本文格式為Word版，下載可任意編輯——葡萄糖參考方法測定葡萄糖的推薦參考方法

1.樣本處理、保存和保存

a：在處理任何葡萄糖溶液中最基本的預(yù)防措施是防止糖分解。這種方法設(shè)計(jì)用于無細(xì)胞的樣本。為了更好地保持葡萄糖的最初濃度必需避免微生物和細(xì)菌污染，這是樣本分解的主要來源，少量樣本的蒸發(fā)也可能產(chǎn)生嚴(yán)重問題，由于化學(xué)污染能在很短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生，因此，在處理和保存樣本時(shí)嚴(yán)格要求樣本瓶清潔、無菌、密閉。

b:葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶解稀釋在1g/L安眠香酸溶液中，可抗微生物污染，它在4℃可長期保存在室溫下可穩(wěn)定數(shù)周。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)的水稀釋液或其他稀釋液和復(fù)溶凍干品對(duì)糖分解十分不穩(wěn)定，須經(jīng)過無菌或參與防腐劑處理。

c：用于這個(gè)分析的樣本所使用的生物樣品嚴(yán)格限定為血清和血漿，兩種標(biāo)本在制備與保存中要求特別的防腐抗細(xì)菌學(xué)糖酵解以及細(xì)胞學(xué)傷害。凍干血清產(chǎn)品不一定分開這些污染物，尋常比新鮮收集的陰性血清糖酵解速度快。血液在無菌條件下收集，即使使用了防腐劑，過期控制與校準(zhǔn)品樣品也必需進(jìn)行過濾以除掉組織細(xì)胞和微生物，由于細(xì)胞糖酵解的完全抑制劑有限，大量這樣物質(zhì)存在干擾問題，因此血漿與血清必需離心確保產(chǎn)生與細(xì)胞分開的血清。血清可以保存到任何時(shí)間。在含有抗凝劑或收集的血清中參與足量防腐劑。肝素、草酸鹽、檸檬酸和EDTA不干擾這項(xiàng)分析。NaF是安全防腐劑，但是作為高濃度的專用抗凝劑不可避免的產(chǎn)生血漿不穩(wěn)定并干擾這項(xiàng)分析。肝素以外的抗凝劑導(dǎo)致血樣本中細(xì)胞內(nèi)水和其他物質(zhì)的滲透壓的改變，最終導(dǎo)致血漿葡萄糖濃度的改變。

d.血中NaF在2.0mg/ml濃度是推薦防腐濃度。NaF最好與1mg/mlEDTA-Na2鹽聯(lián)合使用，這個(gè)混合物在常規(guī)真空采血管中是可能的(加到收集的血清或血漿中，1mg/mlNaF濃度足夠)。

e：收集的新鮮樣本必需馬上混勻，輕輕地溶解干的抗凝劑，防止冷凍血漿中Fb的后期問題.

f樣本長期保存的關(guān)鍵是無菌、密閉、低溫柔遠(yuǎn)離細(xì)胞或化學(xué)污染物。超過48h的保存，即使已經(jīng)經(jīng)防腐處理，樣本也應(yīng)在容器中冷凍，確保密閉和防止水蒸氣滲入；選擇深色小玻璃瓶。通過特定的適合的螺旋帽可獲得一個(gè)很好的密封，在小于30℃的水容箱中冰凍樣本迅速溶化。在同一瓶反復(fù)溶解，樣本反復(fù)取樣，增加樣本潛在分解、蒸發(fā)和污染的危險(xiǎn)。2.要求和材料說明a:量值測量

（1）天平縝密度（2）天平確鑿度

（3）樣本轉(zhuǎn)移（量?。゜:分光光度計(jì)測量（1）比色杯系統(tǒng)

（a）固定位置（b）單一杯子

（c）單一1.0cm比色杯（2）340nm分光光度計(jì)特性

（a）光譜溶液、波長和雜散光：340nm時(shí)半波寬≤8nm。重復(fù)測定340nm處波長縝密度和確鑿度在±2nm之間，340nm處雜散光98%，常規(guī)稱重。（g）ATP-Na2.3H2O,純度>98%，常規(guī)稱重。（h）牛血清AlB,第五部分，純度96-99%。（i）葡萄糖-1-磷酸，二鈉鹽，4H2O，純度>98%（j）D-果糖，NAS/NRC說明書

（k）安眠香酸：見ACS說明書（5）酶說明：

（a）HK(ATP:6-磷酸D-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶；EC2.7.1.1），酶來源于酵母，要求

高純度，4.d中給出恰當(dāng)?shù)拿笝z驗(yàn)數(shù)據(jù)，注意4.d(2).（b）G6PDH(6-磷酸-D-葡萄糖：NAD（P）氧化還原酶；EC1.1.1.49），酶來

源于腸膜明串珠菌，可以懸浮于硫酸胺液或?yàn)閮龈煞郏蟾呒兌龋?.d中給出恰當(dāng)?shù)尿?yàn)證數(shù)據(jù)，注意4.d(2).3.血清或血漿中葡萄糖測定程序：a:原液標(biāo)準(zhǔn)液的配制：

（1）安眠香酸稀釋液（1g/l）：在大容量瓶中用2000ml熱的試劑水溶解

2.0gACS級(jí)安眠香酸，完全混勻，蓋蓋冷卻至室溫。全部液體倒進(jìn)試劑瓶，密閉保存于室溫。（2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯存液（10g/l）：稱取5.000±0.002gNBS無水D-葡萄糖，

放入500mlclassA級(jí)容量瓶中，用安眠香酸稀釋液沖洗和稀釋葡萄糖至容量瓶的2/3瓶處，旋轉(zhuǎn)使葡萄糖完全溶解，加安眠香酸溶液至500ml標(biāo)記線下1cm處，把容量瓶放20℃±1℃水槽中，水沒至瓶頸處，密閉，用安眠香酸稀釋液補(bǔ)足前平衡溶液30分鐘。塞緊顛倒混勻至少10次，每一次顛倒、旋轉(zhuǎn)倒置容量瓶10秒。每125ml一份，放入帶有螺旋蓋的硼硅酸鹽的瓶中，蓋緊并標(biāo)記，還要注明日期。保存在4℃或-20℃。一瓶用于制備1整套系列標(biāo)準(zhǔn)液。假使處理得當(dāng)，準(zhǔn)備充分，這種標(biāo)準(zhǔn)原液可以長期穩(wěn)定，但還是建議每6個(gè)月重新配制。在一個(gè)新批號(hào)開始使用之前，從新標(biāo)準(zhǔn)原液配一個(gè)新的mg/dl(11.10ml/l)工作標(biāo)準(zhǔn)，與舊的系列標(biāo)準(zhǔn)在一批測試各雙份比較它們的變異。（3）葡萄糖工作標(biāo)準(zhǔn)液

（a）配制一套純品葡萄糖的系列工作標(biāo)準(zhǔn)液：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)原液和安眠香酸稀

釋液在20℃+1℃的水浴箱中平衡30分鐘，按下表轉(zhuǎn)移等份的葡萄糖原液至100mlclassA容量瓶中，用安眠香酸稀釋液稀釋至接近刻度，在水浴箱中平衡15分鐘后調(diào)至刻度線。為配制標(biāo)準(zhǔn)需準(zhǔn)備一特別系列的CLASSA級(jí)100ml容量瓶和5、10、20ml加樣器。貯存標(biāo)準(zhǔn)（ml）用安眠香酸稀釋液稀釋最終葡萄糖濃度的最終體積（ml）Mg/dlmmol/L5.0010.00100100502.781005.5520.0030.0040.0010010010020011.1030016.6540022.20安眠香酸稀釋液中一部分是用于配制試劑空白的，它用作“0〞濃度標(biāo)準(zhǔn)液。一次配制一套完整系列標(biāo)準(zhǔn)液，假使任何一個(gè)濃度減少或有懷疑，整批都將被替換。舊的和新的系列標(biāo)準(zhǔn)通過一個(gè)分析批雙份分析測試進(jìn)行比較。

（b）工作標(biāo)準(zhǔn)液貯存于4-ounce聚乙烯螺旋帽瓶中，放4℃不超過1個(gè)月。

塑料存貯瓶的清洗很關(guān)鍵，交織污染不被發(fā)現(xiàn)，對(duì)測定的影響會(huì)從一種溶液倒另一種溶液。盡管安眠香酸是一種很好的抗常規(guī)糖酵解微生物的防腐劑，它不能防衛(wèi)嚴(yán)重的細(xì)菌污染。（c）在每一分析日中，要求平衡至25℃的工作標(biāo)準(zhǔn)重新分到清白管中，原液

瓶重新放回冰箱。b試劑配制

（1）沉淀蛋白試劑

(a)ZnSO4溶液（22g/l）：用剛配好的熱的無CO2蒸餾水大約900ml溶解22gZnSO4。

7H2O，溶液冷卻至室溫后，移到1L容量瓶中，用無CO2水稀釋至1000ml充分混勻，移至玻璃瓶，密閉保存。(b)飽和Ba(OH)2溶液，用剛配好的熱的無CO2蒸餾水約950ml溶解剛開瓶稱取的80gBa(OH)2。8H2O，溶液冷至室溫，移到1L容量瓶中，用無CO2蒸餾水稀釋至1000ml，充分混勻，轉(zhuǎn)移到存儲(chǔ)瓶中，存儲(chǔ)瓶用短圓柱形指示型SIO2凝膠（硅膠）保護(hù)堿石灰咀，咀的壽命相當(dāng)短，堿石灰必需經(jīng)常更換。允許超量的Ba(OH)2和不溶解的碳酸鹽沉淀過夜或幾天，必要時(shí)，稀釋前清除它。（d）Ba(OH)2溶液，0.11N。假使不干擾沉淀，轉(zhuǎn)移245ml飽和Ba(OH)2到1L

容量瓶，用無CO2蒸餾水稀釋至1000ml，用這個(gè)稀釋的Ba(OH)2溶液滴定10ml硫酸鋅溶液用酚酞做指示劑（0.5%指示劑溶解于95%乙醇中，2滴）滴至淡粉色為終點(diǎn)，結(jié)果應(yīng)為10mlZnSO4溶液需要10±0.1mlBa(OH)2溶液滴定。若超過這個(gè)范圍，在Ba(OH)2溶液中根據(jù)大致計(jì)算量參與適量Ba(OH)2或無CO2水，重新滴定。轉(zhuǎn)移校正好的Ba(OH)2溶液至使用堿石灰咀和蘇打水瓶或細(xì)水瓶管試劑瓶中，每個(gè)月用滴定法檢查該溶液當(dāng)量濃度。（2）25℃時(shí)，PH7.5的0.1mTrisbuffer,含5.0mmol/l乙酸鎂

（a）TRIS-HCL原液，在2.0L的容量瓶中用試劑水溶解31.52gTRIS-HCL并

稀釋到2000ml。

（b）Trisbase原液：在500ml容量瓶中用試劑水溶解6.06gTrisbase并

稀釋至500ml。配制酶試劑時(shí)需新鮮配制這個(gè)原液。（c）PH7.5Tris-Mgbuffer，在一個(gè)大燒杯里，混合800mlTris-HCL液和

200ml的Trisbase溶液，然后在溶液里溶解1.1g醋酸鎂。在25℃測定混合液的PH，必要時(shí)，用Tris-HCL液或Trisbase溶液調(diào)至PH7.5±0.1。用0.45μm濾菌膜過濾溶液，到一個(gè)無菌帶螺旋帽的硼硅酸鹽玻璃貯存瓶中，配酶試劑時(shí)要新鮮配制，貯存于4℃冰箱。C：酶試劑的準(zhǔn)備與分析（1）酶試劑成分的本質(zhì)分析(a)試劑

（?。㏕ris-白蛋白：在250ml容量瓶中用Tris-Mgbuffer溶解0.5g牛血清白蛋白，校正至250ml。儲(chǔ)存在大約4℃冰箱。

（ⅱ）NAD+原液：在Tris-Mg緩沖液中溶解0.9952g氧化型NAD+，補(bǔ)足至250ml，在4℃冰箱保存，配制當(dāng)天測定。

（ⅲ）ATP原液：在Tris–Mgbuffer中溶解0.8268gATP二鈉鹽，并補(bǔ)足至250ml，保存于4℃冰箱，配制當(dāng)天測定。

（ⅳ）葡萄糖，用0.1%安眠香酸稀釋60ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)原液至100ml，保存在4℃冰箱。

（ⅴ）己糖激酶原液：在25℃稱量或用Darrow和Colowick的方法或使用6-磷酸葡萄糖脫H酶的方法測定酶含量獲得總活性1250U的己糖激酶，轉(zhuǎn)移至250ml酶的容量瓶，用Tris–Mgbuffer調(diào)至刻度，放在4℃冰箱保存，配制當(dāng)天分析。

（ⅵ）6-磷酸葡萄糖脫H酶原液：在25℃稱量或用olive和Levy的方法或用己糖激酶分析的一組相像的方法獲得總活性1250U的6-磷酸葡萄糖脫H酶。用Tris–Mgbuffer溶解至250ml，保存于4℃冰箱，配制當(dāng)天測定。

注意：己糖激酶或脫H酶的活性可從廠家說明書提供的分析資料獲得，這些信息包括U/瓶（凍干或懸?。?U/ml（懸浮），U/mg（凍干）或U/mg蛋白和U/ml（懸浮），懸浮的液體最好通過稱重法測定體積量或直接稱量1250U的酶，確切測量1250U不是絕對(duì)必要的，但應(yīng)盡可能測準(zhǔn)。假使不能評(píng)估酶濃度，僅配制基本的10ml酶原液并分析它。(b)己糖激酶分析

(ⅰ)將上述試劑ⅰ-ⅵ和0.1MTris–Mg緩沖液放在25℃±0.2℃的水浴箱中，放20分鐘，使液體達(dá)到預(yù)定溫度（原液放冰箱保存，除非需移液時(shí)）。

（ⅱ）己糖激酶試驗(yàn)試劑：在一個(gè)帶玻璃塞的錐形瓶中，混合等量的NAD+原液，ATP原液、葡萄糖、脫氫酶原液和Tris–Mg緩沖液，10ml可滿足最初的和重復(fù)三次分析量。

（ⅲ）己糖激酶稀釋液：取1ml己糖激酶原液用0.2%Tris–ALB液稀釋至100ml。（ⅳ）分析：將己糖激酶試驗(yàn)試劑、5ml己糖激酶稀釋液和含有5ml0.2%Tris–ALB液的密閉的試管放在25℃±0.2℃的水浴箱中大約10分鐘使液體達(dá)到預(yù)定溫度。

空白測定

Tris-ALB（ml）1.0——HK稀釋液（ml）——1.0HK試驗(yàn)試劑（ml）5.05.0

混勻，馬上轉(zhuǎn)移到已含有溫度控制在25℃±0.2℃樣本的分光光度計(jì)的2個(gè)檢測反應(yīng)杯中，在340nm連續(xù)測定5分鐘內(nèi)空白和試驗(yàn)管的吸光度，對(duì)5分鐘內(nèi)任意1分鐘吸光度變化應(yīng)基本一致，在0.005A/分以內(nèi)，對(duì)這個(gè)分析而言NAD+的下降表示分析偏差。

（ⅴ）己糖激酶原液催化活性的計(jì)算。

HK原液活性量={（dA/dt）╱(E×b）}×Vr/Vs=dA/dt×(1╱6.23×103l.cm/mol.cm)×Vr/Vs

=dA/dt×(0.0001605mol/l)×(106μmol/mol)×(1/103ml)

×(6/Vs)={Atest(3分)-Atest(2分)}×（0.963μmol/mol）×(1/Vs)=μmol/min.ml=U/ml(25℃HK原液)

dA=吸光度變化率（本次分析用3分鐘和2分鐘讀數(shù)的變化）dt=測定時(shí)間變化

E=摩爾吸光度（本次分析條件下，值為6.23×103l/mol.cm）b=光徑（用厘米表示）

Vr=用毫升表示的總的反應(yīng)體積（上面給出的程序，體積為6ml：5mlHK試驗(yàn)試劑+1ml稀釋HK）

Vs=用ml表示的總反應(yīng)量中的酶原液量（上面給出的程序：1ml被稀釋HK加到反應(yīng)混合液中（包含0.01ml酶原液），因此Vs是0.01ml。（ⅵ）例如：配制一個(gè)HK原液：用廠家報(bào)告的含有1395U/ml的商業(yè)的懸浮于硫酸銨溶液的HK1ml，用Darrow和Colowick的方法在30℃測定，用Tris–Mgbuffer稀釋至250ml。HK分析中使用1mlHK原液，3分鐘時(shí)吸光度是0.203，在2分鐘時(shí)，吸光度是0.166

HKU╱原液的ml數(shù)=（0.203-0.166）/min×0.963μmol/ml×1/0.01=3.56U/ml(在25℃)（c）6-磷酸葡萄糖脫氫酶分析

（ⅰ）將（a）中ⅰ-ⅵ試劑和0.1MTris–Mgbuffer放在25℃±0.2℃的水浴箱中，放20分鐘，使液體達(dá)到預(yù)定溫度（原液放冰箱保存，除非需移液時(shí)）。（ⅱ）6-磷酸葡萄糖脫氫酶試驗(yàn)試劑：在一個(gè)帶玻璃塞的錐形瓶中，混合等量的NAD+原液，ATP原液、葡萄糖、HK原液和Tris–Mg緩沖液，10ml可滿足最初的和重復(fù)三次分析量。

（ⅲ）6-磷酸葡萄糖脫氫酶稀釋液：取1ml6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液用0.2%Tris–ALB液稀釋至100ml。

（ⅳ）分析：將6-磷酸葡萄糖脫氫酶試驗(yàn)試劑、5ml6-磷酸葡萄糖脫氫酶稀釋液和含有5ml0.2%Tris–ALB液的密閉的試管放在25℃±0.2℃的水浴箱中大約10分鐘使液體達(dá)到預(yù)定溫度。

空白測定

Tris-ALB（ml）1.0——G6PDH稀釋液（ml）——1.0G6PDH試驗(yàn)試劑（ml）5.05.0

混勻，馬上轉(zhuǎn)移到已含有溫度控制在25℃±0.2℃樣本的分光光度計(jì)的2個(gè)檢測反應(yīng)杯中，在340nm連續(xù)測定5分鐘內(nèi)空白和試驗(yàn)管的吸光度，對(duì)5分鐘內(nèi)任意1分鐘吸光度變化應(yīng)基本一致，在0.005A/分以內(nèi)，對(duì)這個(gè)分析而言NAD+的下降表示分析偏差。

（ⅴ）6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液活性的計(jì)算

6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液活性={Atest(3分)-Atest(2分)}×（0.963μmol/mol）×(1/Vs)

=U/ml(25℃6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液)

Vs=在總反應(yīng)量中，酶原液的量（用ml表示）（上面給出的程序中，被加到反應(yīng)混合液中的1ml稀釋的6-磷酸葡萄糖脫氫酶包含0.01ml酶原液，因此Vs=0.01ml）。

其他因素的解釋見（b）(v)。（d）NAD+分析

（?。ⅲ╝）中足量的ⅱ-ⅵ試劑和0.1MTris–Mgbuffer放在25℃±1℃的水浴箱中，放20分鐘，使液體達(dá)到預(yù)定溫度（原液放冰箱保存，除非需移液時(shí)）。（ⅱ）NAD+試驗(yàn)試劑：在一個(gè)帶玻璃塞的錐形瓶中，混合等量的ATP原液、葡萄糖、HK原液、6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液和Tris–Mg緩沖液，10ml足夠。（ⅲ）稀釋NAD+：取5mlNAD+原液，用Tris–Mg緩沖液稀釋到100ml。（ⅳ）分析：將NAD+試驗(yàn)試劑、5ml稀釋NAD+和含有5mlTris–Mg緩沖液的密閉的試管放在25℃±1℃的水浴箱中大約10分鐘使液體達(dá)到預(yù)定溫度。

空白測定

Tris-Mg緩沖液（ml）1.0——NAD+稀釋液（ml）——1.0NAD+試驗(yàn)試劑（ml）5.05.0

混勻，馬上轉(zhuǎn)移到已含有溫度控制在25℃±1℃樣本的分光光度計(jì)的2個(gè)檢測反應(yīng)杯中，參與NAD+試驗(yàn)試劑10分鐘后，在340nm測定空白和試驗(yàn)管的吸光度。反應(yīng)在10分鐘內(nèi)達(dá)到平衡。（ⅴ）NAD+原液中NAD+濃度的計(jì)算：C=A/（E×b）×Vr/Vs

=Atest(10分)╱(6.23×103l.cm/mol.cm)×(6ml/0.05ml)=Atest(10分)×0.01926mmol╱ml=mmol╱ml(NAD+原液)C=濃度（mmol/ml）A=吸光度

E=摩爾吸光系數(shù)（對(duì)于本試驗(yàn)：值是6.23×103l/mol.cm）b=用cm表示的光徑Vr=用ml表示的總反應(yīng)體積

Vs=在總反應(yīng)體積中NAD+原液體積（用ml表示）

（ⅵ）本試驗(yàn)中NAD原液濃度至少應(yīng)在0.005mmol/ml之上，否則該來源NAD不能用于測定葡萄糖。（e）ATP分析：

（?。ⅲ╝）中足量的ⅱ-ⅵ試劑和0.1MTris–Mgbuffer放在25℃±1℃的水浴箱中，放20分鐘，使液體達(dá)到預(yù)定溫度（原液放冰箱保存，除非需移液時(shí)）。（ⅱ）ATP試驗(yàn)試劑：在一個(gè)帶玻璃塞的錐形瓶中，混合等量的NAD原液、葡萄糖、HK原液、6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液和Tris–Mg緩沖液，10ml足夠。（ⅲ）稀釋ATP：取5mlATP原液，用Tris–Mg緩沖液稀釋到100ml。（ⅳ）分析：將ATP試驗(yàn)試劑、5ml稀釋ATP和含有5mlTris–Mg緩沖液的密閉的試管放在25℃±1℃的水浴箱中大約10分鐘使液體達(dá)到預(yù)定溫度。

空白測定

Tris-Mg緩沖液（ml）1.0——ATP稀釋液（ml）——1.0ATP試驗(yàn)試劑（ml）5.05.0

混勻，馬上轉(zhuǎn)移到已含有溫度控制在25℃±1℃樣本的分光光度計(jì)的2個(gè)檢測反

+

+

+

應(yīng)杯中，參與ATP試驗(yàn)試劑10分鐘后，在340nm測定空白和試驗(yàn)管的吸光度。反應(yīng)在10分鐘內(nèi)達(dá)到平衡。（ⅴ）ATP原液中ATP濃度的計(jì)算C=Atest(10分)×0.01926mmol╱ml=mmol╱ml(ATP原液)

各因素來源解釋見（d）(v)

（ⅵ）假使ATP原液濃度300ml，應(yīng)配制更高濃度的酶原液。對(duì)于200ml的起始的酶溶液而言，參與純酶量相當(dāng)于起始試劑的4/5體積適合。

（ⅴ）用Tris–Mg緩沖液稀釋到1L，輕輕顛倒混勻，不要用力振蕩。（ⅵ）酶試劑配好后，馬上取100ml（100ml相當(dāng)19個(gè)試驗(yàn)）放入清潔、枯燥、帶螺旋帽的125ml深棕色的硼硅酸鹽玻璃瓶中，使用前保存于-20℃。配制和保存的酶試劑在這種條件下可穩(wěn)定大約6個(gè)月，分析當(dāng)天，從冰箱取出酶試劑放25℃水浴大約1小時(shí)或平衡至25℃±1℃。d酶試劑驗(yàn)證試驗(yàn)

（1）酶試劑穩(wěn)定性：取100mg/dl(5mmol/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)6ml，稀釋成相當(dāng)于600mg/dl(33mmol/L）標(biāo)準(zhǔn)的上清液，與15ml試劑水混合，用1ml這個(gè)稀釋液混合5ml酶試劑，馬上轉(zhuǎn)移到分光光度計(jì)的比色杯中，其次個(gè)比色杯不放試劑水（以試劑水為空白），在340nm紀(jì)錄30分鐘溶液吸光度變化。假使酶試劑與葡萄糖稀釋液混合后的溶液在6分鐘吸光度讀數(shù)在1.6-1.8A，在8和30分鐘時(shí)吸光度值≤0.010A，說明酶試劑質(zhì)量沒有問題。

（2）酶污染檢驗(yàn)：

加100mg果糖和50mgG-1-P到50ml容量瓶中，用安眠香酸稀釋到50ml，充分混勻，這是碳水化合物溶液。在一個(gè)錐形瓶上標(biāo)明“碳水化合物-葡萄糖〞，加1ml碳水化合物溶液和1ml200mg/dl(11.10mmol/L)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)，混合后加40ml試劑水，再混勻，在標(biāo)有“空白〞和“試驗(yàn)〞的2個(gè)試管中各參與5ml酶試劑，空白管加1.0ml安眠香酸稀釋液，試驗(yàn)管加1.0ml碳水化合物-葡萄糖溶液，充分混勻各管，不要猛烈震蕩，馬上轉(zhuǎn)移到經(jīng)過光徑標(biāo)準(zhǔn)的分光光度計(jì)的反應(yīng)杯中，在340nm波長以試劑水為空白測定并記錄各管吸光度。以碳水化合物溶液參與酶試劑的杯為零點(diǎn)。假使（a）試驗(yàn)管在6和30分鐘時(shí)吸光度的差值≤0.010A(b)空白管在6和30分鐘時(shí)吸光度的差值≤0.005A(c)30分鐘吸光度的差值≤0.08A(d)30分鐘時(shí)試驗(yàn)吸光度的茶汁再用一致方法或規(guī)定試驗(yàn)程序檢測是100mg/dl葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)吸光度-0標(biāo)準(zhǔn)吸光度的差值的4%以內(nèi)時(shí)，酶試劑證明是有效的，假使一臺(tái)分光光度計(jì)檢測和記錄一種溶液一試劑水的性能是可以接受的，首先進(jìn)行試驗(yàn)杯的測定，緊接著測定“空白杯〞，假使一臺(tái)分光光度計(jì)檢測和記錄三種溶液一試劑水的性能是可接受的，試驗(yàn)（1）和（2）可以同時(shí)進(jìn)行，假使有多個(gè)反應(yīng)杯，監(jiān)視和測定同時(shí)進(jìn)行，在進(jìn)行大量試驗(yàn)前先確定吸光度在0.100±0.01A時(shí)，平均被校正地讀數(shù)不超過這批平均吸光度的0.001。注意：作為已獲得的HK和6-磷酸葡萄糖脫氫酶的一個(gè)指南，配制酶試劑的酶質(zhì)量應(yīng)符合以下污染特征要求。污染酶HK界值6-磷酸葡萄糖脫氫酶界值2≤0.01%≤0.01%≤0.001%≤0.001%磷酸葡萄糖異構(gòu)酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶谷胱甘肽還原酶磷酸葡萄糖變位酶

1.占HK活性的百分比

≤0.003%≤0.001%≤0.005%2.占6-磷酸葡萄糖脫氫酶活性的百分比

e血清或血漿除蛋白濾液的配制（Somogyi濾液）

（1）在清潔尖底管中倒入每一種標(biāo)準(zhǔn)液足量，重新放入冰箱冷藏，將樣本和標(biāo)準(zhǔn)液放在25℃±1℃水浴箱30分鐘，標(biāo)記帶適合玻璃塞的50ml錐形瓶或用18×150nm尖底管。，樣本類型準(zhǔn)備0濃度標(biāo)準(zhǔn)其它工作標(biāo)準(zhǔn)2個(gè)生物控制樣品樣本在每批開始和終止時(shí)單獨(dú)分析安眠香酸稀釋液50，100，200，300和400mg/dl（2.78，5.55，11.10，16.65和22.20mmol/L）標(biāo)準(zhǔn)，每批開始和終止時(shí)單獨(dú)分析。適當(dāng)?shù)臐舛群头治鍪酚迷噭┧♂?gt;400mg/dl（22.20mmol/L）的血清和血漿樣本（2）用同一支加樣器轉(zhuǎn)移10ml0.11N的Ba(OH)2溶液到小瓶或試管中。（3）從標(biāo)記的瓶或管中用微量加樣器吸取1000ul液面下的第一層樣品，輕輕

吹出，用溶液完全沖洗加樣器2次，旋轉(zhuǎn)錐形瓶5-10秒，或旋轉(zhuǎn)管5秒，充分混勻。（4）在瓶或管中馬上參與10mlZnSo4溶液，蓋緊，猛烈振蕩，放一側(cè)進(jìn)行下

一樣本操作。半自動(dòng)操作：分派樣本和Ba(OH)2按以前縝密度特性要求可使用稀釋配液儀，對(duì)于ZnSo4溶液亦可使用高縝密度和可信性的固定量程分派器。假使這些半自動(dòng)步驟有穩(wěn)定縝密度，上面所有量可減至一半，用500ml樣品，5mlBa(OH)2和5mlZnSo4，使用穩(wěn)定的防腐劑可預(yù)防交織污染，在加樣后用無組織的布細(xì)心擦向下部分的尖。

（5）用力旋轉(zhuǎn)混合每一個(gè)瓶或管，混勻后馬上轉(zhuǎn)移到已標(biāo)記尖底離心管中，一

個(gè)18×150mm管即可，也可以使用小一些的可接受一份混合溶液的管，在1000轉(zhuǎn)/分開心10分鐘，用一個(gè)頂部盡可能長的移液器，將加樣器插入溶液前先調(diào)至B檔，防備吸取每一清潔、標(biāo)記管的上清液，每個(gè)樣品用單獨(dú)清潔的移液器，假使移液器被污染，移出接受管；假使離心分開用的是小管，在一個(gè)接受管中收集上清并混合，蓋上試管，放25℃±1℃水浴箱，測定每份上清液酶反應(yīng)。f酶反應(yīng)的測定和執(zhí)行

（1）標(biāo)記一系列清潔，帶螺旋帽的15×125mm的試管，供每份除蛋白上清液稀釋。

（2）每個(gè)管用單獨(dú)移液器或用低于0.2%（1CV）重復(fù)分派精度的試劑分派器加5ml酶試劑，將該管放25℃±1℃水浴箱。

（3）在適當(dāng)?shù)墓苤杏梦⒘恳埔浩饕迫∩锨逡阂好嫦?000ul酶試劑，輕輕吹出，在液層下完全沖洗加樣器2次，吹出剩余液體，蓋好蓋，輕輕顛倒混勻5次，重新放回25℃水浴箱10分鐘。

半自動(dòng)選擇：上述使用的符合縝密度要求的樣本稀釋儀加5.0ml酶試劑，1000μl樣本，按E4同樣方法預(yù)防交織污染。

（6）溫育10分鐘后，緩慢顛倒混勻，所有樣本在30分鐘內(nèi)加酶試劑，進(jìn)行比

色。時(shí)間不是很關(guān)鍵因素，但是比色有一系列嚴(yán)格規(guī)定，每個(gè)樣本在樣品參與到轉(zhuǎn)移至分光光度計(jì)反應(yīng)杯的大致一致的時(shí)間間隔讀數(shù)，使用一個(gè)反應(yīng)杯或滾動(dòng)比色杯測定，為了測定確鑿預(yù)先用約1ml溶液進(jìn)行預(yù)沖洗。（7）波長設(shè)定在340nm，用試劑水調(diào)零，讀取起始系列標(biāo)準(zhǔn)的吸光度，比色杯

完全沖洗后用試劑水再次調(diào)零，讀取樣本和質(zhì)控的吸光度，用試劑水再次調(diào)零，讀取最終系列標(biāo)準(zhǔn)的吸光度。在測定時(shí)若吸光度讀數(shù)漂移超過0.001A，必需增加調(diào)零次數(shù)，并用試劑水重新調(diào)儀器零點(diǎn)。g資料評(píng)估和計(jì)算結(jié)果

下面的指南是根據(jù)使用標(biāo)準(zhǔn)液和樣本葡萄糖濃度評(píng)估程序觀測提供的證明反應(yīng)而設(shè)計(jì)的。

（1）比色后，記錄6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液濃度的雙份（起始和最終）吸光度：0mg/dl，50

mg/dl，100mg/dl，200mg/dl，300mg/dl和400mg/dl，用最小二乘法獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（b）和截距（a）。每個(gè)單獨(dú)吸光度作為非獨(dú)立變異因素給出，它的濃度作為獨(dú)立因素使用，12個(gè)吸光度值和12個(gè)濃度用于