院級(jí)本科生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目

研究報(bào)告項(xiàng)目名稱畜、禽肉中八種抗生素的測(cè)定立項(xiàng)時(shí)間2011年3月計(jì)劃完成時(shí)間2012年3月項(xiàng)目負(fù)責(zé)人鄧明鏡學(xué)院與班級(jí)化生學(xué)院 生技0901班2012年4月22日教務(wù)處北京科技大學(xué)教務(wù)處院級(jí)本科生科技創(chuàng)新 畜禽肉中八種抗生素的測(cè)定院級(jí)本科生科技創(chuàng)新 畜禽肉中八種抗生素的測(cè)定#抗生素是由微生物或高等動(dòng)植物在生活過(guò)程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要用于治療各種細(xì)菌感染或其以致病微生物感染，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域中。有人估計(jì)，由于抗生素的發(fā)明，全人類的平均壽命增加了10歲。但是，抗生素的廣泛使用，也帶來(lái)了一些嚴(yán)重問(wèn)題。例如，若過(guò)量的注射或在飼料中添加抗生素， 將致使病菌耐藥能力逐年增強(qiáng)， 從而減少畜、禽對(duì)病菌的抵抗力； 而人體經(jīng)常攝入低劑量的抗生素殘留物， 會(huì)逐漸在體內(nèi)蓄積而導(dǎo)致各種器官病變。 所以抗生素殘留已經(jīng)成為乳肉類食品安全中一個(gè)日益嚴(yán)峻的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)采用高效□□□□□□ HPLC□，在中華人民□□□□□□□□□(GB/T5009.116-2003)的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，旨在建立一種能夠同時(shí)檢測(cè)畜禽肉□□□□ OTC)、金霉素( CTC)、四環(huán)素( TC)、氯霉素( CLP)、磺胺、磺胺□□□□ SM2)□□□□□□□ SMZ)□□□□□ FPA)□□□□□□□□□□□□□□□□： □□□□□ ODS-C1(5pm)6.2mm115cm,檢測(cè)波長(zhǎng) 355nm和 280nm,柱溫 40口，流速 0.8mL/min,進(jìn)口量 20P L, □□□□□□： 0.01mol/L磷酸二氫鈉(用 30%硝酸溶液調(diào)節(jié) PH2.5)=23:77。本方法對(duì)八種抗生素的分離效果較好， 實(shí)現(xiàn)了基線分離。 實(shí)驗(yàn)中分別研究并確定了八種抗生素的檢出口( LOD)□□□□□ LOQ)和線性范圍；而在實(shí)際肉樣的測(cè)定中，由于磺胺的出峰時(shí)間與雞肉雜質(zhì)峰相重合，所以我們比較三種 C18固相萃取小柱對(duì)干擾物的去除效果， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雜質(zhì)的去除效果均不明顯， 無(wú)法測(cè)算其標(biāo)準(zhǔn)曲線， 而其他七種抗生素測(cè)定效果理想。 本方法的建立更快捷的實(shí)現(xiàn)了肉類中多種抗生素殘留的檢測(cè)； 不僅節(jié)約了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的成本， 縮短了檢測(cè)時(shí)間，還大大提高了檢測(cè)精度。[關(guān)鍵詞 ]抗生素高效液相色譜 畜禽肉目錄TOC\o"1-5"\h\z摘要 1\o"CurrentDocument"緒論 3項(xiàng)目背景條件 3項(xiàng)目意義 3主要工作 3\o"CurrentDocument"2文獻(xiàn)綜述 4抗生素概述 錯(cuò)誤！未定義書(shū)簽。 4抗生素定義 4抗生素種類 4四類抗生素簡(jiǎn)介 5抗生素殘留現(xiàn)狀 5抗生素殘留檢測(cè)方法 6高效液相色譜法 7高效液相色譜法原理 7高效液相色譜法特點(diǎn) 7ODS柱和固相萃取小柱 7檢出口( LOD)和定量限( LOQ) 83畜禽肉中八種抗生素的檢測(cè) 9實(shí)驗(yàn)材料及儀器 9材料 9儀器 9實(shí)驗(yàn)方法 9豬肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留量的測(cè)定 9豬肉中氯霉素殘留量的測(cè)定 10條件優(yōu)化，雞肉中四環(huán)素殘留的測(cè)定 11八種抗生素檢出口( LOD),定量限( LOQ)和線性范圍的確定 11雞肉中八種抗生素含量的測(cè)定 11固相萃取小柱的凈化 12\o"CurrentDocument"4實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 12豬肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留量的測(cè)定 12豬肉中氯霉素殘留量的測(cè)定 15條件優(yōu)化，雞肉中四環(huán)素殘留的測(cè)定 17八種抗生素檢出口( LOD),定量限( LOQ)和線性范圍的確定 19雞肉中八種抗生素含量的測(cè)定 19固相萃取小柱的凈化 24結(jié)論 25參 考文獻(xiàn) 28附錄A原始數(shù)據(jù) 致謝 緒論項(xiàng)目背景條件抗生素最早發(fā)現(xiàn)于 1929年，英國(guó)科學(xué)家弗萊明培養(yǎng)細(xì)菌時(shí) 觀察到，空氣中偶然落在培養(yǎng)基上的青霉菌的菌落周圍沒(méi)有其他細(xì)菌生長(zhǎng)， 他認(rèn)為是青霉菌產(chǎn)生了某種化學(xué)物質(zhì)，并且分泌到培養(yǎng)基中抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)。 這種化學(xué)物質(zhì)就是最□□□□□□□(antibiotics)——□□□□□□□□□□□□□□□□□□□,在第二次世界大戰(zhàn)中挽救了無(wú)數(shù)人的生命。自20世紀(jì)初青霉素問(wèn)世以來(lái)，抗生素作為抗感染治療的重要藥物，在保障人類健康中發(fā)揮著重要的作用。隨著現(xiàn)代醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，在畜、禽、牧、水生生物等產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用藥物對(duì)動(dòng)物進(jìn)行診斷、 預(yù)防和治療疾病， 以及促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率等日益普遍， 并且?guī)?lái)了可觀的經(jīng)濟(jì)效益。 但人們長(zhǎng)期食用這種動(dòng)物食品及制品， 必然會(huì)危及人類健康。 一些國(guó)家相繼成立了各種相應(yīng)的管理組織， 通過(guò)立法來(lái)規(guī)范、 制定和管理動(dòng)物組織及產(chǎn)品中抗生素殘留的限量標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)還加強(qiáng)了對(duì)動(dòng)物性食品中抗生素殘留的檢測(cè)、 檢查工作以及對(duì)各種違法犯罪行為的打擊力度。項(xiàng)目意義研究表明， 動(dòng)物源食品中殘留抗生素是誘發(fā)兒童肥胖的一個(gè)重要因素， 長(zhǎng)期食用有抗生素殘留的動(dòng)物性食品， 不僅會(huì)使病菌產(chǎn)生抗藥性， 而且還會(huì)造成一些非致病菌的死亡。 例如人體腸道內(nèi)寄生著對(duì)人體有益的微生物菌群， 它們與人體為互利共生關(guān)系， 正常情況下， 微生物菌群處于平衡狀態(tài)； 若體內(nèi)抗生素積蓄過(guò)量，□□□□□□□, □□□□□□□□□□ B□□□□□□□□□□□□□□,造成嚴(yán)重的肝損害，從而引起維生素缺乏。 經(jīng)常食用含有青霉素、四環(huán)素、磺胺類藥物的乳肉制品， 極易引起易染個(gè)體的過(guò)敏反應(yīng)， 嚴(yán)重者可引起皮疹、 呼吸困難、休克等癥狀，甚至危及生命。乳肉類中抗生素的檢測(cè)根據(jù)檢測(cè)原理不同， 主要分為免疫學(xué)方法、 微生物法和理化分析法三類。 但是在動(dòng)物源性食品中， 由于其蛋白質(zhì)及脂肪含量高、 基質(zhì)復(fù)雜等原因， 對(duì)磺胺及四環(huán)素類抗生素殘留的測(cè)定多采用分別測(cè)定的方法， 較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而最有效的檢測(cè)方法是采用固相萃取凈化、色譜分離后進(jìn)行質(zhì)譜分析，該法需昂貴的儀器，在推廣上受到限制。所以，建立一種簡(jiǎn)便、快捷、靈敏且同時(shí)可以檢測(cè)多種抗生素的檢測(cè)方法迫在眉睫。本方法建立了同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中常用的 3種磺胺類藥物：磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑和磺胺； 3種四環(huán)素類藥物：土霉素、四環(huán)素和金霉素；一種喹諾酮類藥物：氟哌酸；和一種氯霉素類藥物：氯霉素，共八種抗 生素殘留的方法,根據(jù)用高效□□□□□□ HPLC□□□□□□□土霉素、四環(huán)素和金霉素的中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，改良優(yōu)化其方法步驟，以節(jié)約實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的費(fèi)用及檢測(cè)的時(shí)間，避免重復(fù)性勞動(dòng)，達(dá)到快速、便捷的效果。1.3主要工作本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的動(dòng)物性食品為畜、 禽肉， 主要儀器是高效液相色譜儀， 在中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法( GB/T5009.116-2003)的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，具體工作如下：測(cè)定八種抗生素的出峰時(shí)間、線性范圍、檢出限和定量限；測(cè)定豬肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、氯霉素殘留量；優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，測(cè)定雞肉中四環(huán)素殘留量；測(cè)定雞肉中八種抗生素含量；比較三種C18固相萃取小柱對(duì)干擾物的去除效果。文獻(xiàn)綜述抗生素概述抗生素定義抗生素是由微生物或高等動(dòng)植物在生活過(guò)程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物， 且能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)。 在體外能抑制微生物的生長(zhǎng)，而對(duì)宿主不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。通俗地講，抗生素就是用于治療各種細(xì)菌感染或其以致病微生物感染的藥物。抗生素以前被稱為抗菌素，事實(shí)上它不僅能殺滅細(xì)菌而且對(duì)霉菌、支原體、衣原體等其它致病微生物也有良好的抑制和殺滅作用，近年來(lái)通常將抗菌素改稱為抗生素。衛(wèi)生部調(diào)查顯示， 我國(guó)是世界上抗生素濫用最嚴(yán)重的國(guó)家， 平均每年每人要“掛8瓶水”，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國(guó)際上 2.5瓶-3.3瓶的水平。 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)， 我國(guó)抗生素人均年消費(fèi)量為 138克左右，是美國(guó)的 10倍。在中國(guó)住院患者中，抗生素的使用率達(dá)到 70%，而實(shí)際上八成病人不需要抗生素。除經(jīng)濟(jì)利益外，抗生素濫用還來(lái)自于病人的壓力以及醫(yī)生的用藥習(xí)慣。抗生素分類抗生素主要有以下幾種分類：①P-內(nèi)酰胺類青霉素類和頭孢菌素類 分子結(jié)構(gòu)中含有 P-內(nèi)酰胺口為基本特征□ 近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)了硫口素類、 單內(nèi)酰環(huán)類，P-內(nèi)酰酶抑制劑□甲氧青霉素類等幾類抗生素。②氨基糖甙類 包括鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小諾霉素、阿斯霉素等。③四環(huán)素類 包括四環(huán)素、土霉素、金霉素及強(qiáng)力霉素等。④氯霉素類 包括氯霉素、甲砜霉素等。⑤大環(huán)內(nèi)脂類 臨床常用的有紅霉素、白霉素、無(wú)味紅霉素、乙酰螺旋霉素、麥迪霉素、交沙霉素等。⑥作用于 G+細(xì)菌□□□□□□ 如林可霉素、氯林可霉素、萬(wàn)古霉素、桿菌肽等。⑦作用于G菌的其它抗生素 如多粘菌素、磷霉素、卷霉素、環(huán)絲氨酸、利福平等。⑧抗真菌抗生素 如灰黃霉素。⑨抗腫瘤抗生素 如絲裂霉素、放線菌素 D、博萊霉素、阿霉素等。⑩具有免疫抑制作用的抗生素如環(huán)孢霉素。八種抗生素簡(jiǎn)介本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的八種抗生素主要為四大類：四環(huán)素類的土霉素、四環(huán)素、金霉素；氯霉素類的氯霉素；磺胺類的磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺；喹諾酮類的氟哌酸。四環(huán)素類：四環(huán)素類抗生素是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，其結(jié)構(gòu)均含并四苯基本骨架。廣泛用于多種細(xì)菌及立克次氏體、衣原體、支原體等所致之感染。四環(huán)素類抗生素在酸性和堿性條件下均不穩(wěn)定，四環(huán)素類藥物中含有許多羥基、烯醇羥基及羰基，在中性條件下能與多種金屬離子形成不溶性螯合物。與鈣或鎂離子形成不溶性的鈣鹽或鎂鹽，與鐵離子形成紅色絡(luò)合物，與鋁離子形成黃色絡(luò)合物。氯霉素類：一種由委內(nèi)瑞拉鏈霉菌中分離提取的廣譜抗生素。對(duì)許多需氧革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌、厭氧的擬桿菌、立克次氏體、衣原體及菌質(zhì)體都有抑制作用，尤其對(duì)沙門(mén)氏菌屬、流感桿菌和擬桿菌屬等有良好的抗菌能力。氯霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)含有對(duì)硝基苯基、丙二醇與二氯乙酰胺三個(gè)部分，其抗菌活性主要與丙二醇有關(guān)?；前奉悾簽槿斯ず铣傻目咕?，具有抗菌譜較廣、性質(zhì)穩(wěn)定、使用簡(jiǎn)便、生產(chǎn)時(shí)不耗用糧食等優(yōu)點(diǎn)?；前奉愃幬镆话銥榘咨蛭ⅫS色結(jié)晶性粉末，遇光易變質(zhì)，色漸變深，大多數(shù)本類藥物在水中溶解度極低，較易溶于稀堿，但形成鈉鹽后則易溶于水，其水溶液呈強(qiáng)堿性。盡管目前有效的抗生素很多，但磺胺類藥在控制各種細(xì)菌性感染的疾病中，特別是在處理急性泌尿系統(tǒng)感染中仍有其重要價(jià)值?；前奉愃幰桩a(chǎn)生耐藥性，在肝內(nèi)的代謝產(chǎn)物 一乙酰化磺胺的溶解度低,易在尿中析出結(jié)晶,引起腎的毒性，因此用藥時(shí)應(yīng)該嚴(yán)格掌握劑量、時(shí)間，同服碳酸氫鈉并多飲水。臨床常用的磺胺類藥物都是以對(duì)位氨基苯磺酰胺（簡(jiǎn)稱磺胺）為基本結(jié)構(gòu)的衍生物。對(duì)許多革蘭氏陽(yáng)性菌和一些革蘭氏陰性菌、諾卡氏菌屬、衣原體屬和某些原蟲(chóng)（如瘧原蟲(chóng)和阿米巴原蟲(chóng)）均有抑制作用。喹諾酮類：又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類，是一類合成抗菌藥。喹諾酮類以細(xì)菌的□□□□□酸□ DNA）□□□□□ DNA回旋酶,進(jìn)一步造成細(xì)菌DNA的不可逆損害，達(dá)到抗菌效果。本類藥物與許多抗菌藥物間無(wú)交叉耐藥性，是理想的抗菌藥。喹諾酮類是主要作用于革蘭陰性菌的抗菌藥物，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的作用較弱（某些品種對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的抗菌作用）?？股貧埩衄F(xiàn)狀近60年來(lái)，抗生素是用于治療人類及獸類疾病的最常用藥物?？股卦谌祟惖姆啦?、 治病， 和畜牧業(yè)中都發(fā)揮著巨大的作用。 但隨著人類生活水平的提高，抗生素殘留已經(jīng)成為了乳肉類食品安全的一個(gè)重要問(wèn)題?？股貧埩羰侵附o動(dòng)物使用抗生素藥物后積蓄或儲(chǔ)存在動(dòng)物細(xì)胞、 組織或器官內(nèi)的藥物原形、 代謝產(chǎn)物或藥物雜質(zhì)。 現(xiàn)在這個(gè)問(wèn)題日趨嚴(yán)重， 對(duì)人類的健康和環(huán)境造成了很大的影響。 抗生素積蓄在人體中會(huì)產(chǎn)生某些毒害作用， 部分體質(zhì)會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)，還會(huì)產(chǎn)生耐藥菌株，重則會(huì)使人體致癌、致畸、致突變。當(dāng)抗生素隨動(dòng)物的糞便等排泄物排入環(huán)境后， 會(huì)對(duì)土壤微生物、水產(chǎn)生物及昆蟲(chóng)造成影響。早在1988年，我國(guó)就對(duì)肉與肉制品的四環(huán)素族抗生素殘留量制定了檢驗(yàn)標(biāo)□□GB9695.16-1988)□□□□□□□,□□□□□□□□□□□□□□□□□仍比較嚴(yán)重。2002年12月到2003年6月，成都市疾病預(yù)防控制中心對(duì)城鄉(xiāng)開(kāi)展調(diào)查：豬肝中金霉素殘留量最高為 21.32%；四環(huán)素類陽(yáng)性檢出率為 6.857%，其陽(yáng)性超標(biāo)率為 73.91%；城鄉(xiāng)豬肉中土霉素、金霉素殘留量分別為達(dá)到最高殘□□□□ MRL)的 14.58倍、11.3倍、5.4倍和2.4□□□□□□□□□□□□也不容忽視。 據(jù)報(bào)道， 2003年蘭州地區(qū)鮮 (生)乳中磺胺的殘留檢出率為 7.41%，磺胺嘧啶為 4.44%，甲氧卞基嘧啶為 12.59%，磺胺甲惡唑?yàn)?21.48%。而氯霉素在我國(guó)列為禁藥， 它會(huì)抑制人體造血系統(tǒng)的功能， 導(dǎo)致白血病。 但氯霉素在水產(chǎn)品、蜂蜜甚至牛奶中仍有殘留， 甚至影響了我國(guó)畜禽產(chǎn)品的出口貿(mào)易。 2002年1月28日，歐盟以氯霉素殘留為由宣布全面禁止從中國(guó)進(jìn)口動(dòng)物源性食品。同年2月7日，英國(guó)以氯霉素超標(biāo)為由停止銷售中國(guó)蜂蜜。我國(guó)開(kāi)展獸藥殘留工作始于 1991年，現(xiàn)在基本形成了農(nóng)業(yè)部監(jiān)控我國(guó)的動(dòng)物及動(dòng)物源性食品中的藥物殘留， 國(guó)家質(zhì)檢總局檢測(cè)進(jìn)出口動(dòng)物源性食品的藥物殘留的局面。 獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)是獸藥殘留監(jiān)控的依據(jù)。 我國(guó)獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)TOC\o"1-5"\h\z制定始于 1994年，共經(jīng)歷了 4次修訂?，F(xiàn)行的獸藥最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)是 2002年12月24日農(nóng)業(yè)部 235號(hào)文件發(fā)布的。 歐洲委員會(huì)也在 2002年3月底提議 “歐盟將全面禁止在飼料中使用生長(zhǎng)素類抗生素作為飼料促生長(zhǎng)添加劑” 。雖然現(xiàn)在世界各地都在限制甚至禁止獸藥中使用抗生素， 但現(xiàn)在抗生素殘留事件仍時(shí)有發(fā)生，非常值得我們關(guān)注?？股貧埩魴z測(cè)方法目前用于檢測(cè)肉類抗生素殘留的方法有很多， 根據(jù)檢測(cè)方法原理的不同， 可主要分為免疫學(xué)方法、微生物法和理化分析法。免疫學(xué)方法是根據(jù)抗原抗體特異性反應(yīng)的基本特征而設(shè)計(jì)的抗生素檢測(cè)方法。免疫反應(yīng)的特點(diǎn)是有較高的選擇性和靈敏性。 目前藥物殘留免疫學(xué)分析技術(shù)主要分為兩大類： 一種是利用免疫分析的高選擇性作為理化測(cè)定技術(shù)中的凈化手段，將免疫技術(shù)與常規(guī)理化分析技術(shù)結(jié)合的方法， 典型方式如免疫親合色譜。 而□□□□□□□□□□,□：□□□□□ ELISA)□□□□□□ RIA)□□□□□器等。微生物法是傳統(tǒng)的， 也是最廣泛應(yīng)用的方法。 其測(cè)定原理是根據(jù)抗生素對(duì)微生物的生理機(jī)能、代謝的抑制作用，來(lái)定性或定量確定樣品中微生物藥品殘留，有紙片法、平板培養(yǎng)抑菌法等。其優(yōu)點(diǎn)是成本低，可在一般實(shí)驗(yàn)室操作，但操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，不能區(qū)分具體的抗生素藥物，靈敏度和特異性較低。理化分析法是利用抗生素分子中的基團(tuán)所具有的特殊反應(yīng)或性質(zhì)來(lái)測(cè)定其(HPLC)、□□□□□□□(HPLC)、□□□□□□□術(shù)等，能進(jìn)行定性、定量和藥物鑒定，敏感性較高。許多理化檢測(cè)方法對(duì)于樣本的制備要求嚴(yán)格 ,需要復(fù)雜樣本前處理和分離技術(shù) (如HPLC,GC,毛細(xì)管電泳CapillaryZoneElectrophoreses),□□□□□□□□□□□□據(jù)不□□□□□,如質(zhì)譜□ MS□,□□□□□□□ (UV-vis),□□□□□ (diodearray),熒光檢測(cè)(fluorescence)等方法。最常用的理化檢測(cè)方法是高效液相色譜和聯(lián)用技術(shù)。高效液相色譜是目前應(yīng)用比較廣泛的一種理化檢測(cè)方法， 它結(jié)合氣相色譜理論， 采用了高壓泵，高效固定相和高靈敏度檢測(cè)裝置， 分離速度快，結(jié)合計(jì)算機(jī)進(jìn)行自動(dòng)控制，結(jié)果精確。本實(shí)驗(yàn)采用的就是理化分析法中的高效液相色譜法測(cè)定。 其敏感度較高，是最常用的檢測(cè)方法。高效液相色譜法高效液相色譜法原理□□□□□□□□ HighPerformanceLiquidChromatography/HPLC是以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)， 將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固體相的色譜柱， 在柱內(nèi)各成分被分離后， 進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分離。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。高效液相色譜的主要類型有：吸附色譜( AdsorptionChromatography)、分配色譜(PartitionChromatography)、離子色譜(IonChromatography)、親和色譜(AffinityChromatography)。高效液相色譜法特點(diǎn)高效液相色譜法有“三高一廣一快”的特點(diǎn)：□□□：□□□□□□，□□□□□□，□□□□□□□，□□□□□□□色譜柱，必須對(duì)載液加高壓。②高效： 分離效能高。 可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果， 比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。□□□□□：□□□□□□□ 0.01ng，進(jìn)口量在uL數(shù)量級(jí)。④應(yīng)用范圍廣： 百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析， 特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢(shì)。⑤分析速度快、 載液流速快： 較經(jīng)典液體色譜法速度快得多， 通常分析一個(gè)樣品在15130分鐘，有些樣品甚至在 5□□□□□□□，□□□□ 1小時(shí)。此外高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)， 與氣相色譜相比各有所長(zhǎng)， 相互補(bǔ)充。 高效液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”。在從進(jìn)樣到檢測(cè)器之間，除了柱子以外的任何死空間(進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測(cè)池等)中，如果流動(dòng)相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會(huì)顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測(cè)器的靈敏度不及氣相色譜高效液相色譜法能夠比較精確的測(cè)定出樣品中所含抗生素的含量， 計(jì)算回收率。 所以本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定抗生素殘留量的中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)， 并優(yōu)化其條件， 使之能夠同時(shí)檢測(cè)不同類的抗生素。ODS柱和)相萃取小柱ODS柱是一種常用的反相色譜柱，也叫 C18□；□□□□□□□□□□□□料□Octadecylsilyl，簡(jiǎn)稱ODS)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□，□□□□□□□□□□ 70180D□□□□□□□□□□□□□□□□□，

有較高的碳含量和更好的疏水性，對(duì)各種類型的生物大分子有更強(qiáng)的適應(yīng)能力，因此在生物化學(xué)分析工作中應(yīng)用的最為廣泛。色譜柱的分類按鍵合到基質(zhì)上的官能團(tuán)可分為：C18(ODS)、C18(ODS)、C8、C4等。CN□□□□NH2氨基等。SO3H□□□□□COOH羧基等。陰□□□□:□□□□□□,□□□□□⑶離子交換鍵合相： 陽(yáng)離子官能團(tuán)：－離子官能團(tuán)：—R4N1季銨基、 -氨基等?！酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢?C18柱。固相萃取主要通過(guò)目標(biāo)物與吸附劑之間的以下作用力來(lái)保留 /吸附的：■口水作用力：如 C18、C8、Silica、苯基柱等21離子交換作用： SAX,SCX,COOH、NH2等31物理吸附： Florsil、Alumina等本實(shí)驗(yàn)使用C18小柱來(lái)進(jìn)行雜質(zhì)的吸附。并且PH對(duì)口相萃取有一定的影響：pH值可以改變目標(biāo)物 /吸附劑的離子化或質(zhì)子化程度。對(duì)于強(qiáng)陽(yáng) /陰離子交換柱來(lái)講， 因?yàn)槲絼┍旧硎峭耆x子化的狀態(tài)， 目標(biāo)物必須完全離子化才可以保證其被吸附劑完全吸附保留。而目標(biāo)物的離子化程度則與 pH值有關(guān)。如對(duì)于弱堿性化合物來(lái)講，其 pH值必須小于其 pKa值兩個(gè)單位才可以保證目標(biāo)物完全離子化，而對(duì)于弱酸性化合物，其 pH值必須大于其 pKa值兩個(gè)單位才能保證其完全離子化。對(duì)于弱陰 /陽(yáng)離子交換柱來(lái)講，必須要保證吸附劑完全離子化才保證目標(biāo)物的完全吸附，而溶液的 pH值必須滿足一定的條件才能保證其完全離子化。固相萃取一般有四步：活化 除去小柱內(nèi)的雜質(zhì)并創(chuàng)造一定的溶劑環(huán)境。 □注意整個(gè)過(guò)程不要使小柱干涸）上樣 將樣品用一定的溶劑溶解， 轉(zhuǎn)移入柱并使組分保留在柱上。 □注意□□□□□，□ 1ml/min□□，□□□□□ 5ml/min）淋洗 最大程度除去干擾物。 □建議此過(guò)程結(jié)束后把小柱完全抽干）洗脫 用小體積的溶劑將被測(cè)物質(zhì)洗脫下來(lái)并收集。 □注意流速不要過(guò)快，以1ml/min為宜）2.5檢出限和定量限HPLC色譜圖上的基線并不是一條直線，而是呈現(xiàn)鋸齒狀，這就是檢測(cè)器的噪音信號(hào)。通過(guò)測(cè)定噪音峰峰高與樣品峰峰高的的比值，來(lái)確定在此系統(tǒng)條件下樣品的檢出限與定量限?！酢酢醍?dāng)?shù)臐舛然蛸|(zhì)量流量定為品濃度?！酢酢醍?dāng)?shù)臐舛然蛸|(zhì)量流量定為品濃度。LOD）：□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□噪音信號(hào)。通過(guò)測(cè)定噪音峰峰高與樣品峰峰高的的比值，來(lái)確定在此系統(tǒng)條件下樣品的檢出限與定量限。□□□當(dāng)?shù)臐舛然蛸|(zhì)量流量定為品濃度?！酢酢醍?dāng)?shù)臐舛然蛸|(zhì)量流量定為品濃度。LOD）：□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□HPLC法的檢出限。也就是信噪比為L(zhǎng)OQ)：□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□HPLC法的定量限。也就是信噪比為3：1的時(shí)候的樣10：1的時(shí)候的樣3材料與方法實(shí)驗(yàn)材料和儀器實(shí)驗(yàn)材料TOC\o"1-5"\h\z□□：□□□□□□□ ,□□□□□□ NaH2PH412H2OD,□□□□ OTC）□□,□□□□ CTCD□□□,□□□□ TC□標(biāo)準(zhǔn)品， 0.1mol/L鹽酸溶液，0.01mol/L鹽酸溶液， 5%高氯酸溶液，甲醇（色譜純） ,□□□,□□□□ CLP）□□,□□□□,□□,□□□□□□□ SM2）,磺胺甲惡唑（ SMZ）,氟哌酸FPA）等。樣品：排酸通脊（購(gòu)自華潤(rùn)萬(wàn)家） ，華都雞胸肉樣（購(gòu)自超市發(fā)超市） 。3.1.2實(shí)驗(yàn)儀器主要實(shí)驗(yàn)儀器見(jiàn)表2.1。表2.1□□□□□□實(shí)驗(yàn)儀器出品公司□□□□□Eppendorfcentrifuge5417R電子天平 AB104-NMettlerToledoJB-3型定時(shí)恒溫磁力攪拌器上海雷磁儀器廠冰箱海爾公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠□□□□□□□□HPLC)島津SHIMADZU恒溫振蕩器太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠 THZ-C□□□□□寧波新芝生物科技公司 SB5200D3.2實(shí)驗(yàn)方法豬肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留量的測(cè)定土霉素(OTC)標(biāo)準(zhǔn)溶液：□□□□□ 0.0100g精確到 0.0001g),用0.1mol/LTOC\o"1-5"\h\z□□□□□□□□ 10.00mL,□□□□□□□□□□ 1mg。四環(huán)素(TC)標(biāo)準(zhǔn)溶液： □□□□□ 0.0100g精確到 0.0001g),用0.01mol/L□□□□□□□□ 10.00mL,□□□□□□□□□□ 1mg?！酢酢?CTC)標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取金霉素 0.0100g(精確到 0.0001g),溶于超□□□□ 10.00mL,□□□□□□□□□□ 1mg?！酢酢酢酢酢?1000單位/mg□□□□□ 4］以下保存，可使用一周?！酢酢酢酢酰骸酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢酢?1.00mL,□□□□□□□□2.00mL,置于 10mL□□□□,□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□環(huán)素各 0.1mg,金霉素 0.2mg,臨用時(shí)現(xiàn)配?！酢酢酢酢酢酢酢酰?分別稱取7□□□□□□ □□5mm),每份5.000精口到［ 0.01g),置于50mL□□□□□, □□□□□□□□□□ 0、25、50、100、150、200、250P L(含土霉素、四環(huán)素各為 0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0pg；含金霉素 0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0p g),加入 5%高氯酸 25.0mL,□□□□□□□□ 10min,□□□□□□□,以 2000r/min離心 3min,取上清液經(jīng)0.45pm□□□□,□□□ 20PL□□,□□□□□□□□□□□□標(biāo)，抗生素含量為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線，并計(jì)算回收率。□□□：□： ODS-C18（5Pm）6.2mm115cm檢測(cè)波長(zhǎng)：355nm柱溫： 40℃流速：0.8mL/min進(jìn)樣量： 20PL流動(dòng)相：乙腈+0.01mol/L磷酸二氫鈉溶液（用 30%硝酸溶液調(diào)節(jié)PH2.5）=23+77，使用前用超聲波脫氣 10min。豬肉中氯霉素殘留量的測(cè)定氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精確稱取 0.010g氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，置于 100mL容量瓶,□□□□□□□□□□□,□□□□□□□□□ 0.10mg/mL,置于冰箱中保存，有效期 3個(gè)月?！酢酢酢酢酢酢酰骸酢酢酢?5.0mL儲(chǔ)備液于50mL□□□□,□□□□□□□□□□□□□ 10pg/mL,置于冰箱保存。有效期半個(gè)月。臨用前取此液用0.5mol/L高氯酸稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。提?。喝?00g試樣絞碎，稱取 20g（精確至 0.0lg）□□□□□□, 置于100mL□□□□□□,□□ 40mL□□□□,□□,□□□□ 30min,過(guò)濾，濾液□□□□□□□□□□□ 20mL□□□□□□□□,□□□□ 15min,過(guò)濾，□□□,□□□□ 20mL□□□□□□□□ 15min,過(guò)濾，濾液合并，全部濾液合并轉(zhuǎn)人濃縮瓶中。凈化： 將合并的濾液于 52℃-55℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至干。 準(zhǔn)確加入1.0mL0.5mol/L□□□□□□□□□□□□□□, 再加人1mL正己烷，振搖 1min,□□□□□□□ 5mL□□□,□□□□,□□□□□□,□□□ 2ml正己烷提取脂肪,再吸棄正己烷層,高氯酸溶液過(guò) 0.45Pm濾膜,濾液供高效液相色譜測(cè)定?！酢酢酢酢酢酢酢酢酰骸?0.5mol/L□□□□□□,□□□□□□□□□稀釋為 10P g/mL、5Pg/mL、1p g/mL、0.5pg/mL、0.1p g/mL、0.01pg/mL和0Pg/mL□□□□□□, 20pL□□,□□□□□□□□,□□□□□□□□□繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回收率的測(cè)定：提取前三份肉樣中分別加入 200PL100Pg/mL、200PL10Pg/mL和200PL1Pg/mL□□□□□□□□□, □□□□□□□□□□ 20Pg、2Pg和0.2Pg?！酢酢酰骸酢酢酰?ODS-C18（5Pm）6.2mmD15cm檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm柱溫： 40℃流速：0.8mL/min進(jìn)樣量： 20PL流動(dòng)相：甲醇 +水=45+553.2.3條件優(yōu)化，雞肉中四環(huán)素殘留的測(cè)定四環(huán)素□TC□標(biāo)準(zhǔn)溶液： □□□□□ 0.0100g精確到 0.0001g),用0.01mol/LTOC\o"1-5"\h\z□□□□□□□□□ 10.00mL,此溶液每毫升含四環(huán)素 1mg。四環(huán)素工作液：將四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液用超純水稀釋為 50、40、30、20、10、5pg/mL?！酢酢酢酰骸酢酢酢?6□□□□□□□□ 5mm),每份 5.00g□□□□± 0.01g),置于 50mL□□□□□,□□□□□□□□□□□□□□□□□□ 0.5mL□□□□□□□□ 0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0pg),用玻璃棒混口，放入 41冰箱放置過(guò)夜。加入超純水 23.0mL,移至 50mL□□□□□,□□□棒使肉樣均勻。放到磁力攪拌器上攪拌, 緩慢加入 1mL71%的高氯酸, 攪拌30min(錐形燒瓶放入帶冰水的大燒杯中,冰鎮(zhèn),降低其降解速率) 。30min后將樣品移入到離心管中,分兩次加入 6mL5%高氯酸溶液清洗錐形燒瓶后,用冷凍離心機(jī)4℃,以 2000r/min離心 3min,取上清液經(jīng) 0.45pm□□□□,□□□ 20PL進(jìn)樣,記錄峰高。以峰面積為縱坐標(biāo),抗生素含量為橫坐標(biāo),繪制工作曲線?！酢酢酢酢酢酢酢酢酢酰骸酢酢酢?2□□□□□□□,□□ 5.0000g(精口到［0.0001g),置于 50mL□□□□□,□□□□□□□□□□□□□□□法相同。取溶液 20pL進(jìn)樣,記錄峰高,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,計(jì)算樣品中四環(huán)素的含量?！酢酢酰骸酰?ODS-C18(5pm)6.2mm115cmTOC\o"1-5"\h\z檢測(cè)波長(zhǎng)： 280nm柱溫： 40℃流速： 0.8mL/min\o"CurrentDocument"進(jìn)樣量： 20pL流動(dòng)相：乙腈 +0.01mol/L磷酸二氫鈉溶液(用 30%硝酸溶液調(diào)節(jié)PH2.5)=23+77,使用前用超聲波脫氣 10min?！酢酢酢酢酢酢酢酢?LOD),定量限( LOQ)□□□□□□□□□□□□□：□□□□ 0.0100g1精確到 0.0001g),□□□□□□□)□解并定容 10.00mL,此溶液每毫升含磺胺 1mg。□□□□□□ SM2)□□□□：□□□□□□□□ 0.0100g□精確到0.0001g,用甲醇(色譜純)溶解并定容 10.00mL,此溶液每毫升含磺胺二甲嘧啶1mg。□□□□□ SMZ)標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取磺胺甲惡唑 0.0100g1精確到 0.0001g),□□□□□□)□□□□□ 10.00mL,此溶液每毫升含磺胺甲惡唑 1mg?！酢酢?FPA)標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取氟哌酸 0.0100g□□□□ 0.0001g),用甲醇□□□)□□□□□ 10.00mL,此溶液每毫升含氟哌酸 1mg。結(jié)合土霉素、 四環(huán)素、 金霉素和氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液, 各用超純水稀釋成不同濃度的溶液，20pL□□□□,□□□□□□□□□□□□□□□雞肉中八種抗生素含量的測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：取土霉素、四環(huán)素、磺胺、磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶和氟2.00mL,置于 10mL2.00mL,置于 10mL容量瓶中，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。此溶液每毫升含土霉素、四環(huán)素、磺胺、磺胺甲惡唑、□□□□□□□□□□□□□□□ 0.1mg,□□□□□□□□ 0.2mg,臨時(shí)用現(xiàn)配?！酢酢酢酰?□□□□□□□□□□□□□□ 50、40、30、20、10、5Pg/mL。□□□□□□□□： 分別稱取6□□□□□□ □□5mm),每份5.000精口到［0.01g),置于 50mL□□□□□,□□□□□□□□□□□□□□□□0.5mLa含土霉素、四環(huán)素、磺胺、磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶和氟哌酸分別為0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0p g； □□□□□□□□□□□ 0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0pg),用玻璃棒混勻，放入 41冰箱放置一夜。加入超純水23.0mL,移至 50mL□□□□□,□□□□□□□□□□□□□□□□□□攪拌，緩慢加入 1mL71%的高氯酸， 攪拌 30mH錐形燒瓶放入帶冰水的大燒杯TOC\o"1-5"\h\z中,冰鎮(zhèn), 降低其降解速率) 。30min后將樣品移入到離心管中, 分兩次加入 6mL5%高氯酸溶液清洗錐形燒瓶后,用冷凍離心機(jī) 4℃,以2000r/min離心 3min,取上清液經(jīng) 0.45Pm濾膜過(guò)濾,取溶液 20PL進(jìn)樣,記錄峰高。以峰面積為縱坐標(biāo),抗生素含量為橫坐標(biāo),繪制工作曲線,并計(jì)算回收率?！酢酢酰骸酰?ODS-C18(5Pm)6.2mm115cm\o"CurrentDocument"檢測(cè)波長(zhǎng)： 280nm柱溫： 40℃流速： 0.8mL/min\o"CurrentDocument"進(jìn)樣量： 20PL流動(dòng)相：乙腈 +0.01mol/L磷酸二氫鈉溶液(用 30%硝酸溶液調(diào)節(jié)PH2.5)=23+77,使用前用超聲波脫氣 10min。固相萃取小柱的凈化□1)活化 ——□□□□□ 3-5mL□□□□□□) ,□□□□□□□□,加入3-5mL5%高氯酸溶液,除去小柱內(nèi)的雜質(zhì)并創(chuàng)造一定的溶劑環(huán)境。高氯酸溶□□□□□,□□□□□ 1-2mm溶液。(2)上樣——轉(zhuǎn)移 4mL樣品上清液入口并使組分保留在柱上。 □□□□□□□□,□1ml/min□□,□□□□□ 5ml/min)3)淋洗 用3-5mL5%高氯酸溶液清洗,完全抽干,最大程度除去干擾物。4)洗脫——用1mL甲□□□□□)將被□□□□□□□□□□□4實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論豬肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留量的測(cè)定將土霉素、 四環(huán)素和金霉素溶液?jiǎn)为?dú)進(jìn)樣, 確定三種抗生素在 355nm波長(zhǎng)下的出峰時(shí)間,色譜條件如 2.2.1：土霉素- 6.152min；四環(huán)素- 7.462min；金霉素- 14.978min。以排酸通脊 (購(gòu)自華潤(rùn)萬(wàn)家) 的豬肉作為樣品, 按照2.2.1的方法進(jìn)行處理,測(cè)得土霉素、四環(huán)素和金霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：土霉素：

含量pg/mL02.551020樣品15峰面積023835085102272036317990表3.1.1土霉素加標(biāo)量及峰面積值上毒素"力線圖3.1.1土霉素標(biāo)而線㈠，“小皿公式為：y=1021.x-52.72；R2=0.999將待測(cè)樣品代入公式中，求得回收率為： 117.7%。在 80%至120%之間，符合標(biāo)準(zhǔn)。四環(huán)素：含量pg/mL02.551020樣品15峰面積01615418277541529713435表3.1.2四環(huán)素加標(biāo)量及峰面積值公式為：y=768.2x+7.575；R2=0.998116.5%。在116.5%。在80%至120%之間，符合標(biāo)準(zhǔn)。金霉素：含量pg/mL05102040樣品30峰面積07321389255848994362表3.1.3金霉素加標(biāo)量及峰面積值圖3.1.3金霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為： y=121x+100.6；R2=0.998將待測(cè)樣品代入公式中，求得回收率為： 117.4%。在80%至120%之間，符合標(biāo)準(zhǔn)?？瞻讟悠飞V圖如下：加標(biāo)待測(cè)樣品色譜圖如下：

1.751.501.25二1.00二0.75二0.50二0.251.751.501.25二1.00二0.75二0.50二0.25二0.00二12.5 15.0min15Pg/mL,四環(huán)素15Pg/mL,金霉素30Pg/mL)時(shí)間17min15Pg/mL,金霉素30Pg/mL)時(shí)間17min4.2豬肉中氯霉素殘留量的測(cè)定將氯霉素溶液?jiǎn)为?dú)進(jìn)樣,確定其出峰時(shí)間為以排酸通脊（購(gòu)自華潤(rùn)萬(wàn)家）測(cè)得氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：12.706min,□□□□□ 2.2.2。按照2.2.2的方法進(jìn)行處理,含量pg/mL00.010.10.515樣品1010.9峰面積0605583628742584362837184970554901943719的豬肉作為樣品,iw表3.2.1氯霉素加標(biāo)量及峰面積值圖3.2.1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為：y=56712x+411.6；R2=1將3份樣品代入公式中, 求得回收率分別為： 87.6%,85.7%和84.8%。在80%至120%之間,符合標(biāo)準(zhǔn)?？瞻讟悠飞V圖如下：0.0 2.5 5.07.5 10.0 12.5minmV30-25-20-15-10-時(shí)間時(shí)間15min圖3.2.2未加標(biāo)樣品色譜圖（氯霉素）加標(biāo)待測(cè)樣品色譜圖如下：70二60二50二40二30二2H10二0;0.0 2.5 5.00.0 2.5 5.03.2.3加標(biāo)待測(cè)樣品色譜圖（氯霉素7.5 10.0 12.5 min10pg/mL) 時(shí)間15min12.510.07.55.02.50.07.5 10.0 12.5 min1pg/mL) 時(shí)間15min0.0 2.5 5.0圖3.2.4加標(biāo)待測(cè)樣品色譜圖（氯霉素mV -]□□ ACh1:280nl25二20一7.5 10.0 12.5 20一7.5 10.0 12.5 min0.0 2.5 5.03.2.5加標(biāo)待測(cè)樣品色譜圖（氯霉素0.9pg/mL)時(shí)間15min4.3條件優(yōu)化，雞肉中四環(huán)素殘留的測(cè)定在測(cè)定肉類中四環(huán)素族抗生素的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)含抗生素的樣品在放置時(shí)比較容在測(cè)定肉類中四環(huán)素族抗生素的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)含抗生素的樣品在放置時(shí)比較容易降解，長(zhǎng)時(shí)間放置會(huì)使抗生素含量降低很多， 回收率也會(huì)有相應(yīng)的降低。 分析其原因可能是由于肉樣添加高氯酸溶液后，在酸性環(huán)境下會(huì)使抗生素較快降解。于是優(yōu)化了提取的條件， 增加了抗生素與肉樣混合的時(shí)間，量保持在低溫中操作，以減少抗生素物質(zhì)的降解。并且檢測(cè)出四環(huán)素含量在到1p易降解，長(zhǎng)時(shí)間放置會(huì)使抗生素含量降低很多， 回收率也會(huì)有相應(yīng)的降低。 分析其原因可能是由于肉樣添加高氯酸溶液后，在酸性環(huán)境下會(huì)使抗生素較快降解。于是優(yōu)化了提取的條件， 增加了抗生素與肉樣混合的時(shí)間，量保持在低溫中操作，以減少抗生素物質(zhì)的降解。并且檢測(cè)出四環(huán)素含量在到1pg/g的低濃度未知雞肉樣品，使該方法的精確性有了一定的提高。方法步驟如2.2.3。以華都雞胸（購(gòu)自超市發(fā)）的雞肉作為樣品，按照在提取過(guò)程中盡0.12.2.3的方法進(jìn)行處理，含量pg/g00.20.30.40.5未知樣品1未知樣品2峰面積0670106915381894928931測(cè)得四環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：表3.3.1四環(huán)素加標(biāo)量及峰面積值公式為：公式為：圖3.3.1四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線y=3844.x-42.32；R2=0.9960.25pg/g0.25pg/g和0.25pg/g,平均為 0.250.25pg/g。將2份樣品代入公式，求得其濃度分別為：pg/g。則未知雞肉樣品的四環(huán)素含量為空白樣品色譜圖如下：待測(cè)樣品色譜圖如下：0.50.4二0.3二0.00.2二0.1二0.50.4二0.3二0.00.2二0.1二0.0 2.55.07.5min圖3.3.3待測(cè)樣品1色譜圖（四環(huán)素）時(shí)間 10min0.5二0.4二0.30.20.10.00.0 2.5圖3.3.3待測(cè)樣品5.02色譜圖（四環(huán)素）時(shí)間7.5 min10min八種抗生素檢出口( LOD),定量限( LOQ)和線性范圍的確定檢出口□LOD)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□當(dāng)?shù)臐舛然蛸|(zhì)量流量定為 HPLC法的檢出限。也就是信噪比為 3：1的時(shí)候的樣品濃度。定量限□LOQ)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□當(dāng)?shù)臐舛然蛸|(zhì)量流量定為 HPLC法的定量限。也就是信噪比為 10：1的時(shí)候的樣品濃度。通過(guò)測(cè)定低濃度的八種抗生素溶液， 觀察其信噪比，確定其檢出限和定量限；測(cè)定線性范圍。如下表：磺胺氟哌酸土霉素四環(huán)素磺口二甲嘧啶金霉素磺胺甲惡唑氯霉素出口時(shí)間□min)4.85.36.17.51015.518.525LOD(ng/mL)10.5110101003030LOQ(ng/mL)31.5330303009090線性范□□pg/mL)0.001-2000.0005-1500.001-4000.01-6000.01-2500.1-6000.03-5000.03-500表3.4.1□□□□□□□□□□□ LOD,LOQ□□□□□雞肉中八種抗生素含量的測(cè)定以華都雞胸(購(gòu)自超市發(fā))的雞肉作為樣品，按照 2.2.5的方法進(jìn)行處理，測(cè)得土霉素、四環(huán)素、金霉素、氯霉素、磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶和氟哌酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：氟哌酸：含量Pg/g00.51235樣品4峰面積7811194093015052381728631153998157表3.5.1氟哌酸加標(biāo)量及峰面積值

公式：y=21443x+8569.；R2=0.999將待測(cè)樣品代入公式中，求得回收率為： 104.5%。在80%至120%之間，符合標(biāo)準(zhǔn)。土霉素：含量Mg/g00.51235樣品4峰面積28254947678112407171432669922096表3.5.2土霉素加標(biāo)量及峰面積值公式：y=4840x+2523.；R2=0.998將待測(cè)樣品代入公式中，求得回收率為： 101.1%。在80%至120%之間，符合標(biāo)準(zhǔn)。四環(huán)素：含量Mg/g00.51235樣品4峰面積21493800651211891166102704521579表3.5.3四環(huán)素加標(biāo)量及峰面積值

公式：y=5050x+1655.；R2=0.998將待測(cè)樣品代入公式中，求得回收率為： 98.6%。在 80%至120%之間，符合標(biāo)準(zhǔn)?；前范奏奏ぃ汉縈g/g00.51235樣品4峰面積184170751081220365288764583840140表3.5.4磺胺二甲嘧啶加標(biāo)量及峰面積值公式：y=8766.x+2332.；R2=0.999將待測(cè)樣品代入公式中，求得回收率為： 107.8%。在80%至120%之間，符合標(biāo)準(zhǔn)。金霉素：含量Mg/g0124610樣品8峰面積01015214245876456109338870表3.5.5金霉素加標(biāo)量及峰面積值圖3.5.5金霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y=1095x-8.518；R2=0.999將待測(cè)樣品代入公式中，求得回收率為： 101.3%。在 80%至120%之間，符合標(biāo)準(zhǔn)?；前芳讗哼颍汉縈g/g00.51235樣品4峰面積74549691007819316292644741739373表3.5.6磺胺甲惡唑加標(biāo)量及峰面積值公式：y=9403x+609.1；R2=0.999103.1%。在103.1%。在80%至120%之間，符合標(biāo)準(zhǔn)。氯霉素：含量Mg/g0124610樣品8峰面積057041192922892329495389344820表3.5.7氯霉素加標(biāo)量及峰面積值0.5一0.00.5一0.0公式：y=5368.x+649.5；R2=0.999將待測(cè)樣品代入公式中，求得回收率為： 102.9%。在80%至120%之間，符合標(biāo)準(zhǔn)?？瞻讟悠飞V圖如下：mV檢測(cè)器 ACh1:280nm2.5-2.0-￡1.0一0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0min圖3.5.8未加標(biāo)樣品色譜圖（從左至右出峰物質(zhì)為：氟哌酸、土霉素、四環(huán)素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑）樣品色譜圖如下：

0.0 5.0 10.015.0 20.0 25.0min050544500.0 5.0 10.015.0 20.0 25.0min050544503.3..5.0.5.0.5.02.2.1.1.0.0.4Pg/g、金霉素

4Pg/g、金霉素

8Pg/g）4pg/g、土霉8Pg/g、磺胺甲惡唑4素4Pg/g、四環(huán)素 4Pg/g、磺胺二甲嘧啶pg/g、氯霉素4.6固相萃取小柱的凈化由于磺胺的出峰時(shí)間與雜質(zhì)峰相重合， 本實(shí)驗(yàn)采用3種不同的固相萃取小柱去除干擾，以分離出磺胺。 3種固相萃取小柱分別為：號(hào)：SupelcleanTMLC-18SPE57054500mg;號(hào)：WatersSep-PakVac6ccC18-500mg;號(hào)：WatersOASISHLBCartridge□□□□□□□□□□□□ 4pg/g、氟哌酸 4pg/g、土霉素 4pg/g、四環(huán)素4pg/g□□□□□□□ 4pg/g、金霉素 8Pg/g□□□□□□ 4pg/g、氯霉素 8Pg/g）為例，分別驗(yàn)證了 3□□□□□□□□□□□□□ ,□□□□：

圖3.6.2過(guò)1號(hào)柱樣品色譜圖圖3.6.3過(guò)2號(hào)柱樣品色譜圖圖3.6.4過(guò)3號(hào)柱樣品色譜圖通過(guò)比較可以看出： 過(guò)柱后雜峰高度有所減少， 證明3種萃取小柱都有一定的萃取效果；并且1號(hào)萃取小柱萃取后目標(biāo)峰較 2號(hào)和3號(hào)高，證明1號(hào)固相萃取小柱□SupelcleanTMLC-18SPE57054500mg)□□□□□□□□ 但過(guò)3種小柱

后在磺胺峰處仍有雜質(zhì)峰干擾，都仍未分離出磺胺。實(shí)驗(yàn)還探究了固相萃取小柱能否再次利用。以1號(hào)固相萃取小柱□SupelcleanTMLC-18SPE57054500mg□□□：第一次萃取后色譜圖為：圖3.6.51號(hào)小柱第一次使用色譜圖用甲醇反復(fù)清洗后第二次萃取色譜圖為：圖3.6.61號(hào)小柱第二次使用色譜圖兩圖進(jìn)行比較，峰面積相差不大，即可以反復(fù)利用。□□□□□□□□□□□,□□□□□ GB/T5009.116-20031的基礎(chǔ)上優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)步驟，建立了同時(shí)測(cè)定畜禽肉中的土霉素、四環(huán)素、金霉素、氯霉素、磺胺、磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶和氟哌酸八種抗生素的方法。 實(shí)驗(yàn)中不僅確定了八種抗生素的出峰時(shí)間， 而且研究并測(cè)定了其檢出限、 定量限、線性范圍以及回收率?！酢酢酢?280nm和355nm□□□□□□□□□□□□□□□□□,□□無(wú)法檢出其濃度變化。 實(shí)驗(yàn)中研究了3種不同品牌與型號(hào)的固相萃取小柱來(lái)排除雜質(zhì)峰的干擾，效果不是很理想，雜質(zhì)峰仍不能去除， 所以磺胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線與回收率無(wú)法測(cè)定。除此之外，在氟哌酸，土霉素和四環(huán)素的吸收峰下也有雜質(zhì)峰的干擾，但不影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)算。參考文獻(xiàn)[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì) .GB/T5009.116-2003.畜、禽肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留量的測(cè)定(高效液相色譜法) .[2]中華人民共和國(guó)國(guó)家進(jìn)出口商品檢驗(yàn)局 .SN0215-93.出口禽肉中氯霉素殘留量檢驗(yàn)方法.[3]中華人民共和國(guó)商務(wù)部 .SB/T10386-2004.畜禽肉中氯霉素的測(cè)定 .LiH,KijakPJ,TurnipseedSB,CuiW.Analysisofveterinarydrugresiduesinshrimp:Amulti-classmethodbyliquidchromatographyquadrupoleiontrapmassspectrometry.JournalofChromatographyB,2006,836,22-38.MamaniMCV,ReyesFGR,RathS.Multiresiduedeterminationoftetracyclines,sulphonamidesandchloramphenicolinbovinemilkusingHPLC-DAD[J].FoodChemistry2009,117,545-552.[6]符明淳， 席會(huì)平，劉彥釗.乳、肉制品中抗生素殘留現(xiàn)狀及監(jiān)控對(duì)策 [J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2008,25(6):20-22.[7]徐冬梅，劉廣深，李青，常新 .高