本文格式為Word版，下載可任意編輯——基因工程（跨課程）綜合性試驗講義廣東藥學院

基因工程（跨課程）綜合性試驗

基因工程·發(fā)酵工藝原理·生物技術藥物藥劑與藥動學

生命科學與生物制藥學院

基因工程（跨課程）綜合性試驗教學小組

2023年5月

（非正式出版物，請莫外傳）

基因工程（跨課程）綜合性試驗

目錄

前言??????????????????????????????3一、試驗項目??????????????????????????4二、試驗日程??????????????????????????7三、試驗分組??????????????????????????9四、試驗要求與質量控制?????????????????????10五、重組蛋白質藥物???????????????????????12（一）重組蛋白藥物背景知識???????????????????12（二）重組蛋白藥物試驗流程???????????????????161、工程菌構建?????????????????????????.192、工程菌表達篩選???????????????????????.213、甘油種制備?????????????????????????.254、生長曲線分析????????????????????????.275、表達影響因素試驗??????????????????????.306、表達進程分析????????????????????????.327、工程菌發(fā)酵工藝???????????????????????.348、表達產(chǎn)物分開純化??????????????????????.37附錄一：SDS???????????????????????..42六、重組DNA藥物???????????????????????..44（一）重組DNA藥物背景知識??????????????????..45（二）重組DNA藥物試驗

1、質粒DNA大規(guī)模制備?????????????????????.482、質粒-脂質體復合物制備????????????????????523、TCR體外基因轉染、表達檢測和活性檢測????????????.534、TCR體內給藥試驗??????????????????????.60附錄二

1、紫外吸收測定????????????????????????.612、可見光吸收測定???????????????????????.63

2

基因工程（跨課程）綜合性試驗

前言

生命科學與生物技術的最主要任務之一是利用其理論與技術研究成果為人類的健康服務，生物技術制藥則是其最主要的應用領域，且在重大傳染性疾病、惡性腫瘤及其它疑難雜癥防治方面具有巨大的潛力。藥品的研究開發(fā)是一項巨大的系統(tǒng)工程，試驗室研究發(fā)現(xiàn)的任何候選藥物要開發(fā)成新藥都需要經(jīng)過生產(chǎn)工藝和質量控制研究、有效性評價和安全性評價等過程。需要特別指出的是，生產(chǎn)工藝和質量控制研究的內容和任務還會始終貫穿于產(chǎn)品投產(chǎn)上市的過程中，相應的技術手段也是作為企業(yè)生產(chǎn)或質量控制人員必備的技能。因此，作為生命科學與生物制藥學院的本科生，了解生物技術藥物研究、開發(fā)和生產(chǎn)的過程、把握與生產(chǎn)工藝和質量控制研究密切相關的技術手段是十分必要的。

以蛋白質為基礎的基因工程藥物和基因工程抗體是當今最主要的生物技術藥物形式，以DNA為基礎的基因治療制劑和DNA疫苗是未來生物制藥的主要發(fā)展方向之一。《基因工程》、《發(fā)酵工藝原理》和《生物技術藥物藥劑與藥動學》是與重組蛋白質和重組DNA類藥物的生產(chǎn)工藝與質量控制研究、以及安全性與有效性評價方面關系最為密切的專業(yè)課程，且相互構成了基因工程制藥的上、下游關系。本綜合性試驗即為上述三門課程的跨課程綜合性試驗，其目的在于培養(yǎng)學生理論聯(lián)系實際的能力，對重組蛋白質和重組DNA等當今和未來最主要的二大類生物技術藥物的研究、開發(fā)和生產(chǎn)有一個系統(tǒng)的了解，使所學課程的理論知識和實踐技能系統(tǒng)化，為以后從事生物技術藥物方面的工作打下較好的基礎。

本綜合性試驗分為“重組蛋白質類藥物〞和“重組DNA類藥物〞二個單元?！爸亟M蛋白質藥物〞單元設置了包括工程菌構建、發(fā)酵和分開純化工藝等基因工程藥物主要工藝研究內容在內的試驗項目；“重組DNA藥物〞單元設置了包括質粒DNA大規(guī)模制備、質粒-脂質體復合物制備、體外基因轉染和體內給藥試驗等DNA藥物主要研究內容在內的試驗項目。在具體試驗內容設置時，綜合考慮了前修課程《分子生物學》和《生物工程下游技術》的試驗課已學內容、本綜合試驗總學時數(shù)（108學時）和試驗室現(xiàn)有條件等因素。

3

基因工程（跨課程）綜合性試驗

一、綜合試驗項目

（見圖1和表1）

綜合試驗I重組蛋白質類藥物1、工程菌構建II重組DNA類藥物1、TCR工程菌構建2、工程菌表達篩選2、TCR質粒DNA大規(guī)模制備3、工程菌甘油種制備3、TCR質粒-脂質體復合物制備4、工程菌生長曲線分析4、TCR體外基因轉染5、表達進程與影響因素分析5、TCR轉染基因表達檢測6、工程菌發(fā)酵6、TCR轉染體外活性檢測7、表達產(chǎn)物分開純化7、TCR轉染體內試驗（藥代、藥效）圖1綜合試驗單元與項目

4

基因工程（跨課程）綜合性試驗

表1基因工程（跨課程）綜合性試驗項目說明

序號I試驗項目公開課重組蛋白質藥物工程菌構建學時450求等。已完成?；叵牍こ叹鷋IL-18（PR/PL控制下的hIL-18，1242℃誘導）和GST（Ptac控制下的GST，IPTG誘導）的構建。2工程菌表達篩選工程菌甘油種制備工程菌生長分析誘導時機對5工程菌生長與表達的影響678II12

說明介紹綜合試驗設計思路、內容、流程、實施計劃、要從pVB220-hIL-18轉化子中隨機選取8株，溫控表達，10SDS分析表達結果，選取一高表達菌株作為hIL-18的工程菌。26將選定的hIL-18工程菌制成甘油種保存于-70℃。利用工程菌生長過程中的菌體密度測定繪制生長曲線、了解生長特性。觀測生長曲線中的早、中、晚期對菌體生長與目的基因表達水平的影響，以決定表達誘導最正確時機。觀測工程菌表達誘導過程中目的產(chǎn)物積累進程。以GST菌株進行。菌種活化起始的發(fā)酵工藝全過程及全自控發(fā)酵設備與單元操作演示超聲波法破碎菌體，包涵體分開、純化，變性與復性、柱層析純化（示教)。已完成，回想目的基因克隆、表達載體（pDNA3.1-TCRVβ7.1）構建。工程菌培養(yǎng)、堿法裂解、陰離子交換柱層析純化、瓊5

3410工程菌表達進程分析工程菌發(fā)酵表達產(chǎn)物分開純化重組DNA藥物工程菌構建質粒DNA大102650210

基因工程（跨課程）綜合性試驗

規(guī)模制備34質粒-脂質體復合物制備T淋巴細胞體外轉染轉染T細胞5目的基因表達檢測轉染T細胞6體外活性檢測轉染T細胞7體內給藥試驗試驗總結暨

試驗技能知識競賽41010468脂糖電泳鑒定、DNA純度測定。以脂質體包被純化所獲重組質粒，以紫外吸收法測定包封率。以質粒-脂質體復合物轉染T細胞以流式細胞儀分析轉染T細胞中目的基因的表達狀況（學生制備樣品、老師操作流式細胞儀）。以轉染的T細胞攻擊肝癌細胞，以流式細胞儀分析殺瘤活性（學生制備樣品、老師操作流式細胞儀）。荷瘤鼠建模、目的基因體內轉染與表達分析（部分內容示教）。對綜合試驗性試驗進行總結，講解試驗報告要求，并據(jù)狀況組織相關知識競賽。

6

基因工程（跨課程）綜合性試驗

二、試驗日程

（日期：07/6/4——07/6/22；作息時間：9:00-21:30）

04（1）班04（2）班（先做重組蛋白質藥物單元）（先做重組DNA藥物單元）Am：綜合試驗公開課（課室：B2-314，8:30準時開始）Pm：單元探討、IL-18工程菌構建、IL-18菌種活化接種和平板劃線接種工程菌表達篩選（溫控表達誘導）工程菌生長曲線分析工程菌表達篩選SDS－PAGE（凝膠保存?zhèn)溆茫?，選定菌株，接種Pm：單元探討、TCR工程菌構建、TCR菌種活化接種質粒DNA大規(guī)模制備：堿法裂解、中和、異丙醇沉淀、洗鹽質粒DNA大規(guī)模制備：層析純化、電泳鑒定、紫外吸收法測定質粒純品純度和濃度班級日程第1天4日/6月星期一第2天5日/6月星期二第3天6日/6月星期三第4天7日/6月星期四第5天8日/6月星期五第6天9日/6月星期六工程菌甘油種制備質粒-脂質體復合物制備、包封率測表達影響因素試驗（誘導時機的影響）定、T細胞體外基因轉染表達進程試驗接種（GST菌種）表達影響因素試驗SDS（膠保存?zhèn)溆茫┍磉_進程試驗（IPTG誘導、不同時間點取樣）準備轉染T細胞體外活性檢測之一：腫瘤細胞接種，培養(yǎng)轉染T細胞目的基因表達檢測：T細胞-腫瘤細胞共培養(yǎng)、流式樣品制備和檢測轉染T細胞體外活性檢測之二：流式細胞儀分析細胞凋亡第7天準備10日/6月星期日第8天表達進程分析SDS（膠保存?zhèn)溆茫┺D染T細胞體內給藥試驗11日/6月試驗結果探討與分析、看病理與免疫星期一組化照片第9天SDS凝膠掃描分析（三次電泳膠）準備12日/6月發(fā)酵罐觀摩（418室）星期二第10天表達產(chǎn)物產(chǎn)物的分開純化（示教）13日/6月試驗結果分析與探討星期三重組DNA藥物單元開始，TCR菌種接種第11天質粒DNA大規(guī)模制備：堿法裂解、中14日/6月和、異丙醇沉淀、洗鹽星期四第12天

準備工程菌表達篩選（溫控表達誘導）（前一天下午IL-18接試管與平板劃線）工程菌生長曲線分析工程菌表達篩選SDS－PAGE質粒DNA大規(guī)模制備：離子交換層7

基因工程（跨課程）綜合性試驗

15日/6月析純化、電泳鑒定、紫外吸收法測定質星期五粒純品純度和濃度第13天準備16日/6月星期六第14天下午接種（每組派1個代表）17日/6月星期日（凝膠保存?zhèn)溆茫x定菌株。準備下午接種（每組派1個代表）第15天質粒-脂質體復合物制備、包封率測定、工程菌甘油種制備18日/6月T細胞體外基因轉染表達影響因素試驗（誘導時機的影星期一響）表達進程試驗接種（GST菌種）第16天轉染T細胞體外活性檢測：腫瘤細胞接19日/6月種，培養(yǎng)星期二第17天轉染T細胞體外活性檢測：T細胞與腫20日/6月瘤細胞共培養(yǎng)星期三第18天轉染T細胞體外活性檢測與目的基因表21日/6月達檢測：流式細胞儀分析星期四第19天轉染T細胞體內給藥試驗22日/6月試驗結果探討與分析星期五表達影響因素試驗SDS（膠保存?zhèn)溆茫┍磉_進程試驗（IPTG誘導、不同時間點取樣）表達進程分析SDS（膠保存?zhèn)溆茫㏒DS凝膠掃描分析（三次電泳膠）發(fā)酵罐觀摩（418室）表達產(chǎn)物產(chǎn)物的分開純化（示教）試驗結果分析與探討備注：

1）帶有陰影字體所述試驗的菌株為GST菌株（Tac啟動子，IPTG誘導）。2）綜合試驗公開課安排（第一天，6月4，星期一）

8：30～9：00黃院長講話（開設試驗的背景、對學生的要求）9：00～10：30全體試驗教師亮相，然后由李黃金做綜合試驗整體介紹10：30～10：40休息十分鐘

10：50～12：00就試驗安排和內容等提問和答疑（雙向）（請安排有經(jīng)驗學生攝影)

13：30分班按所進行的試驗單元進行工程菌構建回想與探討（以試驗室分班和小組為單位）

8

基因工程（跨課程）綜合性試驗

三、試驗分組

1、分組

每個班按學號順序分為8組，組號按序依次為1－8組，每組人數(shù)分別為9、9、9、8、8、8、8、8。涉及到排序的試驗項目，如在超凈工作臺上的接種步驟，一律按1到8組順序進行。

2、編號

試驗過程中必需對試管、搖瓶等進行標記，故統(tǒng)一進行編號。編號規(guī)則為：班代表字母+組號-成員號，A代表1班，B代表2班。舉例：

04（1）班1組1號同學挑取的轉化子標記為A1-1；04（1）班8組8號同學挑取的轉化子標記為A8-8；04（2）班1組1號同學挑取的轉化子標記為B1-1；

04（2）班8組8號同學挑取的轉化子標記為B8-8；其余以此類推。

3、試驗安排

生物制藥04（1）班先進行“重組蛋白質藥物〞單元的試驗，然后進行“重組DNA藥物〞單元的試驗。生物制藥04（2）班先進行“重組DNA藥物〞單元的試驗，然后進行“重組蛋白質藥物〞單元的試驗。具體教室見試驗中心的通知。

4、本卷須知

由于綜合試驗內容比較多，希望各位同學精誠合作，特別是分光光度計、離心機等儀器的使用，由于數(shù)量有限，請發(fā)揚團隊精神，盡量按順序或同步進行以儉約時間。

9

基因工程（跨課程）綜合性試驗

四、試驗要求與質量控制

綜合試驗涉及的知識點和試驗技術眾多，為了培養(yǎng)學生嚴謹求實、科學求真之精神，并達到綜合試驗之最大成效，以下對本綜合試驗過程的要求進行說明，且納入試驗考核成績。

1、預習

試驗前須充分預習，要求隨機抽查時，每一位同學能夠明了的闡述整體試驗思路和具體的試驗項目、原理。

2、試驗過程

除了遵守學校與學院一般試驗紀律與要求外，還必需做到主動性、能動性與團隊精神相接合，利用有限的資源與時間得到最好的培訓與試驗結果。為此，本綜合試驗將能否在規(guī)定時間內完成試驗內容作為衡量學生動手能力的關鍵指標之一，并作為考核結果記入試驗成績中。要達到此目的，同學們必需提前細心閱讀試驗講義，全面了解試驗內容，透徹理解試驗原理，熟悉各個操作步驟，并在試驗過程中合理安排時間。

3、試驗原始記錄與結果整理

每天必需及時、真實、完整地記錄當天所做試驗狀況，記錄試驗過程中的異常狀況，分析其原因，并將下述關鍵性試驗結果整理于試驗報告紙：I重組蛋白質藥物單元：

1）表達篩選與甘油種制備：隨機挑揀轉化子表達誘導SDS凝膠掃描照片、篩選確定的工程菌株株號及其表達水平（%）。

2）生長曲線分析：選定工程菌培養(yǎng)過程中的OD600測定結果表及生長曲線圖。3）表達影響因素試驗：不同誘導時機表達誘導試驗誘導前、后樣品的SDS凝膠掃描照片、表達水平、OD600值。

10

基因工程（跨課程）綜合性試驗

4）表達進程試驗：工程菌（GST）表達誘導過程不同時間點樣品SDS凝膠掃描照片、表達水平。

5）表達產(chǎn)物分開純化：示教分析與探討II重組DNA藥物單元：

3）質粒DNA大規(guī)模制備：陰離子交換純化層析圖、提取和純化過程中樣品瓊脂糖電泳圖、質粒純品純度和濃度測定結果。3）質粒-脂質體復合物制備：包封率測定結果

3）基因轉染、體外表達、體外活性、體內給藥：示教分析與探討

4、綜合試驗報告

須按《基因工程（跨課程）綜合試驗論文撰寫規(guī)范》撰寫、并提交綜合試驗報告（電子打印版及電子版）。1）封面：

標題：基因工程（跨課程）綜合性試驗論文姓名：班級：學號：

指導教師：李黃金、周林、胡海梅、趙林、陳偉、段濤、張玲、袁茵

薄華本、王金全、吳鳳麟

廣東藥學院

生命科學與生物制藥學院生物制藥研究所2)知識產(chǎn)權申明

本綜合性試驗所采用的工程菌株與工藝技術參數(shù)主要來源于廣東藥學院生物制藥研究所的相關課題與研究成果，相關知識產(chǎn)權歸廣東藥學院生物制藥研究所所有，未經(jīng)許可不得擅自影印相關講義和使用相關工程菌株與工藝技術參數(shù)。3)論文內容中英文摘要英文摘要前言材料與方法結果與探討基因工程（跨課程）綜合性試驗

（二）重組蛋白藥物模塊試驗流程

1th1.工程菌構建2.表達篩選2.1菌種活化綜合試驗課公開課（上午）工程菌構建回想接LB+AP試管（8株，編號）LB+AP平板劃線（編號）37℃振蕩培養(yǎng)過夜37℃靜置培養(yǎng)過夜2th2.2表達誘導4.生長曲線分析轉接LB+AP試管轉接LB+AP搖瓶平板4℃保存37℃培養(yǎng)2.5-4hr37℃培養(yǎng)42℃誘導培養(yǎng)4hr不同時間點取樣測OD值離心收菌，4℃保存繪制生長曲線3th8株菌體+非誘導菌體+Marker2.3表達篩選SDSSDS脫色凝膠置于10%甘油保存至第7天掃描，求表達水平確定高表達菌株從劃線平板選擇對應高表達菌株轉接LB+AP搖瓶37℃培養(yǎng)過夜16

基因工程（跨課程）綜合性試驗

4th5.表達影響因素試驗（誘導時機）

3.工程菌甘油種制備

每人1支，-20℃保存

5.2表達誘導轉接3×LB+AP（20-50ml）早、中、晚期誘導4hr取GST菌株接2mlLB+AP誘導前后取樣測OD值37℃培養(yǎng)過夜5th3×2菌體樣6.表達進程分析轉接LB+AP搖瓶5.2表達因素試驗SDSSDSIPTG誘導5hr脫色凝膠置于10%甘油保存至第7天掃描不同時間點取樣6th誘導0、1、2、3、4、5hr菌體樣6.2表達進程分析SDSSDS脫色凝膠置于10%甘油保存至第7天掃描7thSDS凝膠掃描分析7．發(fā)酵工藝（觀摩）

17

基因工程（跨課程）綜合性試驗

8th8、表達產(chǎn)物分開純化

工程菌破菌、包涵體純化、變性、復性、純化（示教）

重組蛋白藥物模塊試驗結果分析與探討

18

基因工程（跨課程）綜合性試驗

試驗一工程菌構建

（工程菌構建回想）

1.pBV220-hIL-18表達載體和工程菌構建

在本綜合性試驗中目的基因的表達載體為pBV220，該載體的物理圖譜見圖2。該載體有一個氨芐青霉素抗性基因，在多克隆位點的上游為λ噬菌體的PL和PR啟動子，PL和PR啟動子受λ噬菌體CI基因的負調控。CI阻遏蛋白是溫度敏感蛋白，在28-37℃培養(yǎng)時，CI產(chǎn)生抑制作用，在溫度升至42℃時，CI被破壞，這樣就解除了對啟動子的封閉，使PL和PR啟動子開始下游基因轉錄。

目的基由于hIL-18的編碼序列（cDNA），采用RT-PCR技術從外周血細胞中獲得。首先據(jù)Genebank報道序列設計引物，并在引物的5’端引入EcoRI位點和啟始密碼子ATG，在3’端引入HindⅢ位點。IL-18基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和HindⅢ雙酶切插入表達載體pBV220的一致位點即得hIL-18的表達載體pBV220-hIL-18。

構建的表達載體pBV220-hIL-18按常規(guī)方法轉化大腸桿菌DH5α株后即得“重組hIL-18〞的工程菌。

圖3pBV220的物理圖譜

19基因工程（跨課程）綜合性試驗

2.pGEX-GST表達載體和工程菌構建

pGEX-GST為商品化融合表達載體，主要用于外源基因的可溶性融合表達。GST（谷胱甘肽轉移酶）為大腸桿菌宿主細胞的自然高效、可溶性表達的蛋白。以其作為融合表達“標簽〞有二點優(yōu)勢：a)GST可以促進二硫鍵的形成，使目的基因融合表達產(chǎn)物能正確折疊，因而常以可溶的表達產(chǎn)物存在；b)GST屬于大腸桿菌高效表達的自然產(chǎn)物，其mRNA的5‘端具有最適的結構，有利于融合基因mRNA的翻譯，因此可大大提高融合基因表達水平。

在pGEX-GST中，GST處于復合啟動子Tac的控制之下，因此可采用IPTG誘導。其載體如圖4所示，圖中所示載體中還有一個特別設計，即GST與目的蛋白的融合位點位PreScission蛋白酶識別位點，融合蛋白可在4℃下進行酶切反應，可避免其它蛋白酶類37℃那樣的高溫條件對目的產(chǎn)物的破壞。本綜合試驗中采取的是無外源基因的載體，即只表達GST，主要用于給同學們展示與pVB220-hIL-18不同的另一種啟動子和表達誘導方式（PL/PRvsTac；溫控vsIPTG誘導），并便于“表達進程分析〞。

圖4pGEX-GST的物理圖譜

20

基因工程（跨課程）綜合性試驗

試驗二工程菌表達篩選

一、試驗目的

學習與把握大腸桿菌系統(tǒng)工程菌表達篩選的方法。

二、試驗原理

含目的基因的表達載體轉化宿主細胞后，會得到好多含有重組子的克隆，但這些含有重組子的不同克隆表達目的蛋白的能力是不一致的。首先誘導不同克隆進行目的基因表達，然后利用SDS－PAGE對菌體總蛋白進行分開，再通過凝膠掃描分析各克隆的目的產(chǎn)物表達水平差異即可篩選到高表達菌株。

三、試驗試劑

1、pBV220-hIL-18轉化平板

2、LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，定容至1L，用5MNaOH調PH值至7.0。15psi（1.05Kg/cm2）高壓蒸汽滅菌20min。3、瓊脂粉

4、氨芐青霉素：儲存液濃度50mg/ml，用水溶，保存于－20℃。工作濃度：松弛型質粒50ug/ml，嚴緊型質粒20ug/ml。

5、2×SDS上樣緩沖液：0.1mol/LTris（pH6.8）、4％SDS、20％甘油、0.2％溴酚籃、200mmol/LDTT（或10％β－巰基乙醇），4℃保存。6、10％APS，TEMED和DTT存放在4℃冰箱。

7、10×電泳緩沖液：Tris6g、glycine28.8g、SDS10g，pH調至8.3，定容至1L。8、30％膠母液（Acr－Bis）：30％acrylamide、0.8％bis（即acrylamide30g、bis0.8g定容至100ml），可在4℃存放數(shù)月。9、分開膠緩沖液（pH8.8）：1.5MTrsi－HCl。10、

濃縮膠緩沖液（pH6.8）：1.0MTrsi－HCl。

11、10％SDS

12、考馬斯亮籃染色液：1.25g考馬斯亮籃R250、450ml甲醇、50ml冰醋酸、500ml水。

21

基因工程（跨課程）綜合性試驗

13、脫色液：450ml甲醇、50ml冰醋酸、500ml水。14、10%（V/V）甘油

四、試驗用具

無菌竹簽、微量移液器、平皿、10-15ml帶螺口或帶塞試管、恒溫搖床、4℃冰箱、離心機、EP管、電爐、電泳儀、垂直電泳裝置、臺式脫色搖床、凝膠成像系統(tǒng)。

五、試驗方法

（一）目的蛋白的誘導表達

1、轉化（已完成）：轉化后的細胞在含有50ug/ml氨芐青霉素的LB平板上，培養(yǎng)過夜后，在平板上會長出大量抗性菌落（轉化子）。2、菌種活化和平板劃線接種

在無菌操作條件下，用無菌竹簽隨機挑取中等大小菌落的克隆，先在含有50ug/ml氨芐青霉素的LB平板上輕輕劃線接種，線長約為1cm，隨后用帶有剩余菌體的牙簽接種含有2mlLB培養(yǎng)基（含50ug/ml氨芐青霉素）的帶蓋螺口試管，如此類推。

每個學生接種1株，共接種8個轉化子單克隆，每個小組共用一個平板；及時、確鑿做好劃線平板與試管的對應編號和平板編號標記。平板和試管種分別置于37℃培養(yǎng)箱和搖床培養(yǎng)過夜。

3、把培養(yǎng)過夜的畫線平板保存于4℃冰箱。

4、取2步驟所得支試管的菌液（20ul）按1：100的接種比例分別接種到8支含有2mlLB培養(yǎng)基（含50ug/ml氨芐青霉素）的試管中，37℃培養(yǎng)2.5hr，42℃誘導培養(yǎng)4hr。每個小組設一非誘導對照，即以該組編號排首位的過夜活化菌種接種一支試管，標記為CK1，37℃培養(yǎng)2.5hr收菌，不做42℃表達誘導。5、離心收菌

表達誘導至4hr后，將試管收集、并置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（二）工程菌表達篩選SDS－PAGE

22

基因工程（跨課程）綜合性試驗

1、樣品組成：

每小組共用一膠，每膠10孔，1號孔為非誘導菌體蛋白（對照CK1），2-9號孔為自小至大編號的菌株誘導菌體蛋白，10號孔為蛋白質分子量標準（MM）。2、菌體樣品處理

取培養(yǎng)物100ul于EP管，5000g×5min離心，棄上清，菌體參與40ul上樣緩沖液，100℃水浴3min，待冷卻后10000g×10min離心，防備吸取上清，轉入另一標記好的EP管，室溫保存?zhèn)溆茫ㄈ玳L期放置，則置于4℃保存，電泳前再煮沸2分鐘）。3、SDS

參照附件所述詳細方法進行。

膠濃度：分開膠濃度12%；濃縮膠5%；上樣量：15ul

恒流:濃縮20mA，分開30mA；染色、脫色：甲醇/冰醋酸系統(tǒng)

凝膠保存：10%甘油，室溫，至凝膠掃描分析。

（三）凝膠掃描分析

參照附件所述詳細方法進行。

六、本卷須知

1、轉化后的大腸桿菌必需在含有適當抗生素的LB平板上進行培養(yǎng)，接種到試管中的菌落必需是單菌落，并且要同時進行劃線培養(yǎng)。2、進行劃線培養(yǎng)時各條線之間不能太密集，防止交織污染。

3、樣品加上上樣緩沖液煮沸后，一定要進行離心，以除去顆粒物質。4、電泳上樣時要防備，不要污染旁邊的泳道。

七、評議

1、過夜培養(yǎng)所得菌體按1：100接入到新的培養(yǎng)基中后，37℃培養(yǎng)2.5hr一般能達到OD600＝0.6，此時即為對數(shù)中期。但是各菌株間生長速度常有較大差異，

23

基因工程（跨課程）綜合性試驗

所以菌體密度常不一致，但以一致時間和條件培養(yǎng)、誘導能基本反映出菌株生長速度和表達水平差異，因此，各試管（菌株）之間的培養(yǎng)時間一定要一致。2、電泳中出現(xiàn)不規(guī)則的蛋白遷移帶是由于電泳不穩(wěn)定，其它原因還包括樣品加量太多、樣品中的鹽濃度太高、邊緣效應。假使在凝膠邊緣電泳條帶出現(xiàn)“微笑〞狀的樣品（運動速度減慢），可能是由于凝膠的中間比兩側更熱，應降低電流。

八、思考題

1、單克隆接種到試管中培養(yǎng)時，為什么同時進行劃線培養(yǎng)？

2、SDS－PAGE中蛋白質樣品上樣前，參與上樣緩沖液的目的是什么？為什么還要在100℃沸水中，加熱3-5min？

24

基因工程（跨課程）綜合性試驗

試驗三工程菌甘油種的制備

一、試驗目的

將高表達的工程菌制備成可中、長期保藏的菌種，把握甘油種的制備方法。

二、試驗原理

菌種保存是工程菌研究和生產(chǎn)應用的基礎，為了避免長期傳代可能引起的菌種變異，應建立適合長期保藏的工程菌菌種并進行保藏。菌種保藏的方法主要有固體斜面法、甘油凍存法、冷凍枯燥法。本試驗采用甘油種結合超低溫（-70℃）保存的方法，即用無菌甘油懸浮工程菌，并使甘油終濃度為30%（V/V），所獲物即為工程菌的甘油種。低溫可使工程菌的生命活動處于非活躍狀態(tài)而能較長時間保存細胞活力、減少基因變異，而30%的甘油可保護菌種的細胞膜系統(tǒng)在冷凍與解凍循環(huán)中不被破壞而起到保護作用。

三、試驗試劑和試驗用具

1.pBV220-hIL-18轉化子劃線平板2.抗性LB液體培養(yǎng)基3.抗性LB平皿

4.60％甘油121℃，30分鐘高溫滅菌

5.菌種保存管（EP管）121℃，30分鐘高溫滅菌6.10ml螺口試管121℃，30分鐘高溫滅菌7.恒溫培養(yǎng)箱8.恒溫振蕩器9.無菌工作臺10.滅菌牙簽與酒精燈

四、試驗方法

1.在試驗二中所獲平板上確定高效表達的轉化子所對應的菌株，并用滅菌

竹簽接種于一個含2ml抗性LB培養(yǎng)基的試管中。

25

基因工程（跨課程）綜合性試驗

2.37℃振蕩培養(yǎng)過夜（10-15小時）。

3.按1：1（V/V）的比例參與無菌的60％甘油，混勻后分裝至事先滅菌

的菌種保存管（1ml/管），-70℃保存。

五、試驗本卷須知

此過程全部在無菌工作臺中操作，注意操作保持始終無菌。

26

基因工程（跨課程）綜合性試驗

試驗四工程菌生長曲線分析

一、試驗目的

學習用比濁法測定工程菌的生長曲線并了解其特點，把握工程菌生長曲線的繪制方法及測定原理，理解生長曲線在研究和生產(chǎn)中的應用。二、試驗原理

將工程菌按一定比例接種到一定體積的、適合的新鮮培養(yǎng)基中，在適合的條

件下進行培養(yǎng)，定時測定培養(yǎng)液中的菌體量，以菌體量的對數(shù)作縱坐標，生長時間作橫坐標，繪制的曲線叫生長曲線。它反映了單細胞微生物在一定環(huán)境條件下于液體培養(yǎng)時所表現(xiàn)出的群體生長規(guī)律。依據(jù)其生長速率的不同，一般可把生長曲線分為延緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。這四個時期的長短因菌種的遺傳性、接種量和培養(yǎng)條件的不同而有所改變。因此通過測定微生物的生長曲線，可了解各菌的生長規(guī)律，對于科研和生產(chǎn)都具有重要的指導意義。

測定微生物的數(shù)量有多種不同的方法，可根據(jù)要求和試驗室條件選用。本試驗采用比濁法測定，由于細菌懸液的濃度與光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度計測定菌懸液的光密度來推知菌液的濃度，并將所測的OD值與其對應的培養(yǎng)時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線，此法快捷、簡便。三、試驗材料3.1菌種IL-18工程菌3.2培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基（Amp+）3.3試劑去離子水四、試驗儀器與器具

可見光分光光度計（配1cm光程的比色杯），恒溫搖床，超凈工作臺，移液器，Tip頭，EP管，玻璃試管，500mL的三角瓶，擦鏡紙。五、試驗步驟與方法

試驗流程為：種子液→接種→培養(yǎng)→測定

27

基因工程（跨課程）綜合性試驗

5.1種子液制備

取IL-18工程菌的甘油菌種1管，按1%的接種量在超凈工作臺取20uL，接入2mLLB(Amp+)中，然后傾斜地置于搖床中，37℃，170rpm搖床培養(yǎng)過夜。5.2接種培養(yǎng)并取樣

按1%的接種量，在超凈工作臺將過夜培養(yǎng)的2mLIL-18工程菌種子液，接入到200mLLB(Amp+)中，搖勻后取出3mL置于EP管中，用于測0小時的OD值。

將搖瓶放在搖床中，37℃，170rpm振搖培養(yǎng)。此時開始計時，然后每培養(yǎng)1小時將三角瓶取出置于超凈工作臺中，取樣測定其OD值，共測定8小時。其中，前3小時每次取樣3mL，之后每次取樣1mL。5.3生物量測定

開啟可見光分光光度計電源，調理波長至600nm，將光標移至T處，開啟樣品室的蓋子，預熱30min。取3mL未接種的LB(Amp+)培養(yǎng)基裝入1cm光程的比色杯中，置于樣品室中第一個樣品槽中，使可見光射入此比色杯中，作為空白對照，儀器將自動調零。將待測樣品參與比色杯中（前3個樣品由于OD值低可直接參與，后續(xù)的樣品由于OD值高需用2mLLB稀釋后再參與。），蓋上蓋子，將光標調至A處，空白樣品的OD值自動調整為0。拉動拉桿，依次對樣品讀數(shù)，并記錄。5.4生長曲線繪制

將測定的OD值填入下表：時間OD0h1h2h3h4h5h6h7h8h以上述表格中的時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制IL-18工程菌的生長曲線。六、試驗本卷須知

用可見光分光光度計測量菌液OD600值時，該值在0.30～0.80以內時，OD600與菌液濃度成正比，超過此范圍，就不成正比了。對濃度大的菌懸液用未接種的LB液體培養(yǎng)基適當稀釋后測定，經(jīng)稀釋后測得的OD值要乘以稀釋倍數(shù)，才是培養(yǎng)液實際的OD值。

28

基因工程（跨課程）綜合性試驗

七、評議

在本試驗中，通過從同一培養(yǎng)物中每隔一小時取一致量的樣來測其OD600，從而繪制生長曲線。也可用一致的菌種，同時培養(yǎng)若干瓶菌液，每一小時取出一瓶中止培養(yǎng)來測其OD600值，下一小時再取出一瓶，一直到培養(yǎng)的最終一小時只剩下一瓶，通過此方法可以避免取樣對微生物生長培養(yǎng)造成的影響。八、思考題

1．用本試驗方法測定微生物生長曲線，有何優(yōu)點？

2．若同時用平板計數(shù)法測定，所繪出的生長曲線與用比濁法測定繪出的生長曲線有何差異？為什么？

29

基因工程（跨課程）綜合性試驗

試驗五工程菌表達影響因素試驗

一、試驗目的

了解和把握誘導時機對工程菌表達的影響，進一步理解工程菌生長和表達的矛盾關系，通過試驗確定出IL-18工程菌最正確的誘導時機。二、試驗原理

基因工程菌的培養(yǎng)一般分兩段。前期是菌體生長，生長到某一階段，參與誘導因子，誘發(fā)產(chǎn)物表達。參與誘導因子的時間被稱為誘導時機。對于基因工程菌一般選擇其對數(shù)生長期作為菌體的誘導時機。假使在對數(shù)生長早期進行誘導，由于菌體量較少，蛋白的表達量不高。在對數(shù)生長中期進行誘導，工程菌的生長速度比較快，這時蛋白的積累加快，蛋白表達水平較高。而菌體進入對數(shù)期后期，由于發(fā)酵液中營養(yǎng)的消耗，氧氣的缺乏及代謝產(chǎn)物的積累，使菌體的生長速度明顯受到抑制。在此狀態(tài)下誘導，表達顯然受到影響。三、試驗試劑3.1菌種IL-18工程菌3.2培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基（Amp+）3.3試劑去離子水四、試驗儀器與器具

恒溫搖床，超凈工作臺，移液器，臺式高速離心機，Tip頭，EP管，玻璃試管，100mL的三角瓶，SDS電泳設備。五、試驗步驟與方法5.1種子液制備

取IL-18工程菌的甘油菌種1管，按1%的接種量分別接入3管2mLLB(Amp+)液體培養(yǎng)基中，然后傾斜地置于搖床中，37℃，170rpm搖床培養(yǎng)過夜。5.2接種培養(yǎng)并誘導表達

按1%的接種量，將3管過夜培養(yǎng)的IL-18工程菌種子液，分別接入到30mL

30

基因工程（跨課程）綜合性試驗

LB(Amp+)中，同時置于搖床中37℃，170rpm振搖培養(yǎng)。培養(yǎng)至2.5h時，取出一瓶，在超凈工作臺中取出3mL測其生物量，然后做好標記，轉移至42℃進行誘導表達。當培養(yǎng)至4h時，再取出一瓶，同樣地取出3mL測生物量、標記、轉移至42℃誘導表達。當培養(yǎng)至6h時，取出最終一瓶，如前取樣、標記、誘導表達。三瓶菌體均誘導表達4h。5.3誘導表達終止菌體處理

三瓶菌體經(jīng)過4h誘導表達后，從搖床中取出，掏勻后吸取1mL用于測定生物量，另取1mL置于-20℃凍存。5.4SDS檢測不同誘導時機的表達量

將-20℃凍存的菌體解凍后，取出100uL，10000rpm離心3min，棄掉上清，用40uL2×上樣緩沖液懸浮起來，按試驗一和附錄一進行SDS電泳。六、思考題

根據(jù)結果中的OD值和SDS電泳的結果，分析工程菌生長和表達的關系。

31

基因工程（跨課程）綜合性試驗

試驗六工程菌表達進程分析（GST）

一、試驗目的

通過研究GST工程菌蛋白表達隨時間的變化關系，了解和把握誘導時間對菌體表達量的影響，確定GST工程菌的最正確誘導時間。二、試驗原理

誘導時間是指參與誘導劑后的培養(yǎng)時間。隨著誘導時間的延長，外源蛋白的表達量增加，但外源蛋白在細胞內的積累，對重組菌產(chǎn)生毒性，合成速率下降，甚至產(chǎn)物被分解。理論上足夠長時間里，菌體的表達隨時間呈“S〞曲線型。三、試驗試劑三、試驗試劑3.1菌種GST工程菌3.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（Amp+）3.3試劑

去離子水、0.2g/mLIPTG四、試驗儀器與器具

恒溫搖床，超凈工作臺，移液器，臺式高速離心機，Tip頭，EP管，玻璃試管，100mL的三角瓶，SDS電泳設備。五、試驗步驟與方法5.1種子液制備

取GST工程菌的甘油菌種1管，按1%的接種量分別接入1管2mLLB(Amp+)液體培養(yǎng)基中，然后傾斜地置于搖床中，37℃，170rpm搖床培養(yǎng)過夜。5.2接種培養(yǎng)

按1%的接種量，將過夜培養(yǎng)的GST工程菌種子液，接入到200mLLB(Amp+)中，置于搖床中37℃，170rpm振搖培養(yǎng)。5.3誘導表達并取樣進行表達進程分析

培養(yǎng)至4h時，參與50uL0.2g/mL的IPTG，搖勻后取出1mL菌液用于檢測。

32

基因工程（跨課程）綜合性試驗

之后繼續(xù)培養(yǎng)進行誘導表達。此后每1小時取出1mL用于檢測表達量。所取的樣品置于-20℃凍存。

5.4SDS檢測不同誘導時間的表達量

將-20℃凍存的菌體解凍后，取出100uL，10000rpm離心3min，棄掉上清，用40uL2×上樣緩沖液懸浮起來，按試驗一和附錄一進行SDS電泳。六、試驗本卷須知

在搖瓶試驗中，停機特別是長時間停機遇對發(fā)酵結果造成影響。在取樣操作中，一要避免染菌，二要快速操作。七、思考題

請區(qū)別表達量和蛋白總量的含義。

33

基因工程（跨課程）綜合性試驗

試驗七工程菌發(fā)酵工藝

一、試驗目的

了解和把握基因工程蛋白藥物發(fā)酵的一般工藝與發(fā)酵過程的參數(shù)控制。

二、試驗原理

發(fā)酵是利用微生物在有氧或無氧條件下的生命活動來制備其菌體或代謝產(chǎn)物的過程。其本質是一種生化反應，與溫度、pH、溶解氧、基質濃度等因素密切相關。對于應用基因工程技術改造的工程菌，在發(fā)酵表達時，還要考慮誘導條件如誘導起始菌濃度、誘導物濃度、誘導時間等對目的基因表達的影響。

本試驗所采用的工程菌為人IL-18的大腸桿菌表達株，所含表達載體為pBV220，宿主株為DH5а，表達產(chǎn)物hIL-18的大小約為18KD。表達載體pBV200含有編碼溫度敏感性阻遏蛋白的ci857基因，在28-37℃時產(chǎn)生的阻遏蛋白能阻止強啟動子PRPL的轉錄起始，細菌可以正常生長繁殖，當培養(yǎng)溫度升高至42℃時該阻遏蛋白發(fā)生構象變化而失活，外源基因開始轉錄而表達，所以可以通過調控溫度來誘導目的蛋白的表達。

上罐條件下，主要了解發(fā)酵的工藝和過程控制，只對生物量和目標蛋白表達進程進行分析。如采用搖瓶，則對培養(yǎng)基的起始pH值、基質濃度、誘導起始菌濃、誘導時間等影響目的蛋白的因素進行試驗。

三、試驗儀器

超凈臺、天平、離心機、溫控搖床、發(fā)酵罐及周邊設備、分光光度計、垂直電泳裝置。

四、試驗材料及試劑

hIL-18工程菌甘油種、蛋白胨、酵母抽提物、NaCl、氨芐青霉素（AP）EP管、培養(yǎng)皿、接種針、玻璃棒、滴頭吸管、50ml和500ml離心管、10mL帶蓋螺口試管、500mL搖瓶

34

基因工程（跨課程）綜合性試驗

五、試驗步驟1.菌種活化：

取低溫保存的工程菌甘油種，按1%（v/v）接種量接種含2mlLB+AP培養(yǎng)基的螺口試管（10ml），37℃培養(yǎng)12hr。2.種子液制備：（1）

取活化菌種1ml接種于含100mlLB+AP培養(yǎng)基的搖瓶（1%接種量），37℃培養(yǎng)過夜

（2）

按10%（v/v）接種量將菌種過夜培養(yǎng)物接種于含100mlLB+AP培養(yǎng)基的搖瓶，共接種5瓶（500ml），37℃培養(yǎng)至對數(shù)中期（約需2.5hr，OD600約為0.6），作為種子液。

3.發(fā)酵培養(yǎng)基配制與在位滅菌（提前一天）：

配制5LLB培養(yǎng)基，轉入10L發(fā)酵罐，按121℃，30min條件在位高壓蒸汽滅菌，待冷卻至室溫后方可接種。4.發(fā)酵參數(shù)設定：

采用溫控型大腸桿菌表達系統(tǒng)常規(guī)發(fā)酵參數(shù)進行發(fā)酵，發(fā)酵參數(shù)設定為：37℃培養(yǎng)3h，轉換溫度至42℃誘導表達5h，溶氧設定為30%以上，攪拌轉速為300rpm。5.接種：

按無菌操作將培養(yǎng)好的500mL種子液接入到發(fā)酵罐中。6.發(fā)酵進程分析：

每組8～9人，由帶教老師介紹發(fā)酵過程控制，同時完成不同時段的取樣。每組負責測定一個時間點的光密度值，同時制備8～9個平行樣品供發(fā)酵進程分析用（SDS），注意做好標記。第一次取樣為1.1，1.2～1.8或1.9(根據(jù)每組人數(shù))，其次次為2.1～2.8，其余類推。每次取樣約30ml,測光密度用2mL，1mL用于測定目標蛋白含量。（1）（2）

光密度測定方法：波長為600nm時測定細菌的吸光值。

SDS+凝膠掃描分析表達水平：參照附錄一和工程菌表達篩選中的方法。

35

基因工程（跨課程）綜合性試驗

LB培養(yǎng)基的制備：分別配制1%細菌培養(yǎng)用蛋白胨，0.5%酵母抽提物和1%氯化鈉，混勻后加蒸餾水定容至相應的體積并進行滅菌。說明：

1）由于安裝等問題，假使發(fā)酵設備不能到位，則參考去年發(fā)酵試驗方案進行搖瓶試驗（講義另行提供）。

2）利用試驗機動時間，進行發(fā)酵設備講解。

每組8～9人由代教老師介紹發(fā)酵裝置和附件（空壓機、蒸汽發(fā)生器），主要是管路連接、設備原理和主要操作。每組1h。假使其他試驗安排后，仍有較多等待時間，也可以擴大設備講解時的試驗分組到16～17人。

36

基因工程（跨課程）綜合性試驗

試驗八表達產(chǎn)物分開純化

一、試驗目的

熟悉大腸桿菌系統(tǒng)包涵體形式表達產(chǎn)物分開純化工藝流程及包涵體蛋白變性與復性的原理、條件與操作步驟。

二、表達產(chǎn)物分開純化工藝流程

建立高效和質量可控的目的產(chǎn)物分開純化工藝是基因工程制藥的最主要技術瓶頸之一。大腸桿菌系統(tǒng)表達產(chǎn)物分開純化的主要任務是高效獲取高比活性的表達產(chǎn)物，去除宿主蛋白質、核酸、內毒素等主要雜質類型。當外源基因胞內高效表達時，由于宿主細胞內的微環(huán)境不利于表達產(chǎn)物的折疊，表達產(chǎn)物正確折疊的速度跟不上產(chǎn)物形成的速度，而使得表達產(chǎn)物主要以不溶的、無序折疊的包涵體形式存在，因此，還必需建立高效的包涵體蛋白變性與復性工藝，且這一工藝過程又是分開純化工藝的主要技術屏障。

基于包涵體表達形式的表達產(chǎn)物分開純化工藝流程為：

工程菌菌體破菌包涵體制備與純化變性（裂解）復性（重折疊）2-3步柱層析分開純化純品（原液）

三、表達產(chǎn)物分開純化原理（一）包涵體蛋白的變性與復性1、包涵體制備與純化：

工業(yè)上可采用超聲波法或高壓勻漿法破碎大腸桿菌工程菌。由于包涵體是水不溶性顆粒，其密度（比重）高于所有細胞器，所以可采用差速離心法從工程菌細胞裂解物中制備包涵體。

包涵體是由表達產(chǎn)物、膜脂蛋白、DNA、RNA、脂類和多糖等眾多大分子物質組成的繁雜混合物，對水不溶的包涵體進行適當?shù)南礈炜扇コw表面的

37

基因工程（跨課程）綜合性試驗

各種雜質，對表達產(chǎn)物進行初步純化。一般常采用表面活性劑(如TritonX100)或/和低濃度尿素等去除難于處理的膜脂蛋白類雜質，以適當提高包涵體蛋白中目的產(chǎn)物的含量，便于進一步分開純化。2、包涵體蛋白的溶解（裂解、變性）

利用高濃度的變性劑如8M尿素或7MGuCl破壞包涵體蛋白質中的氫鍵，以還原性巰基試劑（如DTT、β-ME）破壞分子間和分子內的二硫鍵，使蛋白質的多肽鏈處于完全的自由伸展狀態(tài)。3、蛋白質復性

采用適當?shù)姆椒ㄈコ冃詣?，使表達產(chǎn)物由自由伸展狀態(tài)轉變?yōu)檎_折疊狀態(tài)，以恢復蛋白質自然構象和活性的過程稱為復性。在理論上，蛋白質的空間結構信息已包含于多肽鏈的一級結構中，因此，在體外只要給予適當條件，任何處于自由伸展狀態(tài)的多肽鏈都有形成正確折疊的可能。

蛋白質折疊的具體步驟可用下式描述：

U→I→N↓A

即伸展態(tài)U經(jīng)過早期變化成為中間體I，然后由中間體過渡到最終的自然態(tài)N。但是從中間體折疊為自然態(tài)的同時，另有一條旁路，即中間體相互聚集為凝聚物A(包含體)。在折疊反應中，從伸展態(tài)到中間體的形成是十分快速的，一般在毫秒范圍內完成，但從中間體轉變?yōu)樽匀粦B(tài)的過程比較緩慢，是反應的限速步驟。當溶液中離子強度或變性劑濃度很低，又無其它輔助手段存在時，聚集趨勢占主導地位，導致蛋白質的自發(fā)復性效率極低。因此，在蛋白質復性的時候，主要是促進中間體向自然態(tài)的轉變。一般認為，蛋白質在復性過程中，涉及兩種疏水相互作用，一是分子內的疏水相互作用，二是部分折疊的肽鏈分子間的疏水相互作用。前者促使蛋白質正確折疊，后者導致蛋白質聚集而無活性，兩者相互競爭，影響蛋白質復性收率。因此，在復性過程中，抑制肽鏈間的疏水相互作用以防止聚集，是提高復性收率的關鍵。在實際操作中，采用較低的蛋白濃度、緩慢降低變性劑濃度、以化學或物理方法減少分子間的碰撞機遇是減少分子間聚沉的常用方法，而稀釋復性和柱層析復性則是工業(yè)上最常用的復性工藝。

38

基因工程（跨課程）綜合性試驗

對于含二硫鍵的蛋白質而言，二硫鍵的形成在多肽鏈的重折疊（蛋白質復性）中起決定性作用，二硫鍵的形成速度和半胱氨酸殘基間配對的正確性決定了復性的速度和復性產(chǎn)物空間結構的正確性。包涵體蛋白變性后，所有半胱氨酸的巰基（-SH）處于還原狀態(tài)，在蛋白的復性過程中，組成二硫鍵的二個半胱氨酸殘基間的巰基氧化形成共價的二硫鍵。當自然的蛋白質或多肽存在多對二硫鍵時，變性蛋白折疊過程中二硫鍵的形成位點至關重要。在理論上二硫鍵的形成信息由蛋白質的一級結構信息決定，因此只要復性條件恰當，蛋白質復性過程中分子內或分子間能形成正確的二硫鍵。為了促進巰基的氧化和二硫鍵的形成，一般在復性體系中采用還原型谷胱甘肽（-SH）-氧化型谷胱甘肽（S-S）或半胱氨酸（-SH）-胱氨酸（S-S）組成的氧化還原體系。

（二）表達產(chǎn)物分開純化

目的產(chǎn)物的分開純化策略多種多樣，復性與分開純化可分開操作或結合在一起進行，可先復性再分開純化、先純化變性蛋白再復性或復性與純化同時進行。1、先復性再純化：

包涵體形式表達的產(chǎn)物經(jīng)復性后再采用各種色譜柱技術進行進一步的分開純化。由疏水層析、離子交換層析和分子篩層析是最常用的制備型色譜技術，一般采用2-3步柱層析即可獲得純度超過95%的表達產(chǎn)物，且在此過程可有效去除宿主核酸、內毒素和非正確折疊得異構體。假使采用的是融合表達方式，則利用Tag的抗體或受體設計親和層析也是試驗室常用純化方法，但此類方法由于存在成本高，親和介質壽命短和配基污染等問題，不太適用于工業(yè)化生產(chǎn)。2、先純化變性蛋白再復性

即在高濃度變性劑存在條件下，先通過各種色譜柱層析技術獲得純的、變性蛋白，然后以純的變性蛋白進行稀釋復性，再以柱層析去除非正確折疊的產(chǎn)物。3、復性與純化同時進行

以各種柱層析方法復性，并在復性過程中進行純化。

四、試驗材料及試劑

1、試劑：發(fā)酵菌體、Tris、HCl、EDTA、尿素、TritonX-100、二硫蘇糖醇

39

基因工程（跨課程）綜合性試驗

（DTT）、谷胱甘肽(還原型)、谷胱甘肽(氧化型)

2、菌體裂解液：20mMTris-HClpH8.0、1mMEDTA

3、包涵體洗滌緩沖液I：20mMTris-HClpH8.0、1mMEDTA、2M尿素4、包涵體洗滌緩沖液II：20mMTris-HClpH8.0、1mMEDTA、1%Triton

X-100

5、包涵體洗滌緩沖液III：20mMTris-HClpH8.0、1mMEDTA、20mMNaCl6、包涵體裂解緩沖液：20mMTris-HClpH8.0、8M尿素7、包涵體復性緩沖液：20mMTris-HClpH8.0+谷胱甘肽系統(tǒng)

五、試驗儀器與用具

冷凍離心機、天平、磁力攪拌器、超聲波儀、50ml燒杯、玻璃棒、滴頭吸管、50ml離心管、EP管

六、試驗步驟

1、發(fā)酵菌液，4℃，5000rpm，離心5min（同時取100ul菌液4℃保存，作為1號樣品）。

2、棄上清，收集菌體沉淀，稱菌體濕重，以菌體裂解液按30%（W/V）的稀釋度懸浮菌體。

3、在冰浴條件下，將超聲探頭沒入懸浮液內進行超聲波破碎。超聲破碎條件視超聲儀功率而定，當采用300W功率超聲儀時，每次處理的菌體懸浮液以30ml為宜，一般總超聲15min，超聲3秒停2秒。

4、4℃，10000rpm，離心10min，棄去上清（用無菌牙簽挑取大約牙簽粗頭大小的沉淀，編號，溶于40ul1×SDS上樣緩沖液中備用）。

5、沉淀按5%（W/V）的稀釋度懸浮于包涵體洗滌緩沖液I，充分混勻。4℃，10000rpm，離心10min，棄去上清。

6、沉淀按5%（W/V）的稀釋度懸浮于包涵體洗滌緩沖液II，充分混勻。4℃，10000rpm，離心10min，棄去上清。

7、沉淀按5%（W/V）的稀釋度懸浮于包涵體洗滌緩沖液III，充分混勻。4℃，10000rpm，離心10min，棄去上清。重復洗滌3次。最終所得的沉淀即為包涵體

40

基因工程（跨課程）綜合性試驗

樣品，稱重，用無菌牙簽挑取約牙簽粗頭大小，編號，溶于40ul1×SDS上樣緩沖液中備用。

8、將包涵體按5%（W/V）的稀釋度重新懸浮于包涵體洗滌緩沖液III，充分混勻，按1ml/管的裝量將包涵體懸浮液分派至1.5mlEP管，-20凍存。

9、每個小組取包涵體樣品1支，室溫解凍，4℃，10000rpm，離心10min，棄上清，參與1ml包涵體裂解緩沖液，充分混勻，37℃保溫3小時。4℃，10000rpm，離心10min（上清留樣20ul，編號，加20ul2×SDS上樣緩沖液；沉淀用無菌牙簽挑取牙簽粗頭大小，編號，溶于40ul1×SDS上樣緩沖液中備用）。10、上清移至10ml試管，用緩慢滴加包涵體復性緩沖液至尿素終濃度為2M（稀釋4倍），4℃過夜。

11、取100ul復性液于EP管，4℃，12000rpm，離心10min，上清取樣20ul，編號，加20ul2×SDS上樣緩沖液；沉淀加40ul1×SDS上樣緩沖液，編號。12、將上述1－7號樣品進行SDS分析（方法參照附件一）。

七、本卷須知

1、使用超聲波時應控制強度在一定的限度，即剛好低于溶液產(chǎn)生泡沫的水平。產(chǎn)生泡沫會導致蛋白質變性。

2、在復性蛋白時，要注意一定要緩慢參與包涵體復性緩沖液，以防止變化太快造成蛋白質聚集析出。

八、思考題

1、如何分開包涵體？2、蛋白質復性的方法有哪些？

41

基因工程（跨課程）綜合性試驗

附錄一、SDS－PAGE電泳

一、試驗試劑

1、2×SDS上樣緩沖液：0.1mol/LTris（pH6.8）、4％SDS、20％甘油、0.2％溴酚籃、200mmol/LDTT（或4％β－巰基乙醇），4℃保存。2、10％APS，TEMED和DTT存放在4℃冰箱。

3、10×電泳緩沖液：Tris6g、glycine28.8g、SDS10g，pH調至8.3，定容至1L。4、30％膠母液（Acr－Bis）：30％acrylamide、0.8％bis（即acrylamide30g、bis0.8g定容至100ml），可在4℃存放數(shù)月。5、分開膠緩沖液（pH8.8）：1.5MTrsi－HCl。6、濃縮膠緩沖液（pH6.8）：1.0MTrsi－HCl。7、10％SDS

8、考馬斯亮籃染色液：1.25g考馬斯亮籃R250、450ml甲醇：水（1：1）、50ml冰醋酸

9、脫色液：450ml甲醇：水（1：1）、50ml冰醋酸

二、試驗方法

1、配制適量的12％的分開膠，以10ml為例：

H2O3.3ml、30％膠母液4.0ml、分開膠緩沖液（pH8.8）2.5ml、10％SDS0.1ml、10％APS0.1ml、TEMED0.004ml。

2、將配制好的分開膠參與制膠槽中，注意應沿著邊緣緩慢參與，千萬別進氣泡。凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5cm或距梳子齒約0.5cm處。

3、輕輕在分開膠溶液上覆蓋一層雙蒸水（或異丙醇）封膠，使凝膠表面變的平整，靜止30min－1h，使凝膠聚合。凝膠聚合后，在分開膠和水層之間將會出現(xiàn)一個明了的界面，可以微微傾斜模具，檢測凝膠是否聚合。4、除去上面的水層，再用濾紙吸盡殘留的液體。5、配制5％的濃縮膠，以5ml為例：

H2O3.4ml、30％膠母液0.83ml、濃縮膠緩沖液（pH6.8）0.63ml、10％SDS0.05ml、10％APS0.05ml、TEMED0.005ml。

42

基因工程（跨課程）綜合性試驗

6、迅速將配好的濃縮膠添加到分開膠上面，并將梳子插入凝膠內，至梳子齒的底部與前玻璃板的頂端平齊，防備避免混入氣泡。將凝膠垂直放置于室溫下，約30min凝膠聚合。

7、將膠板放入電泳槽中，在上下電泳槽中添加1×電泳緩沖液，使凝膠的上下端均能浸泡在緩沖液中。輕輕拔出梳子，注意不要將加樣孔撕破。

8、在電泳槽的泳道中分別添加蛋白Marker和樣品20ul。加樣時用微量移液器將樣品參與樣品孔的底部，避免帶入氣泡。

9、接通電源，上槽（加樣孔端）接負極，下操接正極，恒流，起始電流20mA，待溴酚籃前沿進入分開膠，電流增加至30mA。

10、電泳大致需要1－3h（取決于凝膠孔徑，特別是緩沖系統(tǒng)和電參數(shù)的選擇）。待溴酚籃前沿到達電泳槽底部時，切斷電源，從電極上拔掉電極插頭，取出玻璃板。

11、帶上手套，防備移去兩玻璃之間的隔片，利用專用的鏟子輕輕撬開玻璃板，防備從制膠板上將凝膠剝下，棄去濃縮膠。在右下角切去小片作為定位標記。12、用清水洗膠，將分開膠放入染色液中緩慢搖動，染色20－30min，防備不要將膠撕破。由于SDS和蛋白質分子競爭染料而干擾考馬斯亮籃染色，所以SDS凝膠的染色時間應比常規(guī)聚丙烯酰胺的時間要長，或用多倍體積的染色液，以排除SDS的影響。

13、從染色液中將凝膠取出用水漂洗后，將膠放入脫色液中進行擴散脫色，直到背景藍色褪淡，見到條帶，根據(jù)具體狀況，大約換2－4次脫色液即可。

43

基因工程（跨課程）綜合性試驗

六重組DNA藥物

基因治療是外源正?；驅氚屑毎愿恼蜓a償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達到治療目的。隨著DNA重組技術和轉基因方法的不斷完善，基因治療研究發(fā)展迅猛，在某些疾病的治療中取得了令人鼓舞的療效。而用于基因治療的DNA，分子量較大、帶大量負電荷，這就使DNA的體內傳遞存在困難：分子尺寸較大，很難通過被動擴散進入細胞；所帶的負電荷與細胞表面的負電荷相排斥，而易與帶正電荷的血漿蛋白結合；另外DNA起作用的部位是細胞核，生物體內的核酶能夠將細胞核外的游離DNA降解。說明DNA的傳遞需要載體的協(xié)助，不但要求能夠突破進入細胞的重重障礙，還要求能夠進入細胞核。因此，人們愈來愈認識到選擇適合的載體，使目的基因安全、靶向、可控并有效表達，是基因治療成功的關鍵。目前臨床試驗中所用的載體一般有兩類：病毒載體和非病毒載體。雖然目前使用最多的依舊是病毒型載體，占所用載體總量的75%左右，其轉染效率可達90%以上，但病毒載體存在潛在的安全性問題，如能誘導宿主免疫反應及潛在的致癌性，同時它制備繁雜，所能裝載的外源DNA大小有限，使其應用受到很大限制。特別是1999年出現(xiàn)首例使用腺病毒載體進行基因治療導致病人死亡事件發(fā)生后，關于病毒載體的安全性問題更是成為研究者關心的重點，于是，人們更加關注非病毒型載體的研究。非病毒載體具有低毒安全的特點且適合特別治療目的，它們能夠攜帶大量DNA分子，簡單大批量生產(chǎn)，費用低廉，對于非病毒基因載體的研究目前主要有：袒露的DNA；陽離子脂質體；陽離子聚合物等。

本綜合試驗以質粒pCDNA3.1-TCRVβ7.1為例，介紹質粒DNA大規(guī)模制備、陽離子脂質體與質粒DNA復合物制備、T細胞體外轉染、轉染T細胞目的基因表達和體外活性檢測、體內給藥試驗等。

背景知識

1、重組DNA技術

重組DNA技術屬于遺傳工程分子水平的遺傳操作，是一種依照人的意志定

44

基因工程（跨課程）綜合性試驗

向改變生物遺傳性狀的技術。是在體外重新組合DNA分子(脫氧核糖核酸)，并使其在適當?shù)募毎性鲋车倪z傳操作，這種操作可將特定的基因組合到載體上，并使其在受體細胞中增殖和表達。重組DNA技術基本過程：

a、用人工方法取得或合成目的基因

基因是含特定遺傳信息的核苷酸序列，是遺傳物質的最小功能單位，基因可被分開出來?；虻暮铣芍饕谢瘜W合成和酶促合成兩種方法。

b、運載體的選擇

運載體的作用是將分開或合成的基因導入細胞或能轉移染色體上的DNA片段，所以它必需能自由出入細胞，常用的運載體有SV40病毒，溫柔噬菌體和質粒等，但最常用的是質粒。質粒是染色體以外能夠自主復制的遺傳單元，是由雙鏈DNA分子組成，呈環(huán)狀結構。它可以游離于細胞漿中，也可與染色體整合在一起，它沒有蛋白質外套，是袒露的DNA分子，它比染色體小，只帶數(shù)個或數(shù)10個基因，最大的也只有大約100個基因，它上面有一個位點稱為原點，可以攜帶染色體轉移。

c、質粒的分開與重組DNA

用溶菌酶裂解菌細胞分開出質粒。用內切酶處理質粒，使它的DNA在一定位置上斷裂，并在斷裂口出現(xiàn)粘性末端。用同樣的內切酶處理分開出的目的基因的DNA，使之具有一致的粘性末端與質粒粘性末端相連接，形成重組DNA穩(wěn)定結構。將重組DNA導入不含質粒的細菌，即受體細菌中，例如大腸桿菌(F)中，目的基因能隨質粒復制而復制，并隨細菌的分裂而擴增，形成這一基因的無性繁殖系一重組DNA克隆化。

2、陽離子脂質體

陽離子脂質體作為基因治療的載體是目前研究的熱點之一，其轉染率比pH敏感脂質體高3～150倍。選用材料多為二油酰基磷脂酰乙醇胺(DEOP)，陽離子表面活性劑有溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)，溴化雙十二烷基二甲基銨(DDAB12)，溴化雙十八烷基二甲基銨(DDAB18)，氯化N-(1-(2,3-雙油酸基)丙基-N,N,N三甲基銨等。所有的陽離子脂質體都帶有一個疏水基團，該基團一般是一至兩個脂肪酸或是長約12-18個碳原子的烷基單元或是一個膽固醇單元。疏

45

基因工程（跨課程）綜合性試驗

水基團能夠保證陽離子脂質體分散在水介質中時形成脂雙層結構，從而有效的保護分子中的疏水部分，并將氨基端的基團暴露于水介質中。氨基對于轉染能力是絕對必要的，由于它能夠通過靜電引力與DNA結合并將DNA大分子壓縮成可運輸?shù)男卧?，即形成脂質體復合物。使DNA分子處于緊縮狀態(tài)，陽離子脂質體起了中間橋梁的作用，使生物膜表面對DNA質粒復合物的排斥力降低，有利于DNA分子透過生物膜，提高目的基因的感染率。有好多物理因素如：粒子大小、Zeta電位、DNA/脂質體比例和介質離子強度等都影響脂質復合物的穩(wěn)定性，復合物的形成和轉染效率。

3、質粒pCDNA3.1-TCRVβ7.13.1質粒pCDNA3.1

質粒pCDNA3.1為真核表達載體，具有表達克隆化cDNA所需的啟動子、加強子、加poly(A)信號等調控元件，及SV40病毒復制子、G418篩選標記基因等序列，是一個高效真核表達載體，為了便于基因操作，多克隆位點有正反兩套酶切位點，本實驗采用的是pCDNA3.1(一)載體。質粒pCDNA3.1載體的圖譜如下：

3.2T細胞表面受體(TCR)

腫瘤特異性細胞毒性T細胞(CTL)為腫瘤免疫治療提供了基礎。腫瘤抗原依靠性的T細胞免疫應答通過T細胞表面的抗原受體(TCRs)與抗原提呈細胞

46

基因工程（跨課程）綜合性試驗

(APCs)表面的抗原肽-MHC復合物相互作用而啟動。

T細胞對抗原肽-MHC復合物識別是由TCR的立體結構完成的。TCR是存在于T細胞表面的多肽鏈復合物，分為恒定區(qū)(C)和可變區(qū)(V)。人類外周血95%T細胞表達α/βTCR，3%～5%T細胞表達γ/δTCR。近年來發(fā)現(xiàn)TCR中存在ευδ鏈。α/β的V區(qū)與抗原識別有關，γδ