用方便，可以應(yīng)用于不同的模板靈敏，便宜缺點(diǎn)：與非特異性產(chǎn)物結(jié)合，但可以通過熔解曲線進(jìn)行辨別熔解溫度(Tm值)Tm值：50%DNA變成單鏈時的溫度，此溫度與雙鏈DNA的長度、GC含量有關(guān)，可部分代表序列的特異性。RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation雙標(biāo)記探針（TaqmanProbe）優(yōu)點(diǎn)：對目標(biāo)序列有很高的特異性，在病原微生物特異性檢測上有獨(dú)特優(yōu)勢設(shè)計簡單，準(zhǔn)確性好缺點(diǎn)：只適合于一種特異目標(biāo)的檢測，相對價格略高雙標(biāo)記探針（TaqmanProbe）熒光定量PCR實驗技術(shù)路線查詢目的基因序列

選擇合適的熒光標(biāo)記方法選染料法則購買SyBrGreenI或相應(yīng)試劑盒；探針法則設(shè)計并合成熒光探針

設(shè)計特異引物或探針熒光定量PCR實驗技術(shù)路線實驗時先對普通PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在條帶特異的情況下才能采用染料法進(jìn)行熒光定量PCR實驗注意

模板濃度：在普通PCR基礎(chǔ)上可以稀釋10~100倍引物濃度：0.4~0.9μM（一般略低于PCR引物量）熒光物質(zhì)濃度：按說明書操作，根據(jù)實驗結(jié)果優(yōu)化加樣準(zhǔn)確性：避免微小加樣熒光定量PCR實驗技術(shù)路線模板PlasmidDNA

目的片段在PlasmidDNA中很易被擴(kuò)增，可以適當(dāng)稀釋TotalDNA

目的片段在TotalDNA中豐度相對較低，因此TotalDNA量要略高于PlasmidDNA

cDNA

以cDNA為模板時一般將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物原液稀釋10~50倍后作模板熒光定量PCR實驗技術(shù)路線熒光定量PCR反應(yīng)靈敏，微小差異都能被反映，實驗中要避免核酸污染，尤其是避免PCR產(chǎn)物污染。試劑反復(fù)凍融對實驗也有影響，各組分采用少量分裝保存低濃度模板反復(fù)凍融容易降解，少量分裝保存標(biāo)準(zhǔn)曲線由系列稀釋的已知濃度的樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品的濃度logN0=-CtlogE+logN絕對定量——未知濃度的樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品：含有目的片段的濃度已知的核酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，一般選取4-5個點(diǎn)（多于5個更好），被選點(diǎn)的模板濃度范圍要包括待測樣本濃度目標(biāo)基因與持家基因擴(kuò)增效率差別舉例

對于每一個稀釋梯度，都用GAPDH和c-myc引物進(jìn)行擴(kuò)增。計算出c-myc和GAPDH的平均CT值以及△CT值，通過cDNA濃度梯度的log值對△CT值作圖，如果所得直線斜率絕對值接近于0，說明目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增效率相同，就可以通過△△CT方法進(jìn)行相對定量。

KennethJ.LivakandThomasD.Schmittgen,METHODS25,402–408(2001)相對定量方法二——雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法當(dāng)兩個擴(kuò)增反應(yīng)效率不同或者不方便證明的時候，則需要通過雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法來進(jìn)行相對定量；或者也可以重新設(shè)計引物，優(yōu)化反應(yīng)條件使得目標(biāo)序列和內(nèi)