靶向檢測技術第1頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三LungCancerinSolidTumorinChina第2頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三=？液態(tài)活檢通過外周血中的腫瘤細胞或者腫瘤基因組信息來評估腫瘤病理活檢通過原發(fā)灶腫瘤組織來評估腫瘤CTCctDNA

mircoRNALNCRNAOthers

傳統(tǒng)的組織細胞學檢測第3頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三液態(tài)活檢在肺癌中的應用治療策略事件肺癌待查輔助診斷早癌肺癌晚期肺癌癌癥耐藥復發(fā)監(jiān)測治療方案選擇療效評估耐藥機理新藥研發(fā)第4頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三治療策略事件疑似肺癌輔助診斷早癌肺癌晚期肺癌癌癥耐藥復發(fā)監(jiān)測治療方案選擇耐藥機理新藥研發(fā)CTC的臨床應用價值療效評估CTC(數(shù)量）(負向富集+靶向PCR）ctDNA(基因變異）第5頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三1、K.Pantel,etal.NatRevClinOncol,2009;2、K.PantelandMR.Speicher,Oncogene2015什么是循環(huán)腫瘤細胞（CirculatingTumorCell，CTC）？腫瘤釋放如外周血中CTCs數(shù)量的多少，可間接反應腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)CTC：在腫瘤發(fā)生過程中，具有干細胞特征的腫瘤細胞和不具有干細胞特征的腫瘤細胞，均由原發(fā)腫瘤脫落釋放入外周血，兩者統(tǒng)稱循環(huán)腫瘤細胞（CirculatingTumorCell）CTC1CTC≠有轉(zhuǎn)移：侵入第二器官CTCs，稱之為DTC（disseminatedTumorCell），只有由具有干細胞特征的DTC所形成的微轉(zhuǎn)移灶，逃避免疫識別才可能發(fā)展成為腫瘤遠處轉(zhuǎn)移2第6頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三第9周的乳腺管組織切片：乳腺管周圍非典型性增生第30周的腫瘤組織切片：新生的腫瘤上皮細胞形成牙槽并侵襲周圍基質(zhì)CK+cellsHER-2+cells什么時候可以檢測到CTC？早期腫瘤外周血中即可檢出CTC第7頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三WHe,etal.ProcNatlAcadSci,2007早期腫瘤外周血中即可檢出CTC表達中等量FR的M109鼠肺癌細胞通過皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部側(cè)面移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分鐘可以檢測到大約1.4個CTC細胞移植后第3和第4周，則每分鐘可分別檢測7個和18個CTC，隨著腫瘤逐漸增大數(shù)量呈指數(shù)上升在腫瘤移植的前4周內(nèi)，沒有在任何組織切片中發(fā)現(xiàn)到存在轉(zhuǎn)移性癌癥的跡象第8頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三CTC富集技術密度與大小免疫磁珠（負向富集or陽性富集)微流體CTC

檢測方法CTC檢測技術靶向PCR免疫熒光普通PCR=+第9頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三“方法”“收獲”“垃圾”蟹餌沒水了，我們躲不了了放水負向富集優(yōu)勢：回收率100%劣勢：純度略低正向富集優(yōu)勢：純度高劣勢：回收率低（漏掉CTC）幸好沒貪嘴，我們逃了第10頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三“方法”“收獲”“垃圾”沒水了，我們躲不了了放水負向富集優(yōu)勢：回收率100%劣勢：純度略低大小富集（ISET）優(yōu)勢：簡單劣勢：漏掉小的CTC細胞幸好沒吃胖，我們逃了網(wǎng)篩第11頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三CTC檢測技術檢測原理負向富集靶向PCRFR陽性靶標肺癌細胞FR(葉酸受體）高度表達CTC：FR=1:50萬EMT轉(zhuǎn)化不影響FR豐度其他血細胞不表達FRCTC回收率接近100%磁珠富集易操作和自動化靈敏度超高，負向富集可滿足檢測要求信號二次放大，1個CTC信號放大10^12倍無需人工經(jīng)驗判讀，結(jié)果客觀準確可實現(xiàn)CTC的定量第12頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三CTC檢測

靶向PCR，信號放大，保證高度敏感性

1個CTC信號放大1012倍第13頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三CTC檢測優(yōu)勢一：陰性富集不丟失循環(huán)腫瘤細胞優(yōu)勢二：靶向探針特異性高優(yōu)勢三：PCR擴增信號，確保高敏感性優(yōu)勢四：PCR儀判斷CTC技術，避免人為誤差第14頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三3mL血1mL/3mL血3mL血1個CTC/3mL血50萬FR/1個CTC1個CTC/1slide100萬信號/1個FR1個信號/1個CTCFR靶向PCR——1個CTC細胞信號方法10^12倍（萬億倍）細胞免疫熒光——1個CTC細胞信號幾乎沒有放大第15頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三CellSearch:正向富集+免疫熒光技術進行捕獲和鑒定16EpCAM–上皮細胞粘附分子APC–異藻藍蛋白熒光染料CK–細胞角蛋白PE–藻紅蛋白熒光染料DAPI–4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA熒光染料）上皮細胞白細胞抗EpCAM磁流體EpCAM抗原CD45抗原CK抗原抗CD45-APC染料抗CK-PE染料熒光染料第16頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三EpCAM陰性細胞中，存在大量CTCCellResearch系統(tǒng)主要使用EpCAM（上皮粘附分子）做為探針

研究證實，EpCAM陰性的細胞中也存在CTCJiataoLou,etal.PlosOne2013第17頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三2004CellSearch:乳腺癌中檢測出，但肺癌敏感性低2011CellResearch:采用的抗體(EpCAM)對EMT細胞特異性差，而肺癌細胞轉(zhuǎn)移入血需要EMT的過程第18頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三第19頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三3mL血→6個小時→得到報告檢測流程第20頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三肺癌領域，CTC檢測技術對比CytoploRare?（格諾）CellSearch?CyttelTM（北京萊爾）CanpatrolTM（益善）CTC-Biopsy?（武漢友之友)核心技術免疫磁珠負向富集靶向配體PCR技術

流式正向富集技術熒光標記免疫磁珠負向富集、Fish技術ISET（濾膜）原位雜交RNA分析ISET（濾膜)熒光標記特異性88%80%83%75%70%靈敏度80%30%腺癌：46%30%30%自動化半自動全自動半自動半自動全自動血樣體積3mL7.5mL4mL5mL10mL適應癥早、中和晚期肺癌晚期乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌晚期肺癌、胰腺癌、乳腺癌晚期癌腫晚期癌腫早期（I期）敏感性67%0%20%(2/10)未報道未報道中晚期敏感性89%25%（22/87)61%-88%30%40%報告時間6h/12樣本6h/8樣本48h/1樣本48h/1樣本3天可視化否是是是是第21頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三不同CTC計數(shù)對于肺癌診斷的特異性與敏感性CTC計數(shù)診斷肺癌敏感性診斷肺癌特異性2.099.5%2.3%4.096.1%21.3%6.089.5%44.8%8.778.0%83.6%10.068.1%90.3%12.054.1%95.2%14.040.1%97.6%16.027.6%98.1%18.020.5%98.6%20.016.2%99.5%第22頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三CTC對肺癌的診斷顯著優(yōu)于一般腫瘤標志物輔助診斷指標AUC值P值CTC0.91P<0.0001CEA0.56NSE0.61CYFRA21-10.71SCCA0.49CTC與一般腫瘤標志物對肺癌診斷的準確性（AUC值）第23頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三單項CTC檢測的輔助診斷價值優(yōu)于多個一般腫瘤標志物聯(lián)合AUC=0.91,P<0.0001AUC=0.76第24頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三不同病理類型中，CTC輔助診斷價值均優(yōu)于一般腫瘤標志物第25頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三CTC肺癌輔助診斷小結(jié)CTC反應肺癌發(fā)生發(fā)展功能狀態(tài)，肺癌輔助診斷價值顯著優(yōu)于一般腫瘤標志物靶向PCRCTC技術：所有肺癌敏感性提高3倍，I期肺癌提高10倍第26頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三CTC：用于化療療效評估，先于腫瘤大小發(fā)生變化，評估腫瘤功能狀態(tài)NSCLC,1st-linecarboplatin,paclitaxel(d);NSCLC,2nd-linepemetrexed(e)BaselineCTscanswerebeforetherapyinitiationandCTCmeasurementsbeganatorshortlyafterthefirsttreatment.第27頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三CTC數(shù)量變化與RECIST標準基本一致第28頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三FR靶向PCRCTC檢測

與肺腺癌患者一線培美曲塞化療療效相關培美曲塞是一種抗葉酸制劑，通過破壞細胞內(nèi)葉酸依賴性的正常代謝過程，抑制細胞復制，從而抑制腫瘤的生長FR靶向PCRCTC檢測技術特異性檢測循環(huán)腫瘤細胞表面