生物化學分析鑒定方法第1頁/共47頁本章內(nèi)容概要及要求：第一節(jié)：蛋白質(zhì)的分析鑒定一、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)測定（一）蛋白質(zhì)含量測定（二）蛋白質(zhì)相對分子量及等電點測定（三）蛋白質(zhì)純度測定二、蛋白質(zhì)鑒定（一）蛋白質(zhì)免疫印跡（Western-Blotting）（二）蛋白質(zhì)序列分析（三）蛋白質(zhì)結(jié)晶三、同工酶測定四、酶學分析在臨床診斷上的應(yīng)用第五節(jié)酶活性測定最適條件的選擇第2頁/共47頁在蛋白質(zhì)分離純化過程中，需要對蛋白質(zhì)的含量和純度不斷進行檢測，通過優(yōu)化純化方法獲得高含量、高純度的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能分析及產(chǎn)品開發(fā)提供材料。為了鑒定某種微量蛋白質(zhì)在樣品中的存在，常采用蛋白質(zhì)免疫印跡的方法，利用抗原抗體的特異性來鑒定。此外，還可測定蛋白質(zhì)的氨基酸序列，對其生物學功能進行鑒定等。第3頁/共47頁一、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)測定（一）蛋白質(zhì)含量測定（1）凱氏定氮：是最經(jīng)典的蛋白質(zhì)含量測定方法。

氮素含量除16％，或乘6.25即為蛋白質(zhì)含量。適于較純，粗蛋白值偏高。

此法操作比較復(fù)雜，目前已不常用。（2）雙縮脲法：快速不需十分精確。原理：兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成紫紅色絡(luò)合物，540nm波長最大吸收，值大小與蛋白質(zhì)濃度成正比。含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物，能發(fā)生同樣的反應(yīng)，肽鍵的反應(yīng)，肽鍵越多顏色越深特點：受蛋白質(zhì)特異性影響小應(yīng)用：蛋白質(zhì)定量測定；測定蛋白質(zhì)水解程度，測定范圍在mg/mL作用（3）福林-酚法（Lowry）：多年被選為蛋白質(zhì)標準測定方法。原理：蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑形成絡(luò)合物后，蛋白質(zhì)中的酪氨酸，色氨酸及半胱氨酸會使磷鉬酸一磷鎢酸還原生產(chǎn)藍色物質(zhì)，在650nm最大吸收，與蛋白質(zhì)濃度成正比。特點：靈敏度比雙縮脲法提高10倍左右，缺點是試劑的配制較為困難，費時間較長，很多物質(zhì)對此法有干擾，比較適合于較純蛋白的含量測定。第4頁/共47頁（一）蛋白質(zhì)含量測定（4）紫外吸收法：此法簡便快速。

通過測定樣品的紫外吸收值，根據(jù)經(jīng)驗公式或標準曲線也可以測定蛋白質(zhì)含量。此法測定簡單，而且不破壞樣品，樣品測定后可以再利用，缺點是樣品中的核酸，高濃度緩沖液等具有紫外吸收的物質(zhì)會干擾測定，引起實驗誤差。A、280nm和260nm的吸收差法：

蛋白質(zhì)在280nm波長有最大吸收，而核酸在260nm波長有最大吸收，對于較粗的蛋白質(zhì)樣品，可以利用280nm及260nm吸收差，用下列經(jīng)驗公式計算蛋白質(zhì)濃度：

蛋白質(zhì)濃度(mg／mL)＝1.45A280nm－0.74A260nmB、215nm和225nm的吸收差法：

蛋白質(zhì)的肽鍵在230nm波長以下有強吸收。其吸收值與蛋白質(zhì)濃度成正比。對稀溶液中蛋白質(zhì)濃度的測定，可用下列經(jīng)驗公式計算蛋白質(zhì)濃度：

蛋白質(zhì)濃度(mg／mL)＝0.144(A215nm一A225nm)該法雖然靈敏度較高，但是干擾物質(zhì)較多。第5頁/共47頁

酪氨酸的max＝275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的max＝257nm，257=2.0x102;色氨酸的max＝280nm，280=5.6x103;光吸收：構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠紫外區(qū)(<220nm)均有光吸收。

在近紫外區(qū)(220-300nm)只有Ｗ、Ｆ和Ｙ有吸收光的能力。第6頁/共47頁（一）蛋白質(zhì)含量測定（5）考馬斯亮藍染色法（Bradford）：目前應(yīng)用最廣。原理：考馬斯亮藍G-250在酸性溶液中為棕紅色，最大光吸收在488nm，當它與蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合后，變?yōu)樗{色，在595nm有最大吸收，大小與蛋白質(zhì)濃度成正比。特點：此法測定簡單，只要將蛋白質(zhì)樣品加到染料試劑中，即可進行比色測定。其靈敏度與福林-酚法相當，測定濃度范圍在0.01～1.0mg/mL。高濃度緩沖液、尿素、甘油、蔗糖、硫酸銨等對測定有干擾。應(yīng)用：該方法是目前應(yīng)用最廣的蛋白質(zhì)測定方法之一。（6）膠體金測定法：是靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定方法。

測定濃度范圍為ng/mL水平。膠體金本身呈洋紅色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，缺點是成本較高。第7頁/共47頁蛋白質(zhì)理化性質(zhì)測定（二）蛋白質(zhì)相對分子量及等電點測定分子量目前常用：1、分子篩層析法：可以測定活性多亞基蛋白質(zhì)的相對分子量。2、聚丙烯酰胺凝膠電泳：也可測定活性多亞基蛋白的相對分子量，但由于蛋白質(zhì)的遷移率還受到分子形狀、所帶電荷等的影響，因此測定的分子量不夠準確。3、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：測定變性蛋白質(zhì)中單亞基相對分子量的最有效最常用的方法。4、此外，還可以根據(jù)蛋白質(zhì)特殊元素組成計算法、氨基酸序列推導(dǎo)法、滲透壓法、沉降法、質(zhì)譜法等。蛋白質(zhì)等電點：等電聚焦電泳法－－主要方法，通過等電點沉淀可以測定蛋白質(zhì)等電點的大致范圍，通過蛋白質(zhì)氨基酸序列以可直接預(yù)測蛋白質(zhì)的等電點。生物信息法：http://www.expasy.ch/第8頁/共47頁（一）蛋白質(zhì)含量測定（二）蛋白質(zhì)相對分子量及等電點測定（三）蛋白質(zhì)純度測定1、色譜法：如HPLC

如果制備蛋白酶，需要利用的是蛋白酶的活性，只要其中的雜質(zhì)不影響酶的活性即可，此時可以利用柱層析表示其純度，在特定條件下，層析圖譜只有一個或少數(shù)幾個洗脫峰，也就是達到了色譜純，可以滿足常規(guī)的酶活分析等。如果通過結(jié)晶與再結(jié)晶的方法純化蛋白質(zhì)，則得到的蛋白質(zhì)則為結(jié)晶純，獲得的晶體可用于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析。2、SDS法：

通常情況下，蛋白質(zhì)的純度采用SDS法。凝膠經(jīng)過染色脫色后，用目標蛋白質(zhì)條帶占整個泳道蛋白條帶的百分比來表示目標蛋白的純度。第9頁/共47頁二、蛋白質(zhì)鑒定為了研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，需要對蛋白質(zhì)進行鑒定。蛋白質(zhì)鑒定的方法有多種，比如成份測定（氨基酸組成及其含量），序列測定理化特性分析（蛋白質(zhì)分子量，等電點，密度，變性與復(fù)性，結(jié)晶等）、生物活性及功能測定（比如酶活性分析，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行突變回復(fù)等），對于一個蛋白質(zhì)的鑒定，往往需要上述多種方法共同使用，相互印證，才能最終證明一個蛋白質(zhì)是什么。序列測定：可以一步確定某一個蛋白，但蛋白質(zhì)序列測定需要高純度的蛋白，測序代價極高，因此其應(yīng)用受到了較大的限制。免疫活性分析（蛋白質(zhì)免疫印跡）：鑒定一個蛋白質(zhì)，不僅彌補了傳統(tǒng)鑒定方法需要多方印證的繁瑣，而且代價相比于蛋白質(zhì)測序要低的多，是目前使用最廣泛的蛋白質(zhì)鑒定方法之一。第10頁/共47頁蛋白質(zhì)鑒定（一）蛋白質(zhì)免疫印跡（Western-Blotting）（二）蛋白質(zhì)序列分析（三）蛋白質(zhì)結(jié)晶第11頁/共47頁蛋白質(zhì)鑒定（一）蛋白質(zhì)免疫印跡（Western-Blotting）28/151/re1/mei/html/jbzs/jb_index_elisa.htm

免疫印跡（westernblotting）是在蛋白質(zhì)電泳分離和抗原抗體檢測的基礎(chǔ)上發(fā)展起來一項檢測蛋白質(zhì)的技術(shù)。它將SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨力與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合。

第12頁/共47頁（一）蛋白質(zhì)免疫印跡（Western-Blotting）典型的印跡實驗包括三個步驟：

①蛋白質(zhì)的電泳分離

②將電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固體膜上，用非特異性，非反應(yīng)活性分子封閉固體膜上未吸附蛋白質(zhì)區(qū)域

③免疫學檢測。免疫印跡克服了聚丙烯酰胺凝膠電泳后直接在凝膠上進行免疫學分析的弊端，極大地提高了其利用率、分辨率和靈敏度，使其成為使用最廣泛的免疫化學方法之一。第13頁/共47頁（一）蛋白質(zhì)免疫印跡（Western-Blotting）典型的印跡實驗包括三個步驟具體解析：

第一階段為SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）?？乖鹊鞍讟悠方?jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯酰酰凝膠中從陰極向陽極泳動，分子量越小，泳動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見（只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶）。

第二階段為電轉(zhuǎn)移。將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1～2A），通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見。

第三階段為酶免疫定位。將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜（相當于包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3，3，—二氨基聯(lián)苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈藍紫色）。陽性反應(yīng)的條帶清晰可辨，并可根據(jù)SDS時加入的分子量標準，確定各組分的分子量。

第14頁/共47頁蛋白質(zhì)鑒定（一）蛋白質(zhì)免疫印跡（Western-Blotting）（二）蛋白質(zhì)序列分析（三）蛋白質(zhì)結(jié)晶第15頁/共47頁三、蛋白質(zhì)組研究的相關(guān)技術(shù)（一）研究細胞或組織內(nèi)蛋白質(zhì)表達模式的技術(shù)：

2-D電泳1.1975年，PatrickOˊFarrel發(fā)明了二維凝膠電泳。2.操作（1）等電聚焦。（2）平衡膠條。（3）第二相SDS。第16頁/共47頁第17頁/共47頁第18頁/共47頁3.2-D膠上蛋白質(zhì)鑒定（1）早期Westernblot鑒定（2）Edman降解法鑒定（3）肽質(zhì)量指紋（peptide-massfingerprinting）技術(shù)鑒定（4）蛋白質(zhì)組信息學第19頁/共47頁2D電泳→

Mass定序分析第20頁/共47頁（三）蛋白質(zhì)序列測定肽序列分析的基本步驟：（1）分析已純化蛋白質(zhì)氨基酸殘基的組成。（2）測定頭尾氨基酸。（3）把肽鏈水解成片段，分別進行分析，得到肽圖。（4）Edman降解第21頁/共47頁

蛋白質(zhì)測序發(fā)展簡史1.英國科學家Sanger測序（20世紀50年代）。2.建立色譜技術(shù)和定量氨基酸分析技術(shù)（20世紀50年代）。3.Edman降解（20世紀70年代出現(xiàn)）。

儀器自動化：液相自動測序儀和固相蛋白質(zhì)自動測序儀。進入20世紀80年代，氣相測序技術(shù)出現(xiàn)并實現(xiàn)了儀器自動化。靈敏度顯著提高，樣品量只需10pmol以下，一次連續(xù)測定的順序甚至可超過80個殘基。樣品處理遠比固相方法簡單和操作方便。

4.20世紀70年代，華裔學者張瑞耀提出的有色Edman試劑——DABITC，使手工測序技術(shù)更加靈敏可靠。第22頁/共47頁5.對2-D膠上的點進行測序：將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，然后將膜片放入測序儀的反應(yīng)室中進行Edman降解。6.毛細管電泳技術(shù)（20世紀90年代發(fā)展起來的微量分析技術(shù)）的采用，是蛋白質(zhì)N端微量順序測定方法學一個引人注目的發(fā)展。

其靈敏度比HPLC高兩個數(shù)量級?？稍?0fmol的水平檢測氨基酸。微型測序儀與毛細管電泳聯(lián)用的微量蛋白質(zhì)測序方法已經(jīng)呈現(xiàn)很好的前景。第23頁/共47頁7.蛋白質(zhì)C端測序：C端測序的重要性：為PCR擴增出某一蛋白的完整基因提供合成C端引物的重要依據(jù)；以及為基因表達的蛋白質(zhì)的鑒定提供關(guān)鍵的證據(jù)等。（1）最成功的方法是在Schlack早年提出的異硫氰酸法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。（2）直到20世紀90年代初由于發(fā)展出一些新的偶聯(lián)和裂解試劑，配合用HPLC對乙酰內(nèi)硫脲氨基酸（TH）的鑒定，該方法才得以較快地發(fā)展。目前已有自動化C端測序儀，能常規(guī)地進行6-8個殘基的C端順序測定。第24頁/共47頁8.質(zhì)譜法用于蛋白質(zhì)順序測定：（1）必要性：DNA順序測定解決不了翻譯后加工所導(dǎo)致的氨基酸殘基的修飾問題，Edman降解不能解決N端封閉肽的測序問題，而質(zhì)譜法能使上述問題迎刃而解。（2）20世紀80年代初出現(xiàn)快原子轟擊質(zhì)譜（FAB質(zhì)譜）能準確確定的分子量達到數(shù)千。相繼發(fā)展的串行質(zhì)譜可以把FAB得到的分子離子進行再一次惰性原子轟擊，使肽鏈在不同部位斷裂從而得到一組片段的質(zhì)譜信息，使多肽順序測定得以實現(xiàn)。第25頁/共47頁（3）20世紀80年代末出現(xiàn)了電噴霧質(zhì)譜和基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜。電噴霧質(zhì)譜測定分子量數(shù)萬的蛋白質(zhì)準確度可達萬分之一，主要優(yōu)點是可與HPLC儀實現(xiàn)液質(zhì)聯(lián)用，因而能使一個蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物在得到HPLC肽譜的同時得到一張精確的肽質(zhì)量譜。飛行時間質(zhì)譜能對分子量達30萬道爾頓的分子進行準確質(zhì)譜分析。誤差率可精確到十萬分之一，因而該技術(shù)對蛋白質(zhì)化學結(jié)構(gòu)分析已呈現(xiàn)極大應(yīng)用前景。該技術(shù)結(jié)合羧肽酶或氨肽酶的應(yīng)用可成功地進行蛋白質(zhì)C端與N端的順序測定，該方法一個顯著的優(yōu)點是用樣品量極微（1-2pmol），且非?？焖?，每次質(zhì)譜分析只需數(shù)分鐘。

第26頁/共47頁9.質(zhì)譜技術(shù)不能完全取代Edman降解與其他蛋白質(zhì)分析方法。通常是聯(lián)合運用這些技術(shù)。10.蛋白質(zhì)測序展望：（1）N端測序儀在靈敏度上還需提高。（2）C端測序技術(shù)需要更新型的偶聯(lián)試劑和更有效的裂解方法。（3）質(zhì)譜技術(shù)將有令人刮目相看的作為。（4）一些新的分析技術(shù)很可能進入蛋白質(zhì)順序分析領(lǐng)域，如多維核磁共振方法。第27頁/共47頁蛋白質(zhì)組：一種細胞、組織或完整的生物體所擁有的全套的蛋白質(zhì)基因組基本是固定不變的,蛋白質(zhì)組卻是動態(tài)的,具有時空性和可調(diào)節(jié)性,能反映出特定基因的表達時間、表達量以及蛋白質(zhì)翻譯后的加工修飾和亞細胞分布等。三大基本支撐技術(shù)：雙向電泳技術(shù)(2-DE)計算機成像數(shù)分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)以質(zhì)譜技術(shù)蛋白質(zhì)組的研究：是從整體水平上研究細胞或有機體內(nèi)蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律，包括細胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)的分離、蛋白質(zhì)表達模式的識別、蛋白質(zhì)的鑒定、蛋白質(zhì)翻譯后修飾的分析及蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建。

基因組：是指一個細胞單倍型(haploidy)所含的全部遺傳信息,即DNA或RNA編碼的遺傳信息.蛋白質(zhì)組則是指一個細胞一生中表達的蛋白質(zhì)總和

蛋白質(zhì)組學：是指研究細胞或機體全部蛋白質(zhì)的表達及其活動方式(包括翻譯后修飾、轉(zhuǎn)運定位、結(jié)構(gòu)變化、蛋白質(zhì)間及其他相互作用等)第28頁/共47頁一、雙向電泳

第29頁/共47頁二、質(zhì)譜技術(shù)

第30頁/共47頁（一）概念：

質(zhì)譜（MassSpectrometry,MS）是帶電原子、分子或分子碎片按質(zhì)荷比（或質(zhì)量）的大小順序排列的圖譜。質(zhì)譜儀是一類能使物質(zhì)粒子高化成離子并通過適當?shù)碾妶觥⒋艌鰧⑺鼈儼纯臻g位置、時間先后或者軌道穩(wěn)定與否實現(xiàn)質(zhì)荷比分離，并檢測強度后進行物質(zhì)分析的儀器。質(zhì)譜儀主要由分析系統(tǒng)、電學系統(tǒng)和真空系統(tǒng)組成。生物質(zhì)譜技術(shù)

電噴霧質(zhì)譜技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)是誕生于80年代末期的兩項軌電離技術(shù)。這兩項技術(shù)的出現(xiàn)使傳統(tǒng)的主要用于小分子物質(zhì)研究的質(zhì)譜技術(shù)發(fā)生了革命性的變革。它們具有高靈敏度和高質(zhì)量檢測范圍，使得在pmol（10-12甚至fmol（10-15的水平上準確地分析分子量高達幾萬到幾十萬的生物大分子成為可能，從而使質(zhì)譜技術(shù)真正走入了生命科學的研究領(lǐng)域，并得到迅速的發(fā)展。以下主要介紹與生物醫(yī)學有關(guān)的幾項質(zhì)譜技術(shù)。第31頁/共47頁（二）分類1、電噴霧質(zhì)譜技術(shù)

（ElectrosprayIonizsationMassSpectrometry,ESI-MS）

電噴霧質(zhì)譜的優(yōu)勢就是它可以方便地與多種分離技術(shù)聯(lián)合使用，如液一質(zhì)聯(lián)用（LC－MS）是將液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合而達到檢測大分子物質(zhì)的目的。2、基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)

基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)（MatriXAssistedLaserDesorption/Ionization,MALDI）的基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，當用激光照射晶體時，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使基質(zhì)和分析物膨脹并進入氣相。MALDAI所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子，因而質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有—一對應(yīng)關(guān)系。

MALDI產(chǎn)生的離子常用飛行時間（Time-of-Flight,TOF）檢測器來檢測，理論上講，只要飛行管的長度足夠，TOF檢測器可檢測分子的質(zhì)量數(shù)是沒有上限的，因此MALDI-TOF質(zhì)譜很適合對蛋白質(zhì)、多肽、核酸和多糖等生物大分子的研究。3、快原子轟擊質(zhì)譜技術(shù)

（FastAtomBomebard-mentMassSpectrometry,FABMS）。4、同位素質(zhì)譜

第32頁/共47頁（三）生物質(zhì)譜應(yīng)用隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷改進和完善，質(zhì)譜的應(yīng)用范圍已擴展到生命科學研究的許多領(lǐng)域，特別是質(zhì)譜在蛋白質(zhì)、醫(yī)學檢測、藥物成分分析及核酸等領(lǐng)域的應(yīng)用，不僅為生命科學研究提供了新方法，同時也促進了質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展。第33頁/共47頁Ａ、應(yīng)用于蛋白質(zhì)：1、蛋白質(zhì)分子量的測定

MALI－MS技術(shù)以其極高的靈敏度、精確度很快在生物醫(yī)學領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，特別是在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用，至今已被分析的蛋白質(zhì)已有數(shù)百種之多，不僅可測定各種親水性、疏水性及糖蛋白等的分子量，還可直接用來測定蛋白質(zhì)混合物的分子量，也能被用來測定經(jīng)酶等降解后的混合物，以確定多肽的氨基酸序列?？梢哉J為這是蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域的一項重大突破。2、蛋白質(zhì)組研究

蛋白質(zhì)組是指一個基因組、一個細胞或組織所表達的全部蛋白質(zhì)成分。蛋白質(zhì)組的研究是從整體水平上研究細胞或有機體內(nèi)蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律，包括細胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)的分離、蛋白質(zhì)表達模式的識別、蛋白質(zhì)的鑒定、蛋白質(zhì)翻譯后修飾的分析及蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建。質(zhì)譜技術(shù)作為蛋白質(zhì)組研究的三大支撐技術(shù)之一，除了用于多肽、蛋白質(zhì)的質(zhì)量測定外，還廣泛地應(yīng)用于肽指紋圖譜測定以及氨基酸序列惻定等。3、肽指紋圖譜

（PePtideMassFingerprinting,PMF）測定是對蛋白酶解或降解后所得多肽混合物進行質(zhì)譜分析的方法，對質(zhì)譜分析所得肽片與多肽蛋白數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的理論肽片進行比較，從而判別所測蛋白是已知還是未知。由于不同的蛋白質(zhì)具有不同的氨基酸序列，因而不同蛋白質(zhì)所得肽片具有指紋的特征。對肽序列的測定往往要通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)才能達到分析目的，它采用不同的質(zhì)譜技術(shù)選擇具有特定質(zhì)荷比的離子，并對其進行碰撞誘導(dǎo)解高，通過推斷肽片的斷裂，即可導(dǎo)出肽序列

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Ｂ、應(yīng)用于核酸常規(guī)的色譜或電泳技術(shù)只能對其濃度和純度進行分析，而對其堿基組成、序列等結(jié)構(gòu)信息卻無能為力。

ESI和MALDI質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)為寡核苷酸及其類似物的結(jié)構(gòu)和序列分析提供了強有力的方法，它是將被測寡核苷酸樣品先用外切酶從3’或5’端進行部分降解，在不同時間內(nèi)分別取樣進行質(zhì)譜分析，獲得寡核苷酸部分降解的分子離子峰信號，通過對相鄰兩個碎片分子質(zhì)量進行比較，可以計算出被切割的核苷酸單體分子質(zhì)量，將其與四個脫氧苷酸的標準分子量進行對照，就可以讀出寡核苷酸的序列。由于MALDI技術(shù)分辨率的問題，使得其更適合于減基數(shù)較少的短鏈核酸的分析。Ｃ、質(zhì)譜與臨床醫(yī)學

除了應(yīng)用于蛋白質(zhì)和核酸研究以外，質(zhì)譜還以其靈敏度和高分辨率在臨床醫(yī)學檢直中得到了廣泛的應(yīng)用，如對藥物代謝產(chǎn)物的動態(tài)分析，癌細胞蛋白質(zhì)的鑒定，同位素標記物的檢測等。其中用同位素14C標記的14C-尿素呼吸試驗和15N標記的15N-排泄試驗已成為臨床檢測胃幽門螺桿菌（HP）的有效手段。Ｄ、質(zhì)譜與檢測

隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，大量的生物工程產(chǎn)品不斷出現(xiàn)，傳統(tǒng)的測定分子量及純度的方法已不能擔當此重任，現(xiàn)在人們把MALDI-TOF-MS應(yīng)用于此領(lǐng)域，得到了很好的效果。蔡耘等用上述技術(shù)對重組的人表皮生長因子（hEGF）白細胞介素-3（IL－3）、腫瘤壞死因子（TNF）粒細胞＼巨噬細胞集落刺激因子（GM－CSF）、粒細胞集落刺激因子（G—CSF）堿性成纖維生長因子（bFGF）等六種基因工程產(chǎn)品進行了測定，獲得了準確的分子量信息及純度信息，這為基因工程產(chǎn)品的檢測研究開辟了一條新途徑。

第35頁/共47頁denovo

denovo”來源于拉丁文，意思是“創(chuàng)新

根據(jù)離子的二級質(zhì)譜和三級質(zhì)譜的譜圖，確定含有的氨基酸數(shù)量和種類，然后進行實際的譜圖和理論譜圖進行比對然后給出序列，通過這種方式不僅可以測序，還可以確定蛋白翻譯后修飾（PTM）分析。

denovo從頭測序是生物學家的名稱，化學家一般稱為LC-MS/MS測序

DENOVO是對于數(shù)據(jù)庫里面沒有蛋白或者相應(yīng)核酸序列,所以通過對于多肽碎片的分析,從而知道它的氨基酸序列.但是對于具有相同質(zhì)量數(shù)的LEU和ILE,對給序列分析帶來一些困難.

第36頁/共47頁泛素Ubiquitin：/molecule/ubiquitin/ubiquitin.asp泛素是一個由76個氨基酸組成的高度保守的多肽鏈,因其廣泛分布于各類細胞而得名。泛素共價地結(jié)合于底物蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基，被泛素標記的蛋白質(zhì)將被特異性地識別并迅速降解，泛素的這種標記作用是非底物特異性的，在蛋白質(zhì)降解過程中泛素的樞紐作用越來越得到研究者的重視。

共價結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶體識別和降解，這是細胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑，泛素相當于蛋白質(zhì)被摧毀的標簽。26S蛋白酶體是一個大型的蛋白酶，可將泛素化的蛋白質(zhì)分解成短肽。2004諾貝爾化學獎

第37頁/共47頁ELISA的原理

原理動畫動畫２

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。

第38頁/共47頁雙抗體夾心法（HBsAg、HBeAg等）示意圖固相載體抗體抗原酶抗體酶標記抗體1.將抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗原，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標記抗體，則結(jié)合為抗體-抗原-酶