核酸的學(xué)習(xí)資料第1頁/共211頁第12章核酸通論第13章核酸的結(jié)構(gòu)第14章核酸的物理化學(xué)性質(zhì)第15章核酸的研究方法第2頁/共211頁1核苷酸2核酸的共價結(jié)構(gòu)3DNA的高級結(jié)構(gòu)4RNA的高級結(jié)構(gòu)第3頁/共211頁主要元素組成：C、H、O、N、P(9~11%)與蛋白質(zhì)比較，核酸一般不含S，而P的含量較為穩(wěn)定，占9-11%。1核苷酸1.1核酸的元素組成第4頁/共211頁1.2核酸的基本構(gòu)成單位：核苷酸(nucleotide)核苷酸由戊糖、磷酸和含氮堿三部分構(gòu)成核酸與蛋白質(zhì)一樣，是一種高分子聚合物。它是由結(jié)構(gòu)較簡單的小分子有機化合物－核苷酸組成。核苷酸是核酸的基本結(jié)構(gòu)單位。第5頁/共211頁1.2.1戊糖組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為β-D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為β-D-核糖。核酸中的戊糖都是β-D-型第6頁/共211頁嘌呤(purine)腺嘌呤(adenine,A)鳥嘌呤(guanine,G)1.2.2堿基第7頁/共211頁嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)NN132456第8頁/共211頁酮式烯醇式互變異構(gòu)大部分以酮式存在第9頁/共211頁

核酸中也存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。第10頁/共211頁第11頁/共211頁1.2.3核苷(ribonucleoside)核苷=戊糖+堿基糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵堿基和核糖通過糖苷鍵連接形成核糖核苷。堿基和脫氧核糖通過糖苷鍵連接形成脫氧核苷。第12頁/共211頁核苷中戊糖與堿基的連接方式：嘌呤嘧啶核糖脫氧核糖嘧啶堿：C1’-N1嘌呤堿：C1’-N9，

第13頁/共211頁核糖核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脫氧核糖核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP1.2.4核苷酸(ribonucleotide)的結(jié)構(gòu)與命名核苷（脫氧核苷）和磷酸以磷酸酯鍵連接形成核苷酸（脫氧核苷酸）。

核苷酸=核苷+磷酸

=戊糖+堿基+磷酸第14頁/共211頁BaseBase2’-核糖核苷酸3’-核糖核苷酸5’-核糖核苷酸3’-脫氧核糖核苷酸5’-脫氧核糖核苷酸核糖核苷脫氧核糖核苷酸酸第15頁/共211頁游離核苷酸多為5’-核苷酸第16頁/共211頁AMPADPATP5′-NMP5′-NDP

5′-NTPN=A、G、C、U5′-dNMP5′-dNDP5′-dNTPN=A、G、C、T1.2.5核苷酸衍生物第17頁/共211頁(1)ATP(腺嘌呤核糖核苷三磷酸)含有兩個高能磷酸鍵。ATP水解可以釋放出大量自由能。解釋的能量用于推動生物體內(nèi)各種需能的生化反應(yīng)。能量轉(zhuǎn)換中間體ATP也是一種很好的磷?；瘎Ａ柞；牡孜锓肿泳哂休^高的能量（活化分子），是許多生物化學(xué)反應(yīng)的激活步驟。adenosine第18頁/共211頁(2)GTP(鳥嘌呤核糖核苷三磷酸)也是一種高能化合物。GTP主要是作為蛋白質(zhì)合成中磷?；w。在許多情況下,ATP和GTP可以相互轉(zhuǎn)換。第19頁/共211頁(3)cAMP和cGMPcAMP(3’,5’-環(huán)腺苷酸)和cGMP(3’,5’-環(huán)鳥苷酸)的主要功能是作為細(xì)胞之間傳遞信息的信使。第20頁/共211頁(4)輔酶維生素PP-尼克酰胺輔酶（輔酶I）維生素B2-黃素輔酶第21頁/共211頁2核酸的共價結(jié)構(gòu)2.1核酸中核苷酸的連接方式2.2DNA的一級結(jié)構(gòu)2.3DNA與基因組第22頁/共211頁5′端3′端2.1.1核酸中核苷酸的連接方式核苷酸之間以磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸鏈，即核酸。CGA第23頁/共211頁5’5’3’3’第24頁/共211頁55333-5磷酸二酯鍵第25頁/共211頁2.1.2多聚核苷酸的特點在多聚核苷酸的連接方式通常稱為3-5磷酸二酯鍵多聚核苷酸鏈一端的C5′帶有一個自由磷酸基，稱為5′-磷酸端（常用5’-P表示）；另一端C3’帶有自由的羥基，稱為3′-羥基端（常用3’-OH表示）。多聚核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個多聚核苷酸鏈時，必須注明它的方向是5′→3′(由左至右)或是3′→5′。第26頁/共211頁由核糖核苷酸聚合而成的稱為RNA；由脫氧核糖核苷酸聚合而成的稱為DNA。第27頁/共211頁

5′3′OHOHOH5′3′RNADNA第28頁/共211頁Howpolynucleotidesareactuallyformed3′-OH5′-dNTP第29頁/共211頁在多聚核苷酸（DNA或RNA）鏈中，由于構(gòu)成核苷酸單元的戊糖和磷酸基是相同的，體現(xiàn)核苷酸差別的實際上只是它所帶的堿基，所以多聚核苷酸鏈結(jié)構(gòu)也可表示為：T5’3’

2.1.3核酸的表示方式3’3’3’5’5’5’

豎線代表戊糖碳鏈，P代表磷酸集團，與P相連的斜線帶代表3-5磷酸二酯鍵第30頁/共211頁AGP5PTPGPCPTPOH35pApCpTpGpCpT-OH

35

ACTGCT

3P為磷酸基團第31頁/共211頁5′3′結(jié)構(gòu)式5′3′

p

p

p

pOH3′ACTG1′線條式5′

ACTGCATAGCTCGA3′字母式第32頁/共211頁DNA分子中各脫氧核苷酸之間的連接方式（3′-5′磷酸二酯鍵）和排列順序叫做DNA的一級結(jié)構(gòu)，簡稱為堿基序列.5′3′第33頁/共211頁DNA是dAMP、dGMP、dCMP、dTMP連接起來的線形或環(huán)形多聚體。連接鍵：3’-5’磷酸二酯鍵磷酸與戊糖順序相連形成主鏈骨架堿基形成側(cè)鏈走向規(guī)定為5’-3’DNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲的分子形式。生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。第34頁/共211頁基因（gene）：生物細(xì)胞中DNA分子的最小功能單位。

蛋白質(zhì)（mRNA蛋白質(zhì)）產(chǎn)物tRNARNArRNA

調(diào)節(jié)功能：調(diào)節(jié)基因無產(chǎn)物作用未知結(jié)構(gòu)基因2.3.1DNA與基因2.3DNA與基因組第35頁/共211頁DNA的基本功能是以基因的形式荷載遺傳信息，并作為基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板。它是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個體生命活動的信息基礎(chǔ)。基因組（genome）：某生物體所含全部基因。第36頁/共211頁Genomesize

第37頁/共211頁2.3.2原核生物基因組的特點（1）DNA大部分為結(jié)構(gòu)基因，每個基因出現(xiàn)頻率低。（2）有基因重疊現(xiàn)象。ADFEB第38頁/共211頁Expressionofabacterialoperon.

Inthisexample,anmRNAencodesmorethanonepeptide.

SuchmRNAiscalledpolycistronic.

SomebacterialmRNAsarepolycistronic,butnearlyalleukaryoticmRNAsaremonocistronic(encodesasinglepeptide).

（3）功能相關(guān)基因串聯(lián)在一起，并轉(zhuǎn)錄在同一mRNA中（多順反子）。第39頁/共211頁（1）重復(fù)序列單拷貝序列：在整個DNA中只出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次，主要為編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。中度重復(fù)序列：在DNA中可重復(fù)幾十次到幾千次。高度重復(fù)序列：可重復(fù)幾百萬次高度重復(fù)序列一般富含A-T或G-C，富含A-T的在密度梯度離心時在離心管中形成的區(qū)帶比主體DNA更靠近管口；富含G-C的更靠近管底，稱為衛(wèi)星DNA（satelliteDNA）富含A-T富含G-C主體DNA2.3.3真核生物基因組的特點第40頁/共211頁（2）有斷裂基因由于基因中內(nèi)含子的存在內(nèi)含子（intron)：基因中不為多肽編碼，不在mRNA中出現(xiàn)。外顯子（exons）：為多肽編碼的基因片段。例外：組蛋白基因(histongene)和干擾素基因(interferongene)沒有內(nèi)含子。第41頁/共211頁第42頁/共211頁3DNA的高級結(jié)構(gòu)3.1DNA的二級結(jié)構(gòu)3.2DNA的三級結(jié)構(gòu)3.3DNA與蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)第43頁/共211頁1)DNA堿基組成分析20世紀(jì)40年代chargaff規(guī)則①DNA堿基組成有種的特異性，但沒有組織、器官特異性。②A=T；G=C；A+C=T+G;A+G=T+C;3.1.1提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的根據(jù)3.1DNA的二級結(jié)構(gòu)-NH2-C=O嘌呤嘧啶堿基的理化數(shù)據(jù)分析,計算出A-T、G-C以氫鍵配對較合理。Pauling和Corey發(fā)現(xiàn)A與T生成2個氫鍵、C與G生成3個氫鍵。第44頁/共211頁2)DNA的Na鹽纖維和DNA晶體的X光衍射分析（Franklin）第45頁/共211頁3)已知核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)：磷酸、戊糖、含氮堿基第46頁/共211頁3.1.2

DNA的二級結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)1953年，Watson和Crick根據(jù)Chargaff規(guī)律和DNANa鹽纖維的X光衍射分析提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。第47頁/共211頁第48頁/共211頁3.1.3DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的特點DNA分子由兩條DNA單鏈組成。DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)是分子中兩條DNA單鏈之間基團相互識別和作用的結(jié)果。雙螺旋結(jié)構(gòu)是DNA二級結(jié)構(gòu)的最基本形式。第49頁/共211頁DNA的雙螺旋模型特點（1）兩條反向平行的多聚核苷酸鏈沿一個假設(shè)的中心軸右旋相互盤繞而形成。螺旋表面有大溝和小溝。第50頁/共211頁

大溝和小溝分別指雙螺旋表面凹下去的較大溝槽和較小溝槽。小溝位于雙螺旋的互補鏈之間,而大溝位于相毗鄰的雙股之間。大溝小溝第51頁/共211頁（2）磷酸和脫氧核糖單位作為不變的骨架組成位于外側(cè)，糖環(huán)平面與縱軸平行；作為可變成分的堿基位于內(nèi)側(cè)，堿基平面與縱軸垂直。鏈間堿基按A—T，G—C配對（堿基配對原則，Chargaff定律）DNA的雙螺旋模型特點第52頁/共211頁（3）螺旋橫截面的直徑約為2nm，每條鏈相鄰兩個堿基平面之間的距離為0.34nm，螺旋結(jié)構(gòu)每隔10個堿基對（basepair,bp）形成一個螺旋，其螺矩（即螺旋旋轉(zhuǎn)一圈的高度）為3.4nm。DNA的雙螺旋模型特點2.0nm小溝大溝第53頁/共211頁（4）維持兩條DNA鏈相互結(jié)合（橫向）的力是鏈間堿基對形成的氫鍵。A和T之間形成兩個氫鍵，G與C之間形成三個氫鍵。堿基堆積力維持雙鏈螺圈之間（縱向）穩(wěn)定性。DNA的雙螺旋模型特點第54頁/共211頁TAGC第55頁/共211頁DNA的雙螺旋模型特點（5）堿基在一條鏈上的排列順序不受限制，而在另一條鏈上要遵循堿基配對原則，為第一條鏈的互補鏈。表明遺傳信息有堿基序列攜帶。第56頁/共211頁3.1.4DNA雙螺旋的種類WatsonCrickDNA雙螺旋結(jié)構(gòu)（B型DNA）

當(dāng)DNA鈉鹽纖維相對濕度和鹽的種類改變時，DNA的構(gòu)象發(fā)生改變。不同DNA纖維的空間結(jié)構(gòu)類型結(jié)晶狀態(tài)ANa鹽，相對濕度75%時結(jié)晶BNa鹽，相對濕度92%時結(jié)晶C鋰鹽，相對濕度66%時結(jié)晶第57頁/共211頁B-DNA：92%相對濕度，接近細(xì)胞內(nèi)的DNA構(gòu)象，與Watson和Crick提出的模型相似。A-DNA：75%相對濕度，與溶液中DNA-RNA雜交分子的構(gòu)象相似，推測轉(zhuǎn)錄時發(fā)生B→A。其堿基平面傾斜20°，螺距與每一轉(zhuǎn)堿基對數(shù)目都有變化。Z-DNA：主鏈呈鋸齒型左向盤繞，直徑約1.8nm，螺距4.5nm，每一轉(zhuǎn)含12個bp，只有小溝。B-DNA與Z-DNA的相互轉(zhuǎn)換可能和基因的調(diào)控有關(guān)。Z-DNA為左手螺旋。C-DNA：44~46%相對濕度，螺距3.09nm，每轉(zhuǎn)螺旋9.33個堿基對，堿基對傾斜6°。可能是特定條件下B-DNA和A-DNA的轉(zhuǎn)化中間物。D-DNA：60%相對濕度，DNA中A、T序列交替的區(qū)域。每個螺旋含8個bp，螺距2.43nm，堿基平面傾斜16°。第58頁/共211頁第59頁/共211頁第60頁/共211頁第61頁/共211頁第62頁/共211頁

ComparisonbetweenBformandZform第63頁/共211頁第64頁/共211頁雙螺旋DNA的結(jié)構(gòu)參數(shù)類型旋轉(zhuǎn)方向螺旋直徑（nm）螺距（nm）每轉(zhuǎn)堿基對數(shù)目堿基對間垂直距離nm堿基對與水平面傾角A－DNAB－DNAZ－DNA右右左2.32.01.82.83.44.51110120.2550.340.3720o0o7oDNA變構(gòu)效應(yīng)可能與基因表達調(diào)控有關(guān)第65頁/共211頁DNA分子內(nèi)的三鏈結(jié)構(gòu)多聚嘌呤多聚嘧啶DNA三鏈間的堿基配對（Hoogsteen配對）T-A-TC-G-CDNA三股螺旋-----第66頁/共211頁★DNA三股螺旋結(jié)構(gòu)常出現(xiàn)在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組的起始位點或調(diào)節(jié)位點，如啟動子區(qū)。第三股鏈的存在可能使一些調(diào)控蛋白或RNA聚合酶等難以與該區(qū)段結(jié)合，從而阻遏有關(guān)遺傳信息的表達。第67頁/共211頁①堿基堆積力（basestackingforce），由芳香族堿基π電子間的相互作用引起的，能形成疏水核心，是穩(wěn)定DNA最重要的因素；②堿基配對的氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。③磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽離子（如Na+、K+和Mg2+）或組蛋白的正離子之間形成離子鍵，中和了磷酸基上的負(fù)電荷間的斥力，有助于DNA穩(wěn)定。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)在生理條件下是很穩(wěn)定的。改變介質(zhì)條件和環(huán)境溫度，將影響雙螺旋的穩(wěn)定性。3.1.5DNA雙螺旋的穩(wěn)定性第68頁/共211頁3.1.6DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的意義該模型揭示了DNA作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征，最有價值的是確認(rèn)了堿基配對原則，這是DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)，亦是遺傳信息傳遞和表達的分子基礎(chǔ)。該模型的提出是20世紀(jì)生命科學(xué)的重大突破之一，它奠定了生物化學(xué)和分子生物學(xué)乃至整個生命科學(xué)飛速發(fā)展的基石。第69頁/共211頁超螺旋螺旋三級結(jié)構(gòu)是指DNA在雙螺旋的基礎(chǔ)上通過扭曲和折疊形成的特定構(gòu)象。超螺旋是DNA三級結(jié)構(gòu)的主要形式。3.2DNA的三級結(jié)構(gòu)1965年Vinograd等用電鏡發(fā)現(xiàn)SV40和多瘤病毒的環(huán)形DNA的超螺旋。第70頁/共211頁RelaxedandsupercoiledDNAmolecules共價閉合環(huán)狀DNA開環(huán)DNA線型DNA第71頁/共211頁L=25,T=25,W=0松弛環(huán)形1152010523L=23,T=23,W=0解鏈環(huán)形15101520231510152025L=23,T=25,W=–2負(fù)超螺旋121482316131510152023右手旋轉(zhuǎn)擰松兩匝后的線形DNADNA超螺旋的形成第72頁/共211頁

超螺旋的方向Thesupercoilsintroducedbyunderwindingarecalled“negitive”,whilethesupercoilsintroducedbyoverwindingarecalled“positive”.天然環(huán)狀DNA一般都以負(fù)超螺旋構(gòu)象存在超螺旋：解除外力捻轉(zhuǎn)造成的脅變正超螺旋：在外力往緊纏的方向捻轉(zhuǎn)時產(chǎn)生。

負(fù)超螺旋：在外力向松纏的方向捻轉(zhuǎn)時產(chǎn)生。第73頁/共211頁

使DNA形成高度致密狀態(tài)從而得以裝入核中；推動DNA結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化以滿足功能上的需要。如負(fù)超螺旋分子所受張力會引起互補鏈分開導(dǎo)致局部變性，利于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。第74頁/共211頁3.3DNA與蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物體內(nèi)的核酸通常都與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，以核蛋白（nucleoprotein）的形式存在。DNA分子十分巨大，與蛋白質(zhì)結(jié)合后被組裝到有限的空間中。DNA長度（μm）細(xì)胞直徑（μm）病毒

1.7~65<0.1細(xì)菌260~13500.5-5.0細(xì)菌4600~99000010-100第75頁/共211頁3.3.1病毒噬菌體T2結(jié)構(gòu)頭部頸圈尾部基板尾絲尖釘?shù)?6頁/共211頁動物病毒切面模式圖被膜（脂蛋白、碳水化合物）衣殼（蛋白質(zhì)）核酸突起（糖蛋白）病毒粒第77頁/共211頁DNA-蛋白質(zhì)核心突環(huán)由雙鏈DNA結(jié)合堿性蛋白質(zhì)組成平均一個突環(huán)含有約40kpDNA3.3.2細(xì)菌的擬核細(xì)菌擬核（nucleoid）的突環(huán)結(jié)構(gòu)第78頁/共211頁3.3.3DNA在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組裝核小體(nucleosome)：由DNA和組蛋白構(gòu)成。DNA：以負(fù)超螺旋纏繞在組蛋白上組蛋白核心：H2B,H2A,H3,H4H1組蛋白在核小體之間第79頁/共211頁第80頁/共211頁第81頁/共211頁真核生物染色體DNA組裝不同層次的結(jié)構(gòu)DNA

（2nm）核小體鏈（11nm，每個核小體200bp）纖絲（30nm，每圈6個核小體）突環(huán)（150nm，每個突環(huán)大約75000bp）玫瑰花結(jié)（300nm，6個突環(huán)）螺旋圈（700nm，每圈30個玫瑰花）染色體（1400nm，每個染色體含10個螺旋圈第82頁/共211頁HumanKaryotype

usingfluorescentstaining第83頁/共211頁4RNA的高級結(jié)構(gòu)4.1RNA的一般結(jié)構(gòu)特征和類型4.2tRNA4.3rRNA4.4mRNA和hnRNA4.5snRNA和siRNA4.6RNA的其它功能第84頁/共211頁RNA分子中核苷酸之間的連接方式AMP、GMP、CMP、UMP通過3’-5’磷酸二酯鍵形成的線形多聚體。4.1RNA的一般結(jié)構(gòu)特征和類型第85頁/共211頁4.1.1RNA的一般結(jié)構(gòu)特征1)組成RNA的核苷酸中的糖單位是核糖2)RNA的堿基中沒有胸腺嘧啶，而有U尿嘧啶。3)除了在某些病毒中RNA以雙鏈存在以外，RNA分子都是單鏈。因此，RNA分子中沒有DNA分子中存在的堿基互補配對規(guī)律，嘌呤的總數(shù)不一定等于嘧啶的總數(shù)。4)在RNA分子中存在由同一條鏈折疊而成的發(fā)夾狀雙鏈區(qū)。在這些區(qū)域中，A與U配對，C與G配對。但是這種配對常常是不完善的，有些部分不能形成配對，就向外呈環(huán)狀突起(loop)。第86頁/共211頁第87頁/共211頁1)轉(zhuǎn)移RNA（transforRNA，tRNA）：在蛋白質(zhì)合成時起著攜帶活化氨基酸的作用。2)核糖體RNA（ribosoalRNA，rRNA）：與蛋白質(zhì)結(jié)合構(gòu)成核糖體（ribosome）,核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所；3)信使RNA（messengerRNA，mRNA）：在蛋白質(zhì)合成中起模板作用；第88頁/共211頁4)其它類別的RNA（1）病毒RNA（ViralRNA,rRNA）（2）核內(nèi)RNA（nuclearRNA,nRNA）①不均一核RNA（heterogeneousnuclearRNA,hnRNA）②小分子核RNA（smallnuclearRNA,snRNA）③小分子核仁RNA（smallnucleolarRNA,snoRNA）④染色體RNA（chromosomalRNA,chRNA）（3）線粒體RNA（mitochondrialRNA,mitRNA）（4）葉綠體RNA（chloroplastRNA,chlRNA或ctRNA）第89頁/共211頁第90頁/共211頁DHU環(huán)IGC反密碼子反密碼環(huán)氨基酸臂可變環(huán)TψC環(huán)CCAAla3′5′

1965年4.2tRNA第91頁/共211頁tRNA約占總RNA的10％－15％，Mr較?。∕r25000），沉降常數(shù)4S。tRNA分子中約20多個位置上的核苷酸是保守的（不變和半不變的）tRNA有很多種類，已知每一個氨基酸至少有一個相應(yīng)的tRNA。tRNA分子的大小很相似，鏈長一般在73－88個核苷酸之間，最長的有93個核苷酸。從tRNA的結(jié)構(gòu)中可以看到在鏈內(nèi)部有很多配對的部分形成局部的雙鏈結(jié)構(gòu)，不配對的部分形成突環(huán)結(jié)構(gòu)。第92頁/共211頁4.2.1tRNA的二級結(jié)構(gòu)tRNA的二級結(jié)構(gòu)都呈”三葉草”形狀，1）氨基酸臂

包含有tRNA的3’-末端和5’-末端，3’-末端為—CCA-OH，氨基酸可與其成酯，在蛋白質(zhì)合成中起攜帶氨基酸的作用。第93頁/共211頁2）反密碼環(huán)

一般含有7個核苷酸殘基，其中正中的3個核苷酸殘基稱為反密碼子,反密碼子與mRNA相互作用第94頁/共211頁

PairingbetweentRNA'santicodonandmRNA'scodon.

Theleftfiguredefinesthewobblepositionwherebasepairingdoesnotobeythestandardrule.

Therighttablesshowallpossiblebasepairingsatthewobbleposition.

Forexample,guanine(G)canpairwithbothcytosine(C)anduracil(U);inosine(I)canpairwithcytosine,adenineanduracil.第95頁/共211頁3）二氫尿嘧啶環(huán)(D)

含有二氫尿嘧啶。識別氨酰-tRNA合成酶4）TC環(huán)

假尿嘧啶核苷—胸腺嘧啶核糖核苷環(huán)(TC)由7個核苷酸組成，通過由5對堿基組成的雙螺旋區(qū)(TC臂)與tRNA的其余部分相連。識別核蛋白體（核糖體）第96頁/共211頁5）額外環(huán)（可變區(qū)）不同的tRNA該區(qū)變化較大，3-18b，是tRNA的分類指標(biāo)之一。6）含有修飾堿基和不變核苷酸。第97頁/共211頁1980年牛心線粒體tRNAser只有63個核苷酸，沉降常數(shù)3S，缺少D環(huán)和D臂，呈二葉草型。

近年來發(fā)現(xiàn)2種線蟲線粒體tRNA也不是標(biāo)準(zhǔn)的三葉草結(jié)構(gòu)。第98頁/共211頁在三葉草型二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，突環(huán)上未配對的堿基由于整個分子的扭曲而配成對，目前已知的tRNA的三級結(jié)構(gòu)均為倒L型4.2.2tRNA的三級結(jié)構(gòu)第99頁/共211頁第100頁/共211頁轉(zhuǎn)運氨基酸識別密碼子參與翻譯起始參與DNA的反轉(zhuǎn)錄參與基因表達調(diào)控4.2.3tRNA的功能第101頁/共211頁4.3.1rRNArRNA約占全部RNA的80％，與蛋白質(zhì)（40%）共同組成核糖體。由于核糖體是蛋白質(zhì)的合成場所，因此rRNA必然與蛋白質(zhì)的生物合成有密切的關(guān)系。23SrRNA具有催化肽鍵形成的轉(zhuǎn)移酶活性。參與tRNA與mRNA的結(jié)合。rRNA為單鏈結(jié)構(gòu)。原核細(xì)胞中的rRNA有3種，真核細(xì)胞中的rRNA有4種。第102頁/共211頁原核生物核糖體70S50S30S5SrRna23SrRNA34種蛋白質(zhì)16SrRNA21種蛋白質(zhì)80S60S40S5SrRNA5.8SrRNA28SrRNA49種蛋白質(zhì)18SrRNA33種蛋白質(zhì)真核生物核糖體4.3.2rRNA的種類（根據(jù)沉降系數(shù)）第103頁/共211頁第104頁/共211頁4.4mRNA和hnRNA

約占總RNA的5％左右，為單鏈結(jié)構(gòu)，不同細(xì)胞的mRNA鏈的長度和相對分子量的差異很大。

mRNA的功能是將DNA的遺傳信息傳遞到蛋白質(zhì)的合成場所－核糖體上。新合成的肽鏈的氨基酸順序即根據(jù)mRNA所傳遞的信息來決定的。第105頁/共211頁DNAmRNA蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯原核細(xì)胞真核細(xì)胞第106頁/共211頁4.4.1mRNA的結(jié)構(gòu)真核生物mRNA特征：單順反子，斷裂基因“帽子”（m7G-5′ppp5′-N-3′p）+單順反子+“尾巴”（PolyA）原核生物mRNA特征：多順反子先導(dǎo)區(qū)+翻譯區(qū)（多順反子）+末端序列第107頁/共211頁hnRNA內(nèi)含子(intron)mRNA

外顯子(exon)4.4.2真核生物mRNA成熟過程斷裂、修剪、修飾細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)第108頁/共211頁*真核生物mRNA的結(jié)構(gòu)特點1.大多數(shù)真核mRNA的5′末端均在轉(zhuǎn)錄后加上一個7-甲基鳥苷，同時第一個核苷酸的C′2也是甲基化，形成帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppNm-。2.大多數(shù)真核mRNA的3′末端有一個多聚腺苷酸(polyA)結(jié)構(gòu)，稱為多聚A尾。第109頁/共211頁帽子結(jié)構(gòu)：由甲基化酶催化；可抵抗5′核酸外切酶降解mRNA；可為核糖體提供識別位點，使mRNA很快與核糖體結(jié)合，促進蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物的形成。多聚A尾：轉(zhuǎn)錄后由poly(A)聚合酶催化加尾；PolyA是mRNA由核進入胞質(zhì)所必需的形式；polyA與mRNA半壽期有關(guān)，PolyA大大提高mRNA在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。第110頁/共211頁原核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)特點5′3′順反子順反子順反子插入順序插入順序先導(dǎo)區(qū)末端順序★由先導(dǎo)區(qū)、插入序列、翻譯區(qū)和末端序列組成。沒有5′帽子和3′polyA?！颯D序列：5′端先導(dǎo)區(qū)中，有一段富含嘌呤的堿基序列，典型的為5′-AGGAGGU-3′，位于起始密碼子AUG前約10核苷酸處，此序列由Shine和Dalgarno發(fā)現(xiàn)，稱SD序列?！颯D序列與翻譯起始有關(guān)，是核糖體小亞基16SrRNA結(jié)合的部位。第111頁/共211頁4.5snRNA和siRNA除了上述三種RNA外，細(xì)胞的不同部位存在的許多其他種類的小分子RNA，snRNA主要存于細(xì)胞核中，占細(xì)胞RNA總量的0.1～1%，與蛋白質(zhì)以RNP（核糖核酸蛋白）的形式存在，在hnRNA和rRNA的加工、細(xì)胞分裂和分化、協(xié)助細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運輸、構(gòu)成染色質(zhì)等方面有重要作用。第112頁/共211頁小片段干擾RNA（siRNA；又稱“引導(dǎo)RNAs”，guideRNAs）：一些小的雙鏈RNA可以高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達，促使mRNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾（RNAinterference，RNAi，也譯作RNA干預(yù)或干涉）。它是體內(nèi)抵御外在感染的一種重要保護機制。第113頁/共211頁4.6RNA的其它功能1981年，Cech發(fā)現(xiàn)RNA的催化活性，提出核酶大部分核酶參加RNA的加工和成熟，也有催化C-N鍵的合成。23SrRNA具肽酰轉(zhuǎn)移酶活性。RNA在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯中均有一定的調(diào)控作用，與某寫物質(zhì)的運輸與定位有關(guān)。RNA組學(xué)研究細(xì)胞中RNA的種類、結(jié)構(gòu)和功能。同一生物體內(nèi)不同種類的細(xì)胞、同一細(xì)胞在不同時間、不同狀態(tài)下RNAs的表達具有時間和空間特異性。RNA組學(xué):第114頁/共211頁第115頁/共211頁1核酸的理化性質(zhì)2核酸的水解3核酸的酸堿性質(zhì)4核酸的紫外吸收5核酸的變性，復(fù)性及雜交第116頁/共211頁1核酸的理化性質(zhì)核酸的兩性性質(zhì)及等電點：與蛋白質(zhì)相似，核酸分子中既含有酸性基團（磷酸基）也含有堿性基團（氨基），因而核酸也具有兩性性質(zhì)。核酸的等電點比較低。如DNA的等電點為4～4.5，RNA的等電點為2～2.5。RNA的等電點比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通過氫鍵促進了磷酸基上質(zhì)子的解離。DNA沒有這種作用。第117頁/共211頁性狀：DNA為白色纖維狀固體，而RNA為白色粉末。粘度：DNA粘度極高，也極易在機械力作用下折斷。雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA時，粘度下降。而RNA溶液要小得多。溶解度：DNA和RNA均不溶于一般的有機溶劑，微溶于水，但它們的鈉鹽在水中溶解度較大。穩(wěn)定性：RNA能在室溫條件下被稀堿水解而DNA對堿穩(wěn)定。第118頁/共211頁2核酸的水解2.1酸水解糖苷鍵和磷酸酯鍵都能被酸水解對酸的敏感性：糖苷鍵＞磷酸酯鍵嘌呤糖苷鍵＞嘧啶糖苷鍵利用酸水解可以研究核酸的堿基組成第119頁/共211頁2.2堿水解RNA的磷酸酯鍵對堿敏感室溫，0.3～1mol/LKOH，24h，可將RNA完全水解，得到2′-或3′-核苷酸的混合物。DNA抗堿水解生理意義：DNA更穩(wěn)定，遺傳信息。RNA是DNA的信使，完成任務(wù)后迅速降解。第120頁/共211頁2.3酶水解非特異的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5′-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3′-核苷酸特異的磷酸二酯酶：核酸酶磷酸二酯酶N-糖苷酶第121頁/共211頁作用于DNA、RNA第122頁/共211頁2.3.1核酸酶的分類★底物專一性：核糖核酸酶RNase

脫氧核糖核酸酶DNase★作用方式：核酸外切酶（exonuclease)、核酸內(nèi)切酶(endonuclease)單鏈核酸酶、雙鏈核酸酶、雜鏈核酸酶★磷酸二酯鍵的斷裂方式：3′-OH切斷產(chǎn)生5′-（寡）核苷酸5′-OH切斷產(chǎn)生3′-（寡）核苷酸2.3酶水解第123頁/共211頁2.3.2核糖核酸酶RNAase★RNaseH作用于DNA-RNA中的RNA鏈★牛胰核糖核酸酶（pancreaticribonuclease),RNaseI最適pH：7.0-8.2,耐熱，高度專一的內(nèi)切酶作用位點：嘧啶核苷-3′-磷酸與其他核苷酸之間的連鍵產(chǎn)物：3′-嘧啶核苷酸或以其為結(jié)尾的寡核苷酸。

★RNaseT1耐熱、耐酸產(chǎn)物：3′-鳥苷酸或以其為結(jié)尾的寡核苷酸，專一性更高★RNaseT2產(chǎn)物：將tRNA完全水解為以3′-腺苷酸結(jié)尾的寡核苷酸第124頁/共211頁第125頁/共211頁2.3.3脫氧核糖核酸酶DNase★牛胰脫氧核糖核酸酶，DNaseI

切斷雙鏈或單鏈DNA，產(chǎn)生以5′-磷酸為末端的寡核苷酸★牛脾脫氧核糖核酸酶，DNaseⅡ產(chǎn)生以3′-磷酸為末端的寡核苷酸★DNA限制性內(nèi)切酶★核酸酶S：作用于單鏈DNA部分★鏈球菌脫氧核糖核酸酶產(chǎn)生長度不一的5′-磷酸為末端的碎片第126頁/共211頁第127頁/共211頁

原核生物中存在著一類能識別外源DNA雙螺旋中4-8個堿基對所組成的特異的具有二重旋轉(zhuǎn)對稱性的回文序列，并在此序列的某位點水解DNA雙螺旋鏈，產(chǎn)生粘性末端或平末端，這類酶稱為限制性內(nèi)切酶（ristrictionendonuclease）。第128頁/共211頁回文序列又叫反向重復(fù)序列5′5′5′5′3′3′3′3′序列旋轉(zhuǎn)180°后還是一樣；兩條鏈從5‘到3‘方向的序列一致；是自我互補的序列；“AblewasIereIsawElba”在我看到厄爾巴島之前，我曾所向無敵。第129頁/共211頁酶辨認(rèn)的序列和切口說明‥‥AGCT‥‥‥‥TCGA‥‥‥‥GGATCC‥‥‥‥CCTAGG‥‥‥‥AGATCT‥‥‥‥TCTAGA‥‥‥‥GAATTC‥‥‥‥CTTAAG‥‥‥‥AAGCTT‥‥‥‥TTCGAA‥‥‥‥GTCGAC‥‥‥‥CAGCTG‥‥‥‥CCCGGG‥‥‥‥GGGCCC‥‥BamHIAluIBglIEcoRIHindⅢSalISmaI四核苷酸，平端切口六核苷酸，平端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口第130頁/共211頁

I型：分子量大于105，多亞基，需S-線苷蛋氨酸、ATP和Mg2+，識別位點與切割位點相差甚遠(yuǎn)，產(chǎn)物為異質(zhì)，是限制與修飾相排斥的多功能酶.

Ⅱ型：分子量小于105，需Mg2+，切割位點位于識別位點上，產(chǎn)物為專一性片段，不具修飾酶功能?，F(xiàn)在分子生物學(xué)研究所用的限制性內(nèi)切酶均為此類。

Ⅲ型：識別位點為5-7bp的非對稱序列

，切割位點在順序之外離識別序列5-10bp，切割雙鏈，個別也切割單鏈。是限制與修飾相競爭的多功能酶.第131頁/共211頁例：EcoRI，這是從大腸桿菌（Ecoli）R菌珠中分離出的一種限制性內(nèi)切酶

限制性內(nèi)切酶是分析染色體結(jié)構(gòu)、制作DNA限制圖譜、進行DNA序列測定和基因分離、基因體外重組等研究中不可缺少的工具，是一把天賜的神刀，用來解剖纖細(xì)的DNA分子。EEscherichia(屬)cocoli(種)RRY13(品系)I首先發(fā)現(xiàn)在此類細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的順序限制酶的命名是根據(jù)細(xì)菌種類而定，以EcoRI為例：第132頁/共211頁3核酸的酸堿性質(zhì)核酸能發(fā)生兩性解離。

DNA等電點4～4.5RNA等電點2～2.5堿基的解離：堿性解離和酸性解離核苷的解離：糖環(huán)影響堿基的解離核苷酸的解離：磷酸基團使核苷酸具有較強的酸性第133頁/共211頁嘧啶第134頁/共211頁第135頁/共211頁第136頁/共211頁第137頁/共211頁4核酸的紫外吸收核酸的堿基具有共軛雙鍵體系，因而具有獨特的紫外線吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰。可以作為核酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)。DNA和RNA溶液中加入溴化乙錠（EB），在紫外下發(fā)出熒光。第138頁/共211頁EB與DNA的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性可以用來檢測單鏈或雙鏈核酸（DNA或RNA）可以嵌入堿基分子中，導(dǎo)致錯配并不能進入通過皮膚進入細(xì)胞內(nèi)。。第139頁/共211頁核酸的凝膠電泳第140頁/共211頁紫外分光光度法的應(yīng)用首先根據(jù)A260/A280的比值判斷核酸樣品的純度純DNA：A260/A280=1.8純RNA：A260/A280=2.0（若樣品中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低）純的核酸樣品可根據(jù)260nm的光吸收值算出其含量若260nm光吸收值為1相當(dāng)于50μg/ml雙螺旋DNA或相當(dāng)于40μg/ml單鏈DNA或RNA或相當(dāng)于20μg/ml寡核苷酸。第141頁/共211頁第142頁/共211頁核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少30～40%，當(dāng)核酸變性或降解時光吸收值顯著增加（增色效應(yīng)），但核酸復(fù)性后，光吸收值又回復(fù)到原有水平（減色效應(yīng)）。雙鏈、單鏈DNA與核苷酸的紫外吸收之比是1:1.37:1.6第143頁/共211頁5核酸的變性，復(fù)性及雜交核酸變性指核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價鍵斷裂。核酸的的一級結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。磷酸二酯鍵斷裂稱作核酸降解。DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂5.1變性5.1.1變性概念第144頁/共211頁DenaturationofDNA

變性表征：生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加變性因素：妨礙堿基堆積力和增加靜電斥力。pH（>11.3或<5.0）、變性劑（脲、甲酰胺、甲醛）、低離子強度、加熱第145頁/共211頁結(jié)構(gòu)：螺旋→線團理化性質(zhì)：紫外吸收↑粘度↓比旋光度↓生物活性：生物活性↓或喪失5.1.2熱變性和Tm第146頁/共211頁當(dāng)DNA的稀鹽溶液加熱到80-100℃時，雙螺旋結(jié)構(gòu)即發(fā)生解體，兩條鏈彼此分開，形成無規(guī)線團。8090100100%50%OD260（254）

Tm

變性溫度范圍①②③℃★DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi)。第147頁/共211頁

融解溫度（meltingtemperature,Tm）：DNA熱變性過程中，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時對應(yīng)的溫度稱為該DNA得熔點或熔解溫度（Tm）第148頁/共211頁60801001.01.41.2100%A260t\0CTmTmTm1）Tm的大小與DNA分子中（G+C）的百分含量成正相關(guān)，測定Tm值可推算核酸堿基組成及判斷DNA純度。

經(jīng)驗式:(G+C)%=(Tm-69.3)×2.44Polyd(A-T)DNAPolyd(G-C)某些DNA的Tm值5.1.3影響Tm的因素第149頁/共211頁3）介質(zhì)中離子強度離子強度高，Tm高。大腸桿菌DNA在不同濃度KCl溶液下的熔融溫度曲線2）DNA均一性均一性高，變性的溫度范圍越窄，據(jù)此可分析DNA的均一性。第150頁/共211頁變性核酸的互補鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下，重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為復(fù)性。5.2復(fù)性5.2.1復(fù)性過程第151頁/共211頁理化性質(zhì):比旋光度↑粘度↑高于Tm值5℃

復(fù)性也稱退火（annealing）生物活性得到部分恢復(fù)，具有減色效應(yīng)。變性的DNA緩慢冷卻時可復(fù)性，因此又稱為“退火”第152頁/共211頁5.2.2影響復(fù)性速度的因素：（1）單鏈片段濃度（2）單鏈片段的大小（3）重復(fù)序列的多少（5）溶液溫度的高低T–25℃（4）維持一定的溶液離子強度第153頁/共211頁5.3核酸的雜交在退火條件下，不同來源的DNA互補區(qū)形成雙鏈，或DNA單鏈和RNA鏈的互補區(qū)形成DNA-RNA雜合雙鏈的過程叫做分子雜交。DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復(fù)性不同來源的DNA分子第154頁/共211頁第155頁/共211頁有堿基配對的區(qū)域不同來源的DNA單鏈間或單鏈DNA與RNA之間只要有堿基配對的區(qū)域，在適宜的條件（溫度及離子強度）下，在復(fù)性時可形成局部雙螺旋區(qū)，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈第156頁/共211頁第157頁/共211頁探針：用放射性同位素或熒光標(biāo)記的DNA或RNA片段。原位雜交技術(shù)：直接用探針與菌落或組織細(xì)胞中的核酸雜交，未改變核酸所在的位置。點雜交：將核酸直接點在膜上，再與核酸雜交。Southern印跡法：將電泳分離后的DNA片段從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再進行雜交。Northern印跡法：將電泳分離后的RNA吸印到纖維素膜上再進行分子雜交。Western印跡法：將電泳分離后的蛋白吸印到纖維素膜上再進行分子雜交。探針是抗體。第158頁/共211頁第159頁/共211頁第160頁/共211頁核酸分子雜交的應(yīng)用研究DNA分子中某一種基因的位置確定兩種核酸分子間的序列相似性檢測某些專一序列在待檢樣品中存在與否是基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ)特定基因序列的定量和定性、突變分析、疾病診斷等第161頁/共211頁

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)Polymerase:

DNA聚合酶

第162頁/共211頁基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴增第163頁/共211頁PCR技術(shù)的創(chuàng)建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實現(xiàn)。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)

1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。第164頁/共211頁KaryB.Mullis（1944－）第165頁/共211頁三篇重要論文TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymerase(Science,1988,239(4839):487-91

)SpecificSynthesisofDNAInVitroviaaPolymeraseCatalyzedChainReaction(MethodsinEnzymology,1987,155:335-50)

第166頁/共211頁生物樣品DNA片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學(xué)檢測人類學(xué)研究……PCR技術(shù)誕生所依賴的社會需求和研究需要第167頁/共211頁基因組DNA獲取特定DNA片段擴增特定DNA片段第168頁/共211頁限制性內(nèi)切酶裂解基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝基因組DNA文庫DNA文庫20kBfragments插入噬菌體載體細(xì)菌擴增第169頁/共211頁裂解變性顯影從基因組文庫中篩選目的基因probe放射性核素標(biāo)記轉(zhuǎn)印第170頁/共211頁DNA克隆目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴增擴增提取DNA分子第171頁/共211頁DNA聚合酶引物引物M13噬菌體Sanger的測序技術(shù)引物DNA聚合酶1977年第172頁/共211頁引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年第173頁/共211頁94℃變性50-65℃退火XX℃延伸第174頁/共211頁94℃55℃37℃第175頁/共211頁Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)40506070809010010080604020第176頁/共211頁72℃94℃55℃PCR循環(huán)第177頁/共211頁PCR技術(shù)的原理1PCR技術(shù)的基本原理

無細(xì)胞分子克隆法：在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴增了特異區(qū)段的DNA帶。

第178頁/共211頁

體內(nèi)DNA的復(fù)制DNA聚合酶dNTP解旋酶類引物復(fù)習(xí)5’3’第179頁/共211頁加熱變性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性加熱或強酸、堿性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這稱為DNA的變性。解除變性的條件后,變性的單鏈可以重新結(jié)合起來,形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復(fù),這稱DNA復(fù)性,也叫退火。

第180頁/共211頁PCR擴增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火第181頁/共211頁PCR原理SampledenaturatationPrimerannealingPrimerextension第182頁/共211頁PCRproduct第183頁/共211頁PCR反應(yīng)曲線第184頁/共211頁標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10×擴增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul第185頁/共211頁PCR反應(yīng)五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）

dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）第186頁/共211頁引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增第187頁/共211頁引物設(shè)計的原則（一）①引物長度：

15-30bp，常用為20mer左右引物的有效長度不能大于38mer，否則最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃），不能保證PCR擴增產(chǎn)物的特異性②引物擴增跨度：以500bp為宜特定條件下可擴增長至10kb的片段③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列第188頁/共211頁引物設(shè)計的原則（二）④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴增條帶⑤引物3’端的堿基要求嚴(yán)格配對特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失?、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處第189頁/共211頁引物設(shè)計的原則（三）⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性⑧引物量：每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會第190頁/共211頁引物設(shè)計的原則（四）RT-PCR引物設(shè)計特別注意：跨越兩個外顯子第191頁/共211頁酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)天然酶：從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100ul時）濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少第192頁/共211頁dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系dNTP呈顆粒狀，保存不當(dāng)易變性失活dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低第193頁/共211頁模板（靶基因，targetgene）模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用